，，，， *，(. ， 0008；.烏審旗獸醫(yī)局， 07300；3. ， 0008)

狂蠅科屬節(jié)肢動物門(Arthropoda)，昆蟲綱(Insecta)，雙翅目(Diptera)，短角亞目(Brachycera)，從古北區(qū)到亞熱帶，分布于世界各地范圍內(nèi)，幼蟲引發(fā)感染。由于狂蠅科不同的種屬，寄主與寄生部位也不同，如動物呼吸道、腸道及皮下組織等能引起人類和動物的強制性蠅蛆病。蠅蛆病對動物福利和動物生產(chǎn)力具有嚴重影響，是造成畜牧業(yè)重大經(jīng)濟損失的一大因素。另外，有些狂蠅科幼蟲引起的蠅蛆病能夠在動物表皮和內(nèi)部感染，導(dǎo)致動物健康受到危害甚至造成死亡。

狂蠅科根據(jù)現(xiàn)有常規(guī)分類法分為四個亞科，即狂蠅亞科、皮蠅亞科、胃蠅亞科及蛆蠅亞科，其中含有一百多個已被鑒定的種屬[1]。盡管形態(tài)學(xué)分類在昆蟲分類系統(tǒng)中一直占主導(dǎo)地位, 但由于受個體發(fā)育階段的形態(tài)特征、環(huán)境條件及標本材料等因素的限制, 一些昆蟲種類的地位分類和進化關(guān)系不易確定。分子信息作為形態(tài)分類的必要補充可提供具有連續(xù)性、可度量性、相對恒定性的分類和進化依據(jù)，且分子進化速率可反映物種進化變異的積累和進化距離。

細胞色素C氧化酶亞基I(COⅠ)位于線粒體基因上，是分子系統(tǒng)遺傳標記基因，其分子量最大、基因成穩(wěn)定狀、基因排列及功能結(jié)構(gòu)相對保守，普遍為母系遺傳，極少發(fā)生重組等，因而被廣泛用于進化、系統(tǒng)發(fā)育、種群遺傳結(jié)構(gòu)、基因漂流、雜交和生物地理學(xué)等方面的研究[2]。COⅠ基因包含電子傳遞和跨膜反應(yīng)兩種，其范圍包括配體位點、質(zhì)子通道的合成、螺旋結(jié)構(gòu)及散布的親水性環(huán)狀鏈等不同形式和功能區(qū)域。COⅠ 基因不但保證一定程度的變異而且又很容易被通用引物擴增，其基因序列本身很少存在插入和缺失[3]。在DNA序列上比其他蛋白編碼基因變異慢，包含的系統(tǒng)發(fā)育信號多，所以相比之下更適合用來分析親緣關(guān)系密切的分類種群間的遺傳關(guān)系。同時,COⅠ基因同其他蛋白編碼基因共有某些特征，如密碼子第3位堿基不受自然選擇壓力的影響，可以自由突變[4]。因此，在實踐中絕大多數(shù)昆蟲類相互區(qū)分的遺傳標記選作線粒體基因組COⅠ基因5'端的區(qū)域，其長度在400到700堿基對，相鄰的保守序列使得這個區(qū)域易于擴增及分析[5]。本文針對狂蠅科線粒體COⅠ基因分子信息學(xué)研究概況、研究進展等進行總結(jié)概括，為今后更多狂蠅科昆蟲研究及蠅蛆病的研究提供參考。

