陳麗璇， 張 紅， 王小華， 段鋒祺， 周 兆， 劉革修△

(1廣州中醫(yī)藥大學(xué)， 廣東 廣州 510405； 2浙江省臺(tái)州醫(yī)院康復(fù)科， 3臨海市第一人民醫(yī)院普內(nèi)科， 浙江 臨海 317000； 4南方醫(yī)科大學(xué)， 廣東 廣州 510515； 5暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院血液研究所， 廣東 廣州 510632)

克拉屈濱(cladribine； 2-氯-2’-脫氧腺苷，2-chloro-2’-deoxyadenosine，2-CdA)是臨床上重要的抗腫瘤藥物，主要用于治療多發(fā)性硬化癥、多發(fā)性骨髓瘤、B細(xì)胞淋巴瘤和急性粒細(xì)胞性白血病等[1]。目前，由于克拉屈濱上市時(shí)間短，關(guān)于克拉屈濱的臨床應(yīng)用報(bào)道較少，藥物療效也有爭(zhēng)議?？死鼮I的抗腫瘤作用與脫氧胞苷激酶和脫氧核苷酸激酶活性有關(guān)，其主要以被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的方式運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)，被脫氧胞苷激酶磷酸化，轉(zhuǎn)化為克拉屈濱三磷酸，摻合到DNA分子中，阻礙DNA的修復(fù)，影響DNA的合成[2]。在本研究中，我們觀察克拉屈濱對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926的作用，探究克拉屈濱在血管生成和調(diào)控腫瘤微環(huán)境的作用基礎(chǔ)上發(fā)揮的抗腫瘤效應(yīng)，進(jìn)一步討論其治療其它實(shí)體瘤的可能性，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

克拉屈濱為廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院血液科惠贈(zèng)；DMEM/high glucose培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco；胎牛血清、0.25%胰酶、青霉素和鏈霉素購(gòu)于Sigma-Aldrich；CCK-8試劑盒購(gòu)于日本同仁公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Annexin V-FITC/PI 雙染)和細(xì)胞周期試劑盒(PI單染)購(gòu)于Sigma-Aldrich；兔抗人caspase-3、Bax、p21和p53抗體購(gòu)于CST；RIPA細(xì)胞裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)于Thermo；TNF-α、TGF-β1和VEGF酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購(gòu)于武漢華美；NO檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板和25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶購(gòu)于Beaver。

2 細(xì)胞

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株EA.hy926購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)研究所北京細(xì)胞庫(kù)。用DMEM/high glucose培養(yǎng)液(含10%胎牛血清和1%雙抗)培養(yǎng)EA.hy926細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每 24～48 h 傳代 1 次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3 主要方法

3.1細(xì)胞活力抑制實(shí)驗(yàn) 制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，取8×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，每孔5×103個(gè)。分為4個(gè)組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔；各組對(duì)應(yīng)加入克拉屈濱，使孔中終濃度分別為0、0.4、0.8和1 μmol/L。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，吸棄舊的培養(yǎng)液，每孔加入100 μL新鮮培養(yǎng)液和8 μL CCK-8試劑，混勻后繼續(xù)孵育3 h。在酶標(biāo)儀上測(cè)定 450 nm 波長(zhǎng)處的各孔吸光度(A)值。按照同樣的方法，分別檢測(cè)各組細(xì)胞經(jīng)克拉屈濱作用24 h和72 h的細(xì)胞活力情況。根據(jù)該部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果及對(duì)照組細(xì)胞在48 h時(shí)融合率達(dá)70%～80%，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用48 h的作用時(shí)間。

3.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布 將細(xì)胞接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，分為4組。取克拉屈濱加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，使培養(yǎng)瓶中藥物終濃度分別為0、0.4、0.8和1 μmol/L?？死鼮I作用48 h后，消化離心收集細(xì)胞，以PBS清洗細(xì)胞1遍，每組細(xì)胞沉淀加入500 μL 70%冷乙醇4 ℃固定過夜。次日離心收集細(xì)胞并用PBS洗1遍，用200 μL RNase酶重懸細(xì)胞，置于37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min。隨后加入PI 100 μL，輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)30 min；然后上機(jī)檢測(cè)。

