于洪濤，趙 麗，王 昊

（ 哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069）

腺病毒是全球家禽和野禽常見的傳染病原之一[1-3]。多數(shù)腺病毒可在健康禽體內(nèi)存在并復(fù)制，不表現(xiàn)臨床癥狀或臨床癥狀非常輕微，但可成為混合感染時(shí)的條件性病原；腺病毒有時(shí)也可作為原發(fā)性病原，引起禽類的多種病癥[4-6]。

腺病毒可分為A、B、C、D、E 5個(gè)種12個(gè)血清型，我國(guó)主要流行A、B、C 3種基因型，共6個(gè)血清型（火雞1型、1型、4型、5型、8a/b型），但是近期在豫南、皖北、蘇北、魯西北和膠東地區(qū)流行的禽腺病毒主要是血清4型和8a/b型，造成雞群的死亡率較高，并且發(fā)病急，有蔓延的趨勢(shì)。安卡拉?。ㄐ陌e水-肝炎綜合征）就是由Ⅰ群腺病毒，血清4型引起來的。該病多發(fā)于肉雞，近期也開始感染麻雞以及產(chǎn)蛋雞的育成雞，并且育成雞發(fā)病死亡率還非常高。

Ⅰ群禽腺病毒的12個(gè)血清型交叉保護(hù)性較差，因此在防控上必須選用與流行株匹配的疫苗株和卵黃抗體才能有效遏制疫情的蔓延。并目前市場(chǎng)上沒有商品化的疫苗或卵黃抗體，我公司通過自行分離的Ⅰ群4型禽腺病毒HY株，制備免疫原免疫蛋雞，制備了3批Ⅰ群4型禽腺病毒卵黃抗體實(shí)驗(yàn)室制品，并且經(jīng)過檢驗(yàn)，該3批制品有較好的安全性及效力，為公司下一步申報(bào)該產(chǎn)品的新獸藥注冊(cè)證書奠定基礎(chǔ)。

1 材料與設(shè)備

Ⅰ群4型禽腺病毒F5代生產(chǎn)種毒：批號(hào)為FAVHY-SS-01，病毒含量為107.22TCID50/0.1 mL，規(guī)格為2.0 mL·瓶-1。Ⅰ群4型禽腺病毒檢驗(yàn)用強(qiáng)毒：批號(hào)為FAV-HY-QS-03-1，病毒含量為107.22TC ID50/0.1 mL，規(guī)格為2.0 mL·瓶-1。Ⅰ群4型禽腺病毒瓊擴(kuò)抗原：批號(hào)為FAV-HY-K-01；效價(jià)≥1：2；規(guī)格為2.0 mL·瓶-1。Ⅰ群4型禽腺病毒陽性血清：批號(hào)為FAV-HY-Y-01；效價(jià)≥1：64；規(guī)格為2.0 mL·瓶-1。Ⅰ群4型禽腺病毒陰性血清：批號(hào)為HY-Y-01，規(guī)格為2.0 mL·瓶-1。均由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司制備、鑒定、保管和供應(yīng)。

雞肝癌細(xì)胞：21、42日齡SPF雞，由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

試驗(yàn)用產(chǎn)蛋雞：120日齡產(chǎn)蛋雞，由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，達(dá)到《生產(chǎn)用產(chǎn)蛋雞質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》要求。

超濾膜包：采用Biomax 50 ku，改良聚醚砜材料，0.5 m2膜面積，購自Millipore公司。

注射用白油：符合《中華人民共和國(guó)獸藥典》（2010年版）中獸用注射用白油標(biāo)準(zhǔn)要求。

試劑：醋酸鈉（AR）、冰醋酸（AR）、正辛酸（AR）、氨水、甲醛，均購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

儀器：離心機(jī)（RC12BP型，德國(guó)產(chǎn)）；超濾膜包：采用Biomax 100 ku，改良聚醚砜材料，0.5 m2膜面積，購自Millipore公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 卵黃抗體的制造及半成品檢驗(yàn)

高免蛋雞群應(yīng)符合下列標(biāo)準(zhǔn)：應(yīng)具有商品蛋雞的良好生產(chǎn)性能。無禽白血病、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病和雞傳染性貧血病，按0.5%抽樣，血清抗體結(jié)果應(yīng)全部為陰性。監(jiān)測(cè)雞白痢、雞毒支原體，二者陽性率≤0.1%。應(yīng)適時(shí)接種禽流感、雞新城疫、雞傳染性支氣管炎、雞傳染性法氏囊病、雞馬立克氏病、減蛋綜合癥（EDS76）及大腸桿菌病等疫苗，并做好球蟲病藥物預(yù)防。

2.2 Ⅰ群4型禽腺病毒滅活疫苗（HY株）免疫程序

基礎(chǔ)免疫：開產(chǎn)前2～3周健康產(chǎn)蛋雞，頸部皮下或肌肉注射Ⅰ群禽腺病毒滅活疫苗（4型，HY株）（簡(jiǎn)稱免疫原），1.0 mL·只-1。