1 狂蠅科昆蟲線粒體基因組及COⅠ基因的特點

1.1 線粒體基因組

線粒體廣泛存在于昆蟲體內(nèi)，在控制昆蟲新陳代謝、生命周期、凋亡和病害等方面起著積極作用。細胞中線粒體的位置常臨近于需要ATP的結(jié)構(gòu)或者處于細胞進行氧化作用需要的燃料附近，如昆蟲的飛行肌中和卵內(nèi)。同其他雙翅目昆蟲一樣，狂蠅科昆蟲線粒體基因具有閉合雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，大小一般在14～20 kb之間, 線粒體基因組上的多數(shù)基因在J鏈上編碼 ( majority strand) ，少數(shù)基因在N鏈上編碼 ( minority strand)[6]。其中穩(wěn)定的包含有13個編碼蛋白基因分別為細胞色素C氧化酶亞基I、II、III(即CO I、CO II、CO III)，細胞色素b脫輔基酶(cytb)，ATP合成酶亞基6和8(atp 6和atp 8),NADH脫氫酶亞基1-6(nad1-6)和4L(nad4l)； 22 個tRNA 基因，包含18 個( trnA、trnR、trnN、trnD、trnC、trnQ、trnE、trnG、trnH、trnI、trnK、trnM、trnF、trnP、trnT、trnW、trnY 和trnV) 分別對應(yīng)18 種不同的氨基酸，特殊的是絲氨酸( Ser)和亮氨酸( Leu) 的tRNA 對應(yīng)2個，分別是trnL1( CUN)、trnL2( UUR)及trnS1( UCN )、trnS2( AGN)；2個 rRNA 基因rrnL 和rrnS分別編碼大亞基16S ( 16S rRNA) 和小亞基12S( 12S rRNA)[3]。

1.2 線粒體COⅠ基因結(jié)構(gòu)與基因排列

COI氨基酸序列由五個結(jié)構(gòu)二十五個區(qū)域組成，12個跨膜螺旋區(qū)(M1-M12)、6個外環(huán)區(qū)(E1-E6)、5個內(nèi)環(huán)區(qū)(I1-I5)、羧基(COOH)及氨基終端(NH2)(見圖1)[7]。圖中方形區(qū)域具有特殊實用性作用，跨膜螺旋區(qū)M2、M6、M7和M10在COⅠ基因主要反應(yīng)中提供配位金屬離子，即血紅素與銅原子之間互相作用反應(yīng)。M8也是高度保守區(qū)域之一，與色素氧化酶質(zhì)子傳遞途徑有關(guān)聯(lián)。此區(qū)域包含三個極性氨基酸殘基(thr-352、thr-359和lys-362)，這三個氨基酸殘基在生物體內(nèi)呈完全保守狀態(tài),且在傳遞活動中起著必不可少的作用[8]。

圖1 昆蟲COⅠ基因的二維模型圖[7]填充的小圈為變異率高區(qū) Fig.1 A two-dimensional model of the insect COⅠ gene Filled circles represent residues observed to be variable between insect species

2 狂蠅科昆蟲線粒體COⅠ基因組的堿基組成及變異相關(guān)系數(shù)

特異性靶基因區(qū)域COⅠ基因作為區(qū)分狂蠅科的有力工具，不單單為種屬的鑒定而提供資料，還為昆蟲界的系統(tǒng)發(fā)育研究有所貢獻。結(jié)合Clary、Crozier、Howland 等的研究顯示，狂蠅科昆蟲與其他昆蟲線粒體基因(mtDNA)一樣，由于第三密碼子穩(wěn)定的偏向性支持腺嘌呤和胸腺嘧啶，因而核苷酸成分顯示A+T含量顯著高，占60%以上[9]。Otranto等[10]早在2003對狂蠅科昆蟲mtDNA基因COⅠ 序列688位點作出系統(tǒng)分析，其中含有385保守性位點和303可變位點，在可變位點中有48單獨位點和255簡約信息的變異位點?？裣壙偪苾?nèi)多數(shù)種屬在第三位點同義替換較多，高達86%但不會影響氨基酸成分，核苷酸變異率在整個有效區(qū)域都很高(303/688)。多數(shù)第三密碼子位點變異性最強；第一、二位點保守性強，且非同義替換大多數(shù)發(fā)生在第一位點達到28.4%(見表1)[11]。

