王 博， 張浩然， 陸 淳， 華賢輝， 曹 瑩，晏紹慶， 徐 斐， 商 軍*， 袁 敏*

(1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.上海市獸藥飼料檢測所，上海 201103)

砷作為類環(huán)境金屬元素，廣泛存在于自然界。砷的有益性與毒性并存，研究表明[1]在允許濃度范圍內(nèi)，As2O3可抑制腫瘤細(xì)胞的生長，且低劑量的砷也會有健康效應(yīng)。另外，大量研究表明[2 - 3]，無機(jī)態(tài)的亞砷酸鹽(As(Ⅲ))和砷酸鹽(As(Ⅴ))毒性較高，而在飼料中添加苯胂酸類有機(jī)胂制劑氨苯胂酸(p-ASA)和洛克沙胂(ROX)具有刺激動物生長、改善畜禽肉質(zhì)等功效。但有機(jī)胂在飼料加工、儲存和運輸過程中可能降解為其他砷化合物，對人體和動物產(chǎn)生毒害作用。中國獸藥典委員會在近期發(fā)布了“關(guān)于建議停止p-ASA等3種藥物飼料添加劑在食品動物上使用”的公示。目前國內(nèi)外對飼料中有關(guān)砷形態(tài)的研究較少，對砷形態(tài)的研究大多聚焦于海產(chǎn)品[4 - 5]、大米[6 - 7]等領(lǐng)域。為此，有必要建立一種測定飼料中砷形態(tài)的分析方法。

電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)技術(shù)是20世紀(jì)80年代迅速發(fā)展起來的一種分析測試技術(shù)，其主要應(yīng)用于各種不同中藥材中重金屬及有害元素的測定[8 - 10]、食物樣品中痕量重金屬含量的測定[11 - 13]和水體中重金屬含量的測定中[14 - 15]。目前高效液相色譜(HPLC)和電感耦合等離子體-串聯(lián)質(zhì)譜(ICP-MS/MS)聯(lián)用技術(shù)已應(yīng)用到許多領(lǐng)域中[16]，與HPLC-ICP-MS相比，HPLC-ICP-MS/MS在原有的檢測基礎(chǔ)上添加了一個質(zhì)量過濾器，在檢測砷形態(tài)方面能有效消除ArCl干擾，這使得其在檢測砷形態(tài)方面具有更好的選擇性。本文旨在建立HPLC-ICP-MS/MS法測定飼料中As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、p-ASA和ROX 4種砷形態(tài)的方法，為飼料中砷形態(tài)檢測提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1260 Infinity高效液相色譜儀(美國，安捷倫股份有限公司)；8800電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國，安捷倫股份有限公司)；PK121R低溫冷凍離心機(jī)(意大利，ALC公司)；SK5210HP超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；AL104電子天平(瑞士，梅特勒-托利多)。

無機(jī)砷標(biāo)準(zhǔn)品：As(Ⅲ):1.002 g/mL，As(Ⅴ):0.999 g/mL，均購于INORGANIC VENTURES公司。有機(jī)胂標(biāo)準(zhǔn)品：p-ASA:99%，ROX:99%，均購自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。各砷標(biāo)準(zhǔn)品使用前，用純水配成1 μg/mL儲備液,置于4 ℃條件下避光保存。甲醇(色譜純，德國默克公司)；三氟乙酸(TFA，美國天地有限公司)，四丁基氫氧化銨(TBAH，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。實驗用水由純水機(jī)(重慶摩爾處理設(shè)備有限公司)制備。

1.2 樣品前處理

取0.5 g飼料樣品，置于50 mL離心管中，加入提取劑甲醇(1∶1)10 mL，超聲1 h，冷卻至室溫，離心(9 000 r/min) 5 min，取上清液，殘渣按上述步驟重復(fù)操作兩次。將上清液合并后，用水稀釋至50 mL，濾膜過濾后，上機(jī)測定。

1.3 儀器條件

HPLC條件：色譜柱：Shiseido MGⅡ C18柱(250×4.6 mm，5 μm)；柱溫：室溫；流速：1.2 mL/min；進(jìn)樣量：50 μL。流動相組成：A為甲醇-TBAH(6 mmol/L,pH=4.7),體積比為8∶92;B為甲醇-TFA(0.05%,pH=1.9),體積比為8∶92;梯度洗脫程序：0～10 min,100%A→100%B;10～26 min,100%B→100%A。

ICP-MS/MS條件：高頻發(fā)射功率：1 600 W；載氣：高純氬氣，流速0.93 L/min，補(bǔ)償氣流速0.2 L/min；蠕動泵轉(zhuǎn)速：0.1 r/min；樣品提升速度：0.5 r/min；采樣深度：8 mm；采樣錐：孔徑1.0 mm，Pt錐；截取錐：孔徑 0.4 mm，Ni錐；分析方式：脈沖、模擬，檢測質(zhì)量數(shù)：m/z75(As)、m/z91(AsO)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜分離條件的選擇

圖1 4種砷形態(tài)檢測的色譜圖Fig.1 Chromatogram of 4 arsenic species

流動相的組成、濃度和pH對As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、p-ASA和ROX的分離和保留具有顯著影響，對于采用MGⅡC18色譜柱分離來說，pH對于各砷形態(tài)的分離影響最大。實驗最終采用0.05%TFA(pH=1.9)、6 mmol/L TBAH(pH=4.7)和甲醇作為流動相，采用梯度洗脫方式在30 min內(nèi)實現(xiàn)As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、p-ASA和ROX的良好分離，并且峰形對稱、尖銳，靈敏度高。4種砷形態(tài)色譜圖見圖1。

