王繼霞， 張 顏， 葉明德*， 陳 帆

(溫州大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，浙江溫州 325035)

海產(chǎn)品是人類攝取蛋白質(zhì)的主要來源，也是攝入砷的主要途徑之一。砷通過食物鏈可在人體內(nèi)累積，對人的心肌、呼吸、生殖、造血、免疫系統(tǒng)產(chǎn)生不同程度的損害作用[1 - 2]。研究表明，自然界中有6種常見的砷形態(tài)[3 - 4]，即一甲基砷酸(MMA)、二甲基砷酸(DMA)、亞砷酸鹽(As(Ⅲ))、砷酸鹽(As(V))、砷甜菜堿(AsB)和砷膽堿(AsC)，其毒性不僅與元素總量有關(guān)，而且與其化學(xué)形態(tài)有密切的關(guān)系。無機砷的毒性遠遠大于有機砷的毒性，砷化合物的毒性順序為：As(Ⅲ)>As(Ⅴ)>MMA>DMA>AsC>AsB，而砷膽堿(AsC)和砷甜菜堿(AsB)被認為是無毒的[5 - 6]。

砷形態(tài)分析過程中，關(guān)鍵的是提取方法的選擇[7]。酶提取法是近年來在砷形態(tài)分析研究中使用最廣泛的提取方法，常用的蛋白酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K等[8 - 9]。酶提取法能保持樣品中砷的初始形態(tài)，不會產(chǎn)生其他雜質(zhì)污染。但酶提取法一般耗時較長，而超聲和微波輔助酶提取能在很大程度上縮短提取時間[10 - 11]。本文采用超聲輔助胃蛋白酶水解法有效提取貝殼類海產(chǎn)品中的砷化合物，并采用高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法(HPLC-HG -AFS)分析其中的砷形態(tài)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

SA-10型原子熒光形態(tài)分析儀(北京吉天儀器有限公司)；KQ-500DE型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；FD-1C-80型冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)；Hamilton PRP-X100陰離子交換柱(250×4.1 mm i.d.,10 μm)(Agilent儀器有限公司)；超低溫冰箱(青島Hair特種儀器有限公司)；超純水處理系統(tǒng)。

白蛤、淡菜、溪螺、河蜆、花甲螺、蠑螺、蟶子、血蚶、錐螺、花甲、香螺、海螺12種貝殼類海產(chǎn)品，均采購于浙江省溫州市農(nóng)貿(mào)市場。

圖1 5種砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)的色譜譜圖Fig.1 Chromatograms of arsenic species of five mixed standard

1.2 樣品的前處理

稱取0.2500 g樣品于試管中，加入7.5 mL胃蛋白酶液(稱取100 mg胃蛋白酶，溶解于7.5 mL超純水中，用0.1 mmol/L HCl調(diào)節(jié)pH至4.5)，在35 ℃的條件下超聲5 min，提取液在6 000 r/min的條件下離心20 min，取其上清液，用超純水稀釋至10 mL備用。所有溶液測定前經(jīng)0.45 μm的水相膜過濾[12 - 13]。

1.3 HPLC-HG -AFS的參數(shù)

砷形態(tài)分析時HPLC-HG -AFS的實驗參數(shù)如表1所示，在該條件下得到各砷形態(tài)的色譜分離圖如圖1所示。

表1 砷形態(tài)分析HPLC-HG -AFS的實驗參數(shù)Table 1 The parameters for arsenic speciation by HPLC-HG -AFS

圖2 超聲輔助胃蛋白酶提取貝殼類海產(chǎn)品中砷形態(tài)條件的優(yōu)化 Fig.2 The optimized conditions of ultrasound-assisted pepsin extraction of arsenic species in shell a:pH;b:The mass of pepsin;c:Time;d:Temperature.