3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，分為4組。取克拉屈濱加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，使培養(yǎng)瓶中藥物終濃度分別為0、0.4、0.8和1 μmol/L。克拉屈濱作用內(nèi)皮細(xì)胞48 h后，按照Annexin-V FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡試劑盒說明進(jìn)行操作。簡(jiǎn)述如下：消化并離心收集細(xì)胞，以PBS清洗細(xì)胞1遍，細(xì)胞沉淀加入200 μL結(jié)合緩沖液，混勻后加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI，混勻后室溫下避光反應(yīng)15 min；最后上機(jī)檢測(cè)。

3.4Western blot 檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)水平 收集不同濃度克拉屈濱處理48 h后的細(xì)胞，按照蛋白抽提試劑盒上的說明提取細(xì)胞總蛋白； BCA法測(cè)定蛋白濃度后，取40 μg變性后蛋白樣品上樣、12% SDS-PAGE，待溴酚藍(lán)達(dá)到凝膠底部時(shí)，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；5%脫脂奶粉液室溫封閉1 h后，TBST洗3次，每次5 min，I 抗4 ℃ 孵育過夜；TBST洗3次，每次5 min，II 抗中室溫?fù)u床孵育1 h ，TBST洗3次，每次5 min，ECL發(fā)光，凝膠成像儀中顯影，采用Gel-Pro Analyzer 6.0進(jìn)行蛋白條帶灰度分析。

3.5ELISA檢測(cè)上清液中TNF-α、TGF-β1和VEGF的含量 收集不同濃度克拉屈濱處理48 h后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液。按照ELISA試劑盒上的說明，檢測(cè)上清液中TNF-α、TGF-β1和VEGF的水平。

3.6Gries法檢測(cè)上清液中NO的含量 收集1 μmol/L克拉屈濱處理48 h后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液。按照試劑盒上的說明，檢測(cè)上清液NO含量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用Stata 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，GraphPad Prism 7.00 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)繪圖。本研究的所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù) 3 次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間的比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析；組間兩兩比較采用Bonferroni 法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 克拉屈濱對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926活力的抑制作用

克拉屈濱作用48 h后，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞活力下降，呈現(xiàn)良好量效關(guān)系，除了0.4 μmol/L組外，其余組與對(duì)照組相比有明顯抑制作用(P<0.05)，IC50約為3.644 μmol/L。此外，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞活力降低；除24 h組外，其余組與對(duì)照組相比均有顯著的抑制作用(P<0.05)，見圖1。這提示克拉屈濱對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用。

2 不同濃度克拉屈濱對(duì)EA.hy926細(xì)胞周期的影響

克拉屈濱作用48 h后，與對(duì)照組相比，隨著藥物濃度增加，G0/G1期的細(xì)胞顯著減少(P<0.05)，S期的細(xì)胞顯著增加(P<0.05)，G2期的細(xì)胞變化不明顯。這提示克拉屈濱能將內(nèi)皮細(xì)胞周期阻滯在S期，見圖2、表1。

3 不同濃度克拉屈濱對(duì)EA.hy926細(xì)胞凋亡率的影響

Figure 1. Cladribine (2-CdA) inhibited the viability of the EA.hy926 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs0.4 μmol/L 2-CdA group;▲P<0.05vs0.8 μmol/L 2-CdA group.

圖1克拉屈濱對(duì)EA.hy926細(xì)胞活力的影響

Figure 2. Cladribine ( 2-CdA) induced cell cycle arrest of the EA.hy926 cells.

圖2克拉屈濱作用于EA.hy926細(xì)胞對(duì)細(xì)胞周期的影響

克拉屈濱作用48 h后，與對(duì)照組相比，各組細(xì)胞凋亡率的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見表1。這提示0.4～1 μmol/L濃度范圍的克拉屈濱作用48 h并不誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

表1不同濃度克拉屈濱對(duì)EA.hy926細(xì)胞細(xì)胞周期和凋亡的影響

Table 1. The effects of cladribine ( 2-CdA) at different concentrations on the cell cycle distribution and apoptosis of the EA.hy926 cells for 48 h (%. Mean±SD.n=3)

GroupG0/G1SG2ApoptoticrateControl66．68±1．4516．19±0．2316．51±1．261．11±0．830．4μmol/L2?CdA47．10±1．34?43．74±0．34?8．86±0．52?3．29±2．560．8μmol/L2?CdA36．49±0．94?#56．57±1．01?#7．61±0．56?3．87±2．201μmol/L2?CdA13．24±0．50?#▲77．23±1．17?#▲7．81±0．40?3．85±3．00

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs0.4 μmol/L 2-CdA group;▲P<0.05vs0.8 μmol/L 2-CdA group.