2.2 質(zhì)譜分析條件的優(yōu)化

聯(lián)機(jī)前將Agilent公司提供的調(diào)諧液(Ce、Co、Li、Mg、Tl和Y含量為1 g/L)稀釋至1 μg/L對ICP-MS/MS進(jìn)行調(diào)諧，以保證儀器的最佳狀態(tài)和穩(wěn)定性。砷的電離能較高，難以電離，采用高電離能1 600 W，保證各種砷形態(tài)的完全解離，同時調(diào)節(jié)采樣深度、載氣流速以及炬管位置，提高檢測靈敏度同時降低氧化物和雙電荷的比率，滿足氧形態(tài)產(chǎn)率為CeO/Ce<1.5%，雙電荷產(chǎn)率Ce2+/Ce+<2%。同時監(jiān)測質(zhì)量數(shù)75使其達(dá)最高靈敏度。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

對濃度分別為0、0.5、1、5、10、20、50 μg/L的4種砷形態(tài)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定。以各砷形態(tài)的質(zhì)量濃度(y)對峰面積(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各砷形態(tài)的線性范圍、線性回歸方程與相關(guān)系數(shù)見表1。配制估計檢出限3～5倍的4種砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)測定7次，求得其標(biāo)準(zhǔn)偏差。以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差所對應(yīng)的砷質(zhì)量濃度計算方法的檢出限，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，4種砷形態(tài)的線性回歸方程相關(guān)系數(shù)均在0.9999以上，檢出限在0.05～0.60 μg/L之間，可滿足飼料中砷形態(tài)的測定需要。

表1 4種砷形態(tài)的線性方程式及檢出限Table 1 The linear equations and detection limits of four arsenic species

2.4 前處理方法優(yōu)化

實驗選用了飼料原料、配合飼料、預(yù)混合飼料及濃縮飼料進(jìn)行試驗。由于飼料基質(zhì)成分非常復(fù)雜，檢測過程中基質(zhì)干擾較大，為此選擇了對樣品進(jìn)行稀釋處理來減低基質(zhì)干擾，并比較了不同提取溶液的提取效率。結(jié)果表明，As(Ⅲ)和As(Ⅴ)的提取回收率隨含水比例降低而降低，p-ASA和ROX提取回收率隨含水比例降低而提高。飼料原料在不同提取液的提取效率見表2。提取方式比較了振搖和超聲兩種提取方式，試驗表明兩種提取方式均具有很好的提取效果，超聲提取簡單方便，適用于大量樣品的前處理。最終選用甲醇-水(1∶1，V/V)作為提取液，超聲提取1 h，使As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、p-ASA和ROX的提取回收率均符合我國國家標(biāo)準(zhǔn)《飼料中獸藥及其他化學(xué)物檢測試驗規(guī)程》(GB/T 23182-2008)的要求。

表2 不同提取溶液的提取效率比較Table 2 Comparison of extraction efficiency of different extraction solutions

2.5 回收率與精密度

對采集的飼料樣品(飼料原料、配合飼料、預(yù)混合飼料及濃縮飼料)進(jìn)行加入回收實驗。選用空白飼料基質(zhì)，取As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、p-ASA和ROX混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行添加，每個添加水平取3個平行樣，按照前處理方法進(jìn)行提取和操作。實驗結(jié)果表明，測得平均回收率范圍為85.9%～104.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.2%～4.1%之間。飼料原料測試結(jié)果見表3。

表3 4種砷形態(tài)的添加回收率和精密度(n=6)Table 3 Spiked recoveries and precisions for four arsenic species (n=6)

2.6 樣品分析

利用建立的方法對采集的飼料樣品(飼料原料3批、配合飼料3批、預(yù)混合飼料3批及濃縮飼料3批)中的砷形態(tài)進(jìn)行測定，并采用《飼料中總砷的測定》(GB/T 13079-2006)測定總砷，結(jié)果見表4。實驗結(jié)果表明，除了配合料2和配合料3分別添加了有機(jī)胂制劑(p-ASA和ROX)外，其他飼料樣品中砷主要以As(Ⅲ) 和As(Ⅴ)形態(tài)存在，其中復(fù)合預(yù)混合飼料2總砷測定結(jié)果為68.6 mg/kg，不符合《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 13078-2001)中預(yù)混合飼料總砷規(guī)定的限量標(biāo)準(zhǔn)(≤10.0 mg/kg)。目前，p-ASA和ROX批準(zhǔn)作為藥物飼料添加劑可以使用，總砷減去飼料標(biāo)簽上標(biāo)示的添加有機(jī)胂制量，折算后進(jìn)行判斷。本分析中，配合飼料2和配合飼料3經(jīng)折算后符合《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 13078-2001)中配合飼料總砷規(guī)定的限量標(biāo)準(zhǔn)(≤2.0 mg/kg)，而日常檢測中，采用(GB/T 13079-2006)法測總砷后，再按飼料標(biāo)簽標(biāo)示的添加有機(jī)胂量折算后很難進(jìn)行判斷，采用本法就能有效的進(jìn)行判斷。

表4 飼料中砷形態(tài)分析結(jié)果Table 4 Analytical results of four arsenic species in feeds

ND:not detected.

3 結(jié)論

建立了飼料中As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、氨苯胂酸(p-ASA)和洛克沙胂(ROX)4種砷形態(tài)的分離與檢測方法，優(yōu)化了樣品前處理方法，保證了樣品前處理過程中各砷形態(tài)的穩(wěn)定。方法的檢出限和精密度均能滿足分析要求。該方法適用于飼料中常見的幾種砷形態(tài)的檢測，另隨著“建議停止氨苯胂酸(p-ASA)和洛克沙胂(ROX)作為藥物飼料添加劑在食品動物上使用”的公示發(fā)布后，該法也可提供重要的技術(shù)支持。

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