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(1.重慶市畜牧科學院， 重慶 榮昌 402460; 2.重慶畜牧科學院 武陵分院,重慶 401147)

0 引言

雞鏈球菌病(Avian Streptococcosis)是雞的一種由細菌引起的急性敗血性或慢性傳染病。其特征是敗血癥、發(fā)鉗、下痢，以及成年禽頭部周圍有出血區(qū)域，幼雞發(fā)生心包炎和高死亡率等[1-2]。雛雞和成年雞均可感染，多呈地方流行。病的特征是昏睡，持續(xù)性下痢，跛行和癱瘓，或有神經(jīng)癥狀。剖檢可見皮下組織及全身漿膜水腫、出血，實質(zhì)器官如肝、脾、心、腎的腫大，有點狀壞死。該病在我國的雞、鴨、鵝、鴿有發(fā)病的報告，引起相當數(shù)量的病禽死亡，造成較大的經(jīng)濟損失[3]。

隨著養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展，雞細菌性疫病的耐藥性問題也日趨嚴重[4-5]。本研究針對雞疫病病原菌進行分離鑒定，并篩選出該病原菌的敏感藥物，分析其耐藥性變化，為雞鏈球菌病的防控提供了理論依據(jù)，同時也為其致病機理研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 病料來源

患病雞只和采集的病料均由重慶市某養(yǎng)殖場提供。

1.2 試劑

DL2000 Marker，細菌基因組提取試劑盒和膠回收試劑盒均由生工生物工程有限公司提供，藥敏紙片均購自天跟生物技術有限公司。腦心浸液固體培養(yǎng)基等由本部門提供。擴增16S rRNA的通用引物，由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列為：27f:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492r: 5'-TACCTTGTTAC GACTT-3'。

1.3 病變分析

觀察分析患病雞只的臨床癥狀，并對死亡病例進行解剖分析，觀察記錄各組織器官病變情況。

1.4 病原菌的分離純化

在酒精燈旁，將病料劃線接種于腦心浸液固體培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)，待純化后，進行革蘭氏染色鏡檢。

1.5 分子鑒定及測序分析

提取純化后病原菌基因組，利用PCR技術，擴增其16sRNA基因序列后，進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，送生工生物工程技術有限公司測序。

1.6 系統(tǒng)進化發(fā)育樹的構建

將測序后的序列在NCBI中進行BLAST比對分析，同時，借助MEGA 5.0軟件，利用N-J法構建系統(tǒng)進化發(fā)育樹。

1.7 生化鑒定

將病原菌接種不同生化管，于37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，過夜后觀察并記錄各生化管的變化。

1.8 藥敏試驗

采用藥敏紙片擴散法(K-B法)對病原菌進行14種抗生素藥物的敏感性檢測，抑菌圈直徑<10mm表示其對抗生素具有一定的耐藥性，10～15mm 的為中度敏感，>15mm 的為高度敏感。

2 結果

2.1 解剖分析

通過臨床診斷發(fā)現(xiàn)，患病雞只精神不振，持續(xù)性腹瀉，排出灰白色或褐色糞便，見圖1，對其解剖發(fā)現(xiàn)，肝臟腫大且有點狀壞死，見圖2。

圖1 腹瀉

圖2 肝臟病變

2.2 革蘭氏染色

對病原菌進行純化后染色，發(fā)現(xiàn)其為典型的排列成鏈狀的革蘭氏陽性菌，結果見圖3。

圖3 革蘭氏染色結果

2.3 分子鑒定及測序分析

利用細菌通用引物擴增其16sRNA序列，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)在1 500 bp位置出現(xiàn)特異性條帶，結果見圖4。經(jīng)測序后發(fā)現(xiàn)其大小為1 480 bp，與預期結果一致，結果見圖5。

圖4 PCR鑒定結果 M：DL2000；1.樣品

圖5 16sRNA測序結果

2.4 系統(tǒng)進化發(fā)育樹的構建

將擴增的序列進行BLAST比對后，發(fā)現(xiàn)其與鏈球菌同源性最高(99%)，且在進化樹中也與其聚為一簇，結果見圖6。

圖6 系統(tǒng)進化發(fā)育樹(Isolate strain為病原菌序列)