3 狂蠅科昆蟲線粒體COⅠ基因進化速率

綜合Gennis、lunt和 Caterino的研究可推測，狂蠅科昆蟲COⅠ基因羧基區(qū)域(COOH)氨基酸變異率高于跨膜螺旋區(qū)(M)、外環(huán)區(qū)(E)、內(nèi)環(huán)區(qū)(I)及氨基終端(NH2)。該區(qū)域相關(guān)的幾個重要的功能域M5-M8顯示低水平變異率?？缒ぢ菪齾^(qū)M3、M9、M12變異率高；外環(huán)區(qū)E3、E5尤其E4為極度保守區(qū)，內(nèi)環(huán)區(qū)內(nèi)I1相比另四個區(qū)顯著保守(見圖2)。Lunt等[7]在昆蟲COⅠ基因研究中運用kruskal-wallis檢驗(KW test)，測得結(jié)果為拒絕零假設(shè)成立，即氨基酸平均變異率、各個位點變異率及五個結(jié)構(gòu)階層之間變異率存在顯著差異。當五個結(jié)構(gòu)域的每個堿基位點被計算其變異率時COOH羧端變異率比其他任何區(qū)域都高，且氨基終端、跨膜螺旋區(qū)、內(nèi)環(huán)區(qū)及外環(huán)區(qū)變異率無顯著差異(見表2) 。

表1 狂蠅科線粒體COⅠ基因同義替換和非同義替換百分比，變異位點、簡約信息位點及自裔位點的位置Table 1 Percentage of synonymous and non-synonymous substitutions and variable, informative and singleton sites occurring in total sequences at different codon positions of the COI region examined

4 mtCOI基因在狂蠅科昆蟲分子系統(tǒng)學(xué)研究中的應(yīng)用

相比狂蠅科昆蟲龐大的物種數(shù)，目前已完成線粒體COⅠ基因測序的狂蠅科種類還很少，因而獲得更多狂蠅科昆蟲線粒體COⅠ基因序列顯得極為迫切。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，研究者應(yīng)針對狂蠅科的更多種屬，特別是具有經(jīng)濟意義的種屬，獲得其線粒體COⅠ基因序列，通過對堿基組成、進化速率、基因重排規(guī)律及其產(chǎn)生的原因等方面的分析，深入了解狂蠅科昆蟲線粒體COⅠ基因的進化趨勢和特征，并在此基礎(chǔ)上選擇更佳的分析手段進行后續(xù)的起源進化、系統(tǒng)發(fā)育、種類鑒定、種群溯源以及數(shù)據(jù)庫與網(wǎng)站建設(shè)等研究，為我國及全球狂蠅入侵防控提供客觀準確的依據(jù)與技術(shù)支持，應(yīng)用前景廣闊。綜合研究結(jié)果，顯示COⅠ基因能夠用于研究雙翅目狂蠅科各類群昆蟲的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和進化模式，驗證傳統(tǒng)分類方法、建立物種的自然系統(tǒng)和進化關(guān)系，對物種的區(qū)別鑒定、發(fā)現(xiàn)物種隱存種、研究物種分岐分化及遺傳多樣性有積極作用[12]。線粒體COⅠ基因的研究是對狂蠅總科進化模式的鑒定，甚至可以在不久的將來研究宿主與環(huán)境之間的關(guān)系起著至關(guān)重要的數(shù)據(jù)依據(jù)。

圖2 昆蟲COⅠ基因各個區(qū)域平均變異率Fig. 2 The mean amino acid variability for the twenty-five structural regions of the insect COⅠ gene

4.1 mtCOⅠ基因在起源和進化研究中的應(yīng)用

在狂蠅科種屬或在更高的水平中，COⅠ基因的研究更有意義。分子學(xué)數(shù)據(jù)構(gòu)成一個基因數(shù)據(jù)庫對分化時間較早的屬、種及種下物種和地理種群等進行系統(tǒng)發(fā)育研究提供鑒定物種的有效依據(jù)。2003年，Otranto等[13]基于線粒體COⅠ基因建立了狂蠅科18個種屬的的系統(tǒng)發(fā)育樹，并估算狂蠅科昆蟲線粒體COⅠ核苷酸的進化速率。表明18種狂蠅科昆蟲歸類于4個亞科，本結(jié)論與形態(tài)學(xué)及生物學(xué)分類法得出結(jié)論相一致[13]；無脊椎動物每百萬年(my)±0.5 my核苷酸置換率大約為2%[14]，鑒于此資料可以推測出狂蠅科亞科間分岐時間，例如皮蠅科H.tarandi與HypodermaactaeonBrauer分歧時間為8.2±0.5 my，或者可以看出G.intestinalis和G.haemorrhoidalis、C.stimulator和C.trompe等物種分裂形成的時期。楊曉野等[15]對馴鹿狂蠅蠅蛆及其成蠅的COI 基因特異性序列進行比較分析，結(jié)果為COⅠ基因核苷酸序列在某程度上，可以反映出種屬及株間進化程度。