2 結(jié)果與討論

2.1 胃蛋白酶提取條件的優(yōu)化

采用超聲輔助胃蛋白酶水解法提取貝殼類海產(chǎn)品中的砷化合物。由于溫度、時間、pH值、酶的質(zhì)量的變化對提取砷化合物產(chǎn)生不同的影響，實驗分別研究了不同溫度、時間、pH值及酶的質(zhì)量對超聲輔助胃蛋白酶水解提取砷化合物的影響，如圖2所示。結(jié)果表明，溫度為35 ℃，時間為5 min，酶質(zhì)量為100 mg，pH為4.5時，胃蛋白酶水解提取砷形態(tài)的效果最佳。

2.2 分析性能

配制濃度為20、80、160、240 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。以質(zhì)量濃度(x,μg/L)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo)作圖，得各形態(tài)砷在10～300 μg/L的范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，相關(guān)系數(shù)在0.9992～0.9999范圍內(nèi)。As(Ⅲ)、DMA、MMA、AsB和As(Ⅴ)的檢出限分別為3.51、3.30、3.34、2.36、1.47 μg/L。取80 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)液重復(fù)進樣6次，得As(Ⅲ)、DMA、MMA、AsB和As(Ⅴ)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為2.11%、1.84%、1.04%、2.20%、1.57%。

2.3 貝殼類樣品的測定

選擇溫州的12種貝殼類海產(chǎn)品，按照樣品的前處理方法對樣品進行處理，采用HPLC-HG -AFS對樣品進行砷形態(tài)分析。結(jié)果如表2所示，表明貝殼類海產(chǎn)品中的砷主要以有機砷的形態(tài)存在，也以微量的無機砷的形態(tài)存在。

表2 貝殼類樣品中砷形態(tài)的測定Table 2 The determination results of arsenic species in shell samples

ND:Not detected.

2.4 樣品回收率試驗

為驗證方法的可靠性，采用河峴樣品進行加標(biāo)回收率試驗。根據(jù)河峴中砷形態(tài)的實際值，對As(Ⅲ)、DMA、MMA、AsB、As(Ⅴ)5種砷形態(tài)進行加標(biāo)回收試驗，6次重復(fù)測定。結(jié)果如表3所示，As(Ⅲ)、DMA、MMA、AsB、As(Ⅴ)的平均加標(biāo)回收率為89.6%～107.1%，表明該方法可行。

表3 河峴樣品的平均回收率和RSD(n=6)Table 3 Recovery and RSD of five arsenic species in Asian Clam(n=6)

3 結(jié)論

本實驗采用超聲輔助胃蛋白酶水解法進行海產(chǎn)品中的砷形態(tài)進行提取，快速環(huán)保、且不引入其它雜質(zhì)干擾；基于此，建立了HPLC-HG -AFS聯(lián)用技術(shù)測定貝殼類海產(chǎn)品中As(Ⅲ)、DMA、MMA、AsB和As(Ⅴ) 5種砷形態(tài)的分析方法。結(jié)果表明，該方法簡便、快捷，精密度好，滿足貝殼類海產(chǎn)中砷形態(tài)分析的需求。為貝殼類海產(chǎn)品中砷的形態(tài)分析提供了一種可行的分析方法，并為國家食品安全衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的完善提供了依據(jù)。

參考文獻：

[1] Pereira éderson R,DeAlmeida Tarcísio S,Borges Daniel L G,et al.Talanta,2016,150:142.

[2] Kucuksezgin Filiz,Tolga Gonul Lutfi,Tasel Didem.Chemosphere,2014,112:311.

[3] Zmozinski Ariane V,Toni Llorente -Mirandes,Damin Isabel C F,et al.Talanta,2015,134:224.

[4] LU Y N，CHEN J W，ZHANG L T,et al.Journal of Analytical Science(陸奕娜,陳建偉,張林田，等.分析科學(xué)學(xué)報),2016,32(1):141.

[5] Grinham Alistair,Kvennefors Charlotte,Fisher Paul L,et al.Marine Pollution Bulletin,2014,88:354.

[7] Whaley-Martin K J,Koch I,Reimer K J.Talanta,2012,88:187.

[8] Sadee Bashdar A,Foulkes Mike E,Hill Steve J.Food Additives & Contaminants:Part A,2016,33(3):433.

[9] Qing Qingliu,Han yongpeng,Xiu fenlu,et al.Analytica Chimica Acta,2015,888:1.

[10] Delgado-Povedano M M,Luque de Castro M D.Analytica Chimica Acta,2015,889:1.

[11] Romarís-Hortas Vanessa,Bermejo-Barrera Pilar,Moreda-Pineiro Antonio.Journal of Chromatography A,2013,1309:33.

[12] Moreda-Pineiroa Antonio,Moreda-Pineiro Jorge,Herbello-Hermelo Paloma,et al.Journal of Chromatography A,2011,1218:6970.

[13] Hinojosa Reyes Laura,Guzmán Mar Jorge L,Mizanur Rahman G M,et al.Talanta,2009,78,983.