加強(qiáng)免疫：在基礎(chǔ)免疫后21日進(jìn)行第2次接種，肌肉多點(diǎn)注射免疫原，1.0 mL·只-1。

強(qiáng)化免疫：在加強(qiáng)免疫后21日進(jìn)行第3次接種，肌肉多點(diǎn)注射免疫原，1.0 mL·只-1。

維持免疫：在強(qiáng)化免疫接種后，跟蹤測(cè)定抗體水平，抗體AGP效價(jià)＜1：64時(shí)，進(jìn)行加強(qiáng)免疫，1.0 mL·只-1。

高免蛋收集：產(chǎn)蛋雞強(qiáng)化免疫接種結(jié)束后第10天開始，每隔5 d抽樣測(cè)定卵黃中的抗體瓊擴(kuò)效價(jià)。當(dāng)效價(jià)≥1：64時(shí)，收集雞蛋，置2～8℃貯存，貯藏時(shí)間應(yīng)≤10 d。

2.3 Ⅰ群4型禽腺病毒卵黃抗體制備

蛋殼消毒：將雞蛋浸入1‰二氯異氰尿酸鈉水溶液中消毒15 min。卵黃分離采用手工或機(jī)械打蛋，打蛋時(shí)應(yīng)充分除去蛋清、胚盤和系帶，收集卵黃。酸化：量取卵黃體積，加入卵黃體積8倍的醋酸緩沖液（0.12 mol·L-1，pH 5.0）充分?jǐn)嚢?，使其呈均勻膏狀。調(diào)至pH 5.2，2～8℃靜置5～15 h。萃取吸取上清液，緩慢加入辛酸至終濃度為1.5%，2～8℃靜置6～20 h。取上清液過濾，濾液調(diào)至pH為7.2。過濾、濃縮：取萃取的卵黃液用孔徑為1和0.45 mm的筒式濾芯過濾澄清，再經(jīng)截留分子量為100 ku超濾膜包濃縮。滅活：加入終濃度為0.05%甲醛溶液，充分?jǐn)嚢杈鶆?，置室溫滅?4 h。效價(jià)測(cè)定：將滅活后的抗體進(jìn)行抗體效價(jià)測(cè)定，抗體瓊擴(kuò)效價(jià)應(yīng)≥1：4。稀釋：根據(jù)測(cè)定的抗體效價(jià)，將濃縮滅活后的卵黃抗體用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol·L-1，pH 7.2）適當(dāng)稀釋，再經(jīng)孔徑為0.22 mm濾膜過濾除菌。

2.4 半成品檢驗(yàn)

性狀為淡黃色澄明液體，久置后有少量白色沉淀。無菌檢驗(yàn)：按2010版《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)?？贵w效價(jià)測(cè)定：按規(guī)程附注1方法測(cè)定瓊擴(kuò)效價(jià)。分裝：定量分裝，加蓋密封，貼標(biāo)簽，置2～8℃保存。

2.5 卵黃抗體成品檢驗(yàn)

性狀：隨機(jī)抽樣肉眼觀察。裝量檢查：按2010版《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢查。無菌檢驗(yàn)：按2010版《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)。支原體檢驗(yàn)：按2010版《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)。外源病毒檢驗(yàn)：將腺病毒卵黃抗體2～3瓶混合，取20 mL倒入透析袋，放入400 g·L-1的PEG20 000中濃縮，濃縮后的液體用PBS（0.01 mol· L-1，pH 7.2）恢復(fù)至20 mL作為檢品。雞胚檢查法：經(jīng)尿囊腔接種檢品0.1～0.2 mL。經(jīng)絨毛尿囊膜接種檢品0.1～0.2 mL。細(xì)胞檢查法：取上述檢品1.8 mL加入0.2 mL 10倍工作濃度的M-199濃縮培養(yǎng)液，作為處理的檢品，每瓶雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）接種處理的檢品0.2 mL。禽淋巴白血病病毒ELISA檢測(cè)法：取上述檢品1.8 mL加入0.2 mL 10倍工作濃度的M-199濃縮培養(yǎng)液，作為處理的檢品，每瓶CEF接種處理的檢品0.5 mL。禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒熒光染色檢測(cè)法：取上述檢品1.8 mL加入0.2 mL 10倍工作濃度的M-199濃縮培養(yǎng)液，作為處理的檢品，每瓶CEF接種處理的檢品1 mL。按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行檢驗(yàn)。安全檢驗(yàn)：用21日齡SPF雞10只，每只頸部皮下分點(diǎn)注射本品2.0 mL，觀察14日，記錄雞的存活情況。抗體效價(jià)測(cè)定：測(cè)定瓊擴(kuò)抗體效價(jià)。

SPF雞攻毒檢驗(yàn)：取21日齡SPF雞30只，隨機(jī)分為3組，每組10只。第1組經(jīng)頸部皮下或肌肉注射本品，1.0 mL·只-1；第2組為攻毒對(duì)照組，經(jīng)頸部皮下或肌肉注射生理鹽水1.0 mL·只-1；第3組為健康對(duì)照組，不注射任何物品，3組隔離飼養(yǎng)。注射后24 h，第1、2組雞各肌肉注射I群4型禽腺病毒HY株病毒液（含106.0TCID50/0.1 mL），0.1 mL·只-1。連續(xù)觀察10日，記錄雞發(fā)病及死亡情況。