4 不同濃度克拉屈濱對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926蛋白表達(dá)水平的影響

克拉屈濱作用48 h后，caspase-3和Bax表達(dá)水平無明顯差異；p21表達(dá)水平隨著濃度增加而減少，p53蛋白表達(dá)水平隨著藥物濃度增加而增加；與對(duì)照組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見圖3。這些結(jié)果提示克拉屈濱抑制p21蛋白的表達(dá)，促進(jìn)p53蛋白的表達(dá)；對(duì)caspase-3和Bax的表達(dá)無顯著影響。

Figure 3. The expression of caspase-3, Bax, p21 and p53 in the EA.hy926 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3克拉屈濱對(duì)EA.hy926細(xì)胞caspase-3、Bax、p21和p53蛋白表達(dá)的影響

5 不同濃度克拉屈濱對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926分泌TNF-α、TGF-β1和VEGF水平的影響

克拉屈濱作用48 h 后，上清液中TNF-α含量隨藥物濃度的升高而逐漸增加，且各組TNF-α的含量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；上清液中TGF-β1的含量隨著濃度升高而逐漸增加，除了0.4 μmol/L組，其它各組與對(duì)照組相比，TGF-β1的含量均顯著增加(P<0.05)；此外，與對(duì)照組相比，克拉屈濱(1 μmol/L)作用48 h，上清液中VEGF含量明顯減少(P<0.05)，見圖4。這些結(jié)果提示克拉屈濱能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌TNF-α和TGF-β1，但抑制其分泌VEGF。

Figure 4. The effect of different concentrations of cladribine (2-CdA) on the production of TNF-α, TGF-β1 and VEGF in the EA.hy926 cells for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vs0.4 μmol/L 2-CdA group;▲P<0.05vs0.8 μmol/L 2-CdA group.

圖4克拉屈濱對(duì)EA.hy926細(xì)胞TNF-α、TGF-β1和VEGF水平的影響

6 不同濃度克拉屈濱對(duì)細(xì)胞EA.hy926培養(yǎng)上清NO水平的影響

與對(duì)照組相比，克拉屈濱(1 μmol/L)作用內(nèi)皮細(xì)胞48 h后，上清液中NO含量明顯減少(P<0.05)。這提示克拉屈濱可抑制NO的生成，見圖5。

討 論

血管內(nèi)皮細(xì)胞是抗腫瘤血管生成的重要靶細(xì)胞，是腫瘤血管的基礎(chǔ)單位。因此抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，可以發(fā)揮抗腫瘤血管生成的作用[3-4]。本研究探討克拉屈濱對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活力的抑制作用和對(duì)細(xì)胞分泌活性的影響，進(jìn)而探究其治療實(shí)體瘤的可能性。

Figure 5. The effect of cladribine (2-CdA) on NO production in the EA.hy926 cells for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖5克拉屈濱對(duì)EA.hy926細(xì)胞NO水平的影響

克拉屈濱抑制內(nèi)皮細(xì)胞的活力。本研究通過CCK-8法檢測(cè)不同濃度克拉屈濱作用于內(nèi)皮細(xì)胞后的細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)，克拉屈濱對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞活力抑制率顯著增高。

克拉屈濱對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡沒有顯著的影響。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，各組細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)結(jié)果，caspase-3、Bax各組無明顯差異。Caspase-3是caspase家族蛋白酶的重要部分，是凋亡途徑的關(guān)鍵因子。細(xì)胞線粒體膜電位的下降，使細(xì)胞色素C釋放，啟動(dòng)caspase介導(dǎo)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[5]。Bax過度表達(dá)可拮抗Bcl的保護(hù)效應(yīng)而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。這些結(jié)果說明克拉屈濱并不是通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡而發(fā)揮其抗腫瘤作用。