4.2 mtCOⅠ基因種群遺傳多樣性及作為DNA條形碼的應(yīng)用

早前研究表明，Oestrus.ovis與伊伯利亞野生山羊狂蠅科昆蟲在形態(tài)學(xué)及生物學(xué)上有著極大相似性[16-17]，但要鑒定其種類此數(shù)據(jù)資料遠遠不夠。在此研究的基礎(chǔ)上，Moreno等[18]對伊伯利亞野生山羊狂蠅科昆蟲COⅠ 基因進行擴增，測序結(jié)果與GenBank上的其他Oestrus.ovis對比相似度在90.3%～91.5%?；贠tranto等[10]關(guān)于COⅠ基因種屬鑒定數(shù)據(jù)：COⅠ基因序列在狂蠅科種間相似值為81.9%，亞科間相似水平分別為皮蠅亞科86.8%、狂蠅亞科86.7%、胃蠅亞科90%、蛆蠅亞科 94.7%，推斷此伊伯利亞野生山羊寄生昆蟲與Oestrus.ovis屬于同一個亞科，但絕不是同一個種類。

2004年，Otranto和Traversa[19]用分子鑒定法得出三個Przhevalskiana種的COⅠ基因序列的種間差異在0.19%～0.29%，結(jié)合前期研究得出的結(jié)論，狂蠅科種間差異高于6%且種內(nèi)差異低于1%，推測Przhevalskianasilenus、Przhevalskianaaegagri和Przhevalskianacrossii屬于狂蠅科內(nèi)同一個物種。

Moreno等[18]對幾個地方品種及野生綿羊、山羊寄生的狂蠅科昆蟲DNA條形碼COⅠ序列進行研究，測得狂蠅科線粒體COⅠ基因的96個新序列(登記在GenBank，KP974835-KP974930)，與數(shù)據(jù)庫的羊狂蠅有效CO I序列(GenBank AF497767)比較，顯示相似度在98.1%～99.5%之間，由此可以鑒定屬于同一個屬。

Yong等[20]利用線粒體COⅠ基因?qū)ζは壙评ハx進行遺傳多樣性及群體遺傳學(xué)研究，具體對CO I序列變異度、基因多樣性、基因分化、種群結(jié)構(gòu)及種群發(fā)生分岐時間做出了系統(tǒng)的結(jié)論。此研究對今后的研究給予了數(shù)據(jù)及資料參照，有利于對狂蠅科昆蟲的形態(tài)學(xué)、生物地理信息及分子系統(tǒng)發(fā)育方面做出更完整的研究。

5 展 望

新一代測序技術(shù)為開展大規(guī)模線粒體基因組的研究提供了良好的契機，能夠快速、高效地獲得大量線粒體基因組序列。此技術(shù)有助于對更多狂蠅科昆蟲進行線粒體COⅠ基因測序，但對測序物種種類以及規(guī)模的增加和基礎(chǔ)原數(shù)據(jù)的積累仍是目前昆蟲線粒體COⅠ基因組研究發(fā)展的首要工作?？傊?對線粒體COⅠ基因組在狂蠅科昆蟲系統(tǒng)進化研究中的價值還未進行系統(tǒng)評價, 這是今后需著重努力的方向。同時, 還應(yīng)將線粒體基因組數(shù)據(jù)與核基因及形態(tài)學(xué)特征等數(shù)據(jù)結(jié)合起來進行綜合分析, 共同推動狂蠅科昆蟲的系統(tǒng)進化研究。

今后在對動物疫病臨床檢疫、診斷方面，可以利用線粒體CO I技術(shù)開展流行病學(xué)調(diào)查，對病原媒介生物等進行分型鑒定、類癥鑒別，對動物蠅蛆病進行診斷、鑒定、分類等等，此研究有助于養(yǎng)殖工作人員增強對動物疾病的預(yù)防和控制。

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