辛酸殘留量測(cè)定：按辛酸含量檢測(cè)方法（一次提取比色法）進(jìn)行測(cè)定。甲醛殘留量測(cè)定：按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行測(cè)定。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 半成品制備及檢驗(yàn)結(jié)果

表1 Ⅰ群4型禽腺病毒卵黃抗體半成品制備結(jié)果

表2 Ⅰ群4型禽腺病毒卵黃抗體半成品檢驗(yàn)結(jié)果

半成品制備及檢驗(yàn)結(jié)果見表1～2。

從表1～2結(jié)果可知，實(shí)驗(yàn)室試制的3批Ⅰ群4型禽腺病毒卵黃抗體半成品量分別為47 000、50 200和47 500 mL，經(jīng)檢驗(yàn)Ⅰ群4型禽腺病毒卵黃抗體瓊擴(kuò)效價(jià)均≥1：4；無細(xì)菌、霉菌污染，達(dá)到Ⅰ群4型禽腺病毒卵黃抗體半成品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。

3.2 卵黃抗體成品制備及檢驗(yàn)結(jié)果

將檢驗(yàn)合格的Ⅰ群4型禽腺病毒卵黃抗體半成品按100 mL·瓶-1無菌分裝，制成成品，并從中試產(chǎn)品抽樣按本產(chǎn)品《質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》檢驗(yàn)，結(jié)果見表3～11。

從表3～11結(jié)果可知，3批Ⅰ群4型禽腺病毒卵黃抗體均為淡黃色的澄明液體；3/3裝量均≥101 mL·瓶-1，符合現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄要求；抗體無細(xì)菌、霉菌、支原體及外源病毒污染，純凈；注射21日齡SPF雞，在觀察期內(nèi)，雞全部健活，精神狀態(tài)良好，行為、采食和飲水正常，無其他全身不良反應(yīng)；注射局部吸收良好，無紅腫和硬塊，安全。3批Ⅰ群4型禽腺病毒卵黃抗體瓊擴(kuò)效價(jià)均≥1：4；用動(dòng)物效檢中，3批抗體對(duì)雞攻毒保護(hù)率為100%，攻毒對(duì)照組發(fā)病率為90%，剖檢發(fā)病雞，均呈心包積水肝炎綜合征的典型病理變化；健康對(duì)照組均100%健活；甲醛殘留量為0.008 4%～0.008 6%，抗體樣品A440-蛋黃氯仿萃提液A440＜0.1%辛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液A440，符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)要求。

表3 3批實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品制備結(jié)果

表4 3批成品無菌檢驗(yàn)結(jié)果

表5 3批成品支原體檢驗(yàn)結(jié)果

表6 3批成品外源病毒（雞胚、細(xì)胞）檢驗(yàn)結(jié)果

表7 3批成品禽白血病病毒（ALV）檢驗(yàn)結(jié)果

表8 3批成品禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（REV）檢驗(yàn)結(jié)果

表9 3批成品雞安全檢驗(yàn)結(jié)果

表10 3批成品雞效力檢驗(yàn)結(jié)果

表11 3批成品甲醛和辛酸殘留量測(cè)定結(jié)果

4 結(jié)論

按照《I群4型禽腺病毒卵黃抗體制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程（草案）》制備了3批實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品，并按照本產(chǎn)品《質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)試制的3批卵黃抗體進(jìn)行了性狀、裝量、無菌、支原體、外源病毒、安全、效力、辛酸和甲醛殘留等檢驗(yàn)，結(jié)果均符合本產(chǎn)品《質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》要求。研究制定的卵黃抗體生產(chǎn)工藝適于卵黃抗體的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 韋悠,謝芝勛,范晴,等.Ⅰ群禽腺病毒雙價(jià)油乳劑滅活苗的研究[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2011,42（12）:1 550-1 554.

[2] 趙繼勛.Ⅰ群禽腺病毒感染的流行病學(xué)探究與防控認(rèn)識(shí)[J].北方牧業(yè),2017（6）:18.

[3] 楚電峰,劉相娥,薄智勇,等.Ⅰ群禽腺病毒的流行病學(xué)和防控研究現(xiàn)狀[J]. 中國(guó)動(dòng)物檢疫,2017,34（5）:86-89.

[4] 王亞楠,韓濤,李純玲,等.禽腺病毒Ⅰ群的研究現(xiàn)狀[J].中國(guó)動(dòng)物保健,2017,19（1）:61-64.

[5] 李曉林,王相芹,羅濟(jì)冠,等.Ⅰ群禽腺病毒的分離鑒定及其致病性研究[J]. 中國(guó)動(dòng)物檢疫,2016,33（8）:86-89.

[6] 李海英,尹燕博,徐守振,等.I群禽腺病毒12個(gè)血清型毒株Hexon蛋白全基因序列測(cè)定和酶切位點(diǎn)分析[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2012,32（1）:33-37.