克拉屈濱誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，顯示克拉屈濱作用后，G1期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞增多，G2期無明顯變化。為了深入了解克拉屈濱對(duì)細(xì)胞周期的作用，本研究檢測(cè)了相關(guān)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示p21蛋白表達(dá)減少，p53蛋白表達(dá)增加。p21是細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子，是細(xì)胞周期G1期檢查站[7]。通過p21與p53的檢查，減少損傷的DNA的合成。p21表達(dá)減少，使其對(duì)G1期的檢查作用減弱，更多的細(xì)胞進(jìn)入S期，細(xì)胞周期阻滯在S期。p53位于p21的上游，其主要功能是抑制p21、cyclin、CDK和PCNA四聚體的功能，此四聚體能活化細(xì)胞增殖信號(hào)。p53表達(dá)增強(qiáng)，四聚體功能被抑制，細(xì)胞增殖信號(hào)未能活化[7]。p53蛋白表達(dá)水平隨著藥物濃度增加而增加，這與CCK-8檢測(cè)結(jié)果一致。克拉屈濱被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)化為克拉屈濱三磷酸，摻合到DNA分子中，阻礙DNA的修復(fù)，影響DNA的合成，進(jìn)而細(xì)胞阻滯于S期，不能進(jìn)入G2/M期。這些結(jié)果說明克拉屈濱可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。

克拉屈濱促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌TNF-α和TGF-β1。ELISA結(jié)果顯示上清液TNF-α和TGF-β1水平增高。血管內(nèi)皮細(xì)胞是TNF-α作用的靶細(xì)胞之一，TNF-α誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞外鈣內(nèi)流，血管內(nèi)皮細(xì)胞滲透性增加，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷或?qū)е卵芄δ芪蓙y，使血管損傷和血栓形成，造成腫瘤組織的局部血流阻斷而發(fā)生出血、缺氧壞死，是重要的腫瘤壞死因子[8-9]。且TNF-α能抑制內(nèi)皮細(xì)胞增長(zhǎng)，使細(xì)胞分裂緩慢。TGF-β1能夠抑制多種細(xì)胞增殖。克拉屈濱作用內(nèi)皮細(xì)胞后，TGF-β1分泌增加，通過自分泌的方式作用于自身可導(dǎo)致細(xì)胞增殖減慢。TGF-β1對(duì)腫瘤有促進(jìn)和抑制雙重作用，其抑制腫瘤的能力與TGF-β1信號(hào)促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相關(guān)[10-11]。這些結(jié)果說明克拉屈濱可通過促進(jìn)TNF-α的分泌，發(fā)揮抗腫瘤作用。

克拉屈濱抑制內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF。ELISA結(jié)果顯示VEGF分泌減少。VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性有絲裂原，是重要的血管生成因子，促進(jìn)血管新生和腫瘤細(xì)胞增殖[12]。VEGF能夠誘導(dǎo)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡和增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的耐受性[13]。有研究發(fā)現(xiàn)p53與VEGF之間有明顯相關(guān)性，p53參與下調(diào)VEGF mRNA水平和啟動(dòng)子的活性[14-15]。VEGF含量減少與本研究中p53蛋白表達(dá)增加相一致。這些結(jié)果提示克拉屈濱使內(nèi)皮細(xì)胞減少VEGF的分泌，在抑制VEGF促腫瘤血管新生的基礎(chǔ)上發(fā)揮抗腫瘤作用。

克拉屈濱抑制NO的分泌。通過Gries法檢測(cè)結(jié)果顯示NO含量減少。NO含量持續(xù)增多，引起不穩(wěn)定活性氧的生成，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，舒張血管[16-17]。NO在維持腫瘤血管擴(kuò)張狀態(tài)起重要作用。其舒張血管的機(jī)制與細(xì)胞中鳥苷酸環(huán)化酶的活性提高, 使細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷水平升高有關(guān)[18-19]。此外，許多研究發(fā)現(xiàn)NO有促進(jìn)腫瘤血管生成和促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的作用[20-21]。其促進(jìn)腫瘤血管生成的主要機(jī)制與其介導(dǎo)VEGF的信號(hào)傳遞有關(guān)。NO能誘導(dǎo)VEGF的合成，而VEGF能上調(diào)一氧化氮合酶的表達(dá)，增加NO 合成[22-24]。這說明克拉屈濱抑制NO的分泌，引起血管收縮和VEGF生成減少，血管生成受限，腫瘤血液供應(yīng)受抑制。

綜上所述，克拉屈濱促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌TNF-α、TGF-β1，減少VEGF與NO的生成，阻滯細(xì)胞周期，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。根據(jù)本研究結(jié)果，我們大膽地推測(cè)克拉屈濱有抗腫瘤血管生成和調(diào)控腫瘤微環(huán)境的作用。由于本研究主要涉及的是體外實(shí)驗(yàn)，至于其在體內(nèi)時(shí)對(duì)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響還需要進(jìn)一步的研究探索。

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