2.5 生化鑒定結果

通過對病原菌的生化特性進行鑒定后，發(fā)現(xiàn)其與葡萄糖、乳糖、麥芽糖和甘露糖反應均為陽性，而與木糖和菊糖為陰性，與山梨醇為陽性，肌醇為陰性，且不產(chǎn)生H2S，結果見表1。

表1 分離病原菌的生化特性

注：“+”表示陽性；“-”表示陰性

2.6 藥敏試驗

通過病原菌敏感的篩選，發(fā)現(xiàn)其對紅霉素、青霉素和慶大霉素等7種抗生素藥物較為敏感，對頭孢噻唑和新霉素中度敏感，而對環(huán)丙沙星、氧氟沙星和四環(huán)素等5種藥物產(chǎn)生耐藥性，結果見表2。

表2 分離病原菌的藥敏試驗結果

注：S．高度敏感；M ．中度敏感；R．不敏感

3 討論

雞鏈球菌病分為急性和亞急性/慢性兩種病型。急性型主要表現(xiàn)為敗血癥病狀。突然發(fā)病，病禽精神萎頓，嗜眠或昏睡狀，食欲下降或廢絕，羽毛松亂，無光澤，雞冠和肉髯發(fā)紫或變蒼白，有時還見肉髯腫大[6]。病雞腹瀉，排出淡黃色或灰綠色稀糞。成年禽產(chǎn)蛋下降或停止。急性病程1～5 d。亞急性/慢性型主要是病程較緩慢，病禽精神差，食欲減少，嗜眠，重者昏睡，喜蹲伏，頭藏于翅下或背部羽毛中[7]。體重下降，消瘦，跛行，頭部震顫，或仰于背部，嘴朝天，部分病雞腿部輕癱，站不起來。有的病雞發(fā)生眼炎和角膜炎。眼結膜發(fā)炎，腫脹、流淚，有纖維蛋白性炎癥，上覆一層纖維蛋白膜，重者可造成失明。該病嚴重給養(yǎng)雞也的健康發(fā)展帶來巨大的威脅[8]。

近些年來，各地養(yǎng)雞場都廣泛而持久地使用各種抗菌藥物，因而，所分離的菌株對抗菌藥物敏感性不盡相同，應進行藥敏試驗，選擇敏藥物進行治療，才可能獲得良好的治療效果。本研究通過對雞源鏈球菌的分離鑒定和耐藥性分析，發(fā)現(xiàn)該病原菌對雞的肝臟危害最為嚴重，且對紅霉素、青霉素和慶大霉素等7種抗生素藥物較為敏感，而對環(huán)丙沙星、氧氟沙星和四環(huán)素等5種藥物產(chǎn)生耐藥性，

本研究為雞場鏈球菌病的合理用藥提供了理論依據(jù)，也為其防控工作奠定了基礎。

[1] 王丹玲.課堂上被震撼的感動[J].科學大眾(科學教育),2014,(7):63.

[2] 王永峰,龐國治,徐有均,等.雞鏈球菌病的流行特點及防治措施[J].畜牧與飼料科學,2013,34(6):109-110.

[3] Pieterse R,Todorov SD,Dicks LM et al.Bacteriocin ST91KM, produced by Streptococcus gallolyticus subsp. macedonicus ST91KM, is a narrow-spectrum peptide active against bacteria associated with mastitis in dairy cattle.[J].Canadian journal of microbiology,2008,54(7):525-531.

[4] 陳立民.一例肉種雞鏈球菌病例的診療[J].畜牧獸醫(yī)科技信息,2016,(9):108.

[5] Jans, C,Kaindi, D. W. M,Bock, D et al.Prevalence and comparison of Streptococcus infantarius subsp. infantarius and Streptococcus gallolyticus subsp. macedonicus in raw and fermented dairy products from East and West Africa.[J].International Journal of Food Microbiology,2013,167(2):186-195.

[6] 王亞賓,陳麗穎,王自振,等.雞鏈球菌病病原分群鑒定[J].河南農(nóng)業(yè)大學學報,2001,35(4):381-382.

[7] Danne,C.,Guérillot,R.,Glaser,P. et al.Construction of isogenic mutants in Streptococcus gallolyticus based on the development of new mobilizable vectors[J].Research in Microbiology,2013,164(10):973-978.

[8] 趙翠燕,羅綠花,譚淑紅,等.雞源性鏈球菌的分離鑒定與藥敏試驗[J].甘肅農(nóng)業(yè)科技,2009(2):15-17.