周淼平，姚金保，張平平，張 鵬，楊學(xué)明，余桂紅，馬鴻翔

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所/江蘇省農(nóng)業(yè)生物學(xué)重點實驗室，江蘇南京 210014)

小麥赤霉病(Fusarium head blight，F(xiàn)HB)是發(fā)生在溫暖濕潤地區(qū)的世界性病害，主要由禾谷鐮刀菌侵染小麥穗部引起。赤霉病造成小麥產(chǎn)量損失嚴(yán)重，一般流行年份可引起5%～10%的產(chǎn)量損失，大流行年份可造成部分田塊絕收，而且病麥粒中殘留的DON等毒素嚴(yán)重影響小麥的食用和飼用價值，危害食品安全[1-2]。我國長江中下游麥區(qū)和東北春麥區(qū)為該病害的主要流行區(qū)域，20世紀(jì)80年代以來，隨著全球氣候變暖、小麥抽穗至收獲季節(jié)雨水增多以及秸稈還田和玉米-小麥連茬面積的增加，田間病原菌量增多，小麥赤霉病向黃淮麥區(qū)蔓延，并且病害流行日漸頻繁，危害程度愈來愈嚴(yán)重，已成為威脅我國黃淮麥區(qū)小麥生產(chǎn)安全的常發(fā)性重要病害[2-4]。

多年的生產(chǎn)實踐證明，培育和使用抗小麥赤霉病品種是預(yù)防該病害最經(jīng)濟和環(huán)保的手段。培育抗病品種需要抗性穩(wěn)定的赤霉病抗源提供抗病基因，國內(nèi)外科研人員經(jīng)過多年研究，已經(jīng)篩選到蘇麥3號、望水白、Frontana等一批抗病種質(zhì)材料[5]，對蘇麥3號、望水白、Ernie和Heyne等抗源的赤霉病抗性主效QTL進行了染色體和遺傳連鎖圖定位[6]，并根據(jù)精細(xì)定位結(jié)果克隆了蘇麥3號的抗赤霉病主效基因 Fhb1[7]。這些研究成果為今后開展小麥抗赤霉病育種奠定了堅實基礎(chǔ)。

國內(nèi)針對小麥赤霉病的抗病育種始于20世紀(jì)70年代，經(jīng)過數(shù)十年的不懈努力，我國長江中下游麥區(qū)小麥赤霉病危害已經(jīng)得到顯著緩解，該麥區(qū)小麥品種中累積了不少赤霉病抗病基因，培育和推廣的小麥品種赤霉病抗性基本達到中感以上。與之相鄰的黃淮麥區(qū)由于赤霉病危害面積小，育種親本赤霉病抗病基因匱乏，目前育成和推廣的品種絕大多數(shù)沒有達到中感水平，提高品種以及育種親本的赤霉病抗性已成為日益急迫的問題[2,4]。將長江中下游麥區(qū)小麥赤霉病抗病基因?qū)朦S淮麥區(qū)小麥品種以及從黃淮麥區(qū)小麥品種中篩選赤霉病抗病新種質(zhì)是解決這一急迫問題最便捷的兩條途徑。

本研究以黃淮麥區(qū)大面積種植小麥品種濟麥22為受體，采用連續(xù)回交與分子標(biāo)記輔助選擇相結(jié)合的方法將蘇麥3號赤霉病抗病主效QTL導(dǎo)入濟麥22，培育赤霉病抗性提高且保持濟麥22高產(chǎn)、廣適優(yōu)良農(nóng)藝性狀的種質(zhì)材料；同時對黃淮麥區(qū)的品種(系)進行人工接種鑒定，篩選抗赤霉病新種質(zhì)，以期為培育適合黃淮麥區(qū)種植的抗赤霉病小麥品種提供有益幫助。

1 材料與方法

1.1 供試材料

抗赤霉病新種質(zhì)創(chuàng)制以濟麥22為受體，以長江中下游麥區(qū)赤霉病重要抗源蘇麥3號為抗病基因供體?？钩嗝共⌒路N質(zhì)篩選共選用564份材料，包括黃淮麥區(qū)審定品種85份、國家區(qū)域試驗黃淮南片區(qū)試和預(yù)試材料229份、江蘇省淮北區(qū)域試驗區(qū)試和預(yù)試材料215份以及本研究室育成高代品系35份，抗病性鑒定采用蘇麥3號(抗赤霉病)、寧麥13(中抗赤霉病)和安農(nóng)8455(感赤霉病)作為對照，所有小麥材料均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所麥類作物研究室保存?？共⌒澡b定所用禾谷鐮刀菌菌株F0609由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所陳懷谷研究員提供。

1.2 抗赤霉病新種質(zhì)材料的創(chuàng)制

以濟麥22為母本與蘇麥3號雜交，后代連續(xù)與母本濟麥22回交，每代均采用與蘇麥3號3B染色體上抗赤霉病主效QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記Xgwm533和Xgwm493[8]對回交后代進行跟蹤篩選，直至BC4，套袋自交，BC4F2后代挑選分子標(biāo)記Xgwm533和Xgwm493均為純合的植株，檢測 Fhb1基因是否存在，考查其后代農(nóng)藝性狀。雜交與回交的每個世代均對抗赤霉病主效QTL分離后代植株和親本進行赤霉病抗性鑒定，抗病性鑒定期間彌霧保濕。

1.3 抗赤霉病分子標(biāo)記和 Fhb1基因的檢測

小麥DNA的提取采用葉片作為樣品，冷凍干燥后參照Karroten植物基因組DNA提取試劑盒操作手冊進行。Xgwm533和Xgwm493分子標(biāo)記的PCR反應(yīng)體系：總體積為20 μL，含1× buffer，1.5 mmol·L-1MgCl2,0.2 mmol·L-1dNTPS,0.5 μmol·L-1各類引物，50 ng 模板DNA，1U Tag DNA聚合酶(TaKaRa)。采用touch-down程序進行PCR擴增：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性40 s，62～55 ℃復(fù)性45 s,每個循環(huán)降低1 ℃，72 ℃延伸30 s，8個循環(huán)；然后94 ℃變性40 s，55 ℃復(fù)性45 s,72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染觀察或采用3%瓊脂糖凝膠電泳溴乙錠染色觀察。 Fhb1基因的檢測以文獻[7]報道的PFT(pore-forming toxin-like)基因序列(GenBank:KX907434.1)為模板，采用Primer 3 Plus(http://www.primer3plus.com/)軟件設(shè)計引物(序列見表1)，PCR反應(yīng)體系與分子標(biāo)記檢測相同，PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離。

表1 分子標(biāo)記和 Fhb1基因檢測引物Table 1 Primers of molecular markers and Fhb1 gene

1.4 黃淮麥區(qū)小麥品種(系)赤霉病抗性鑒定和篩選

小麥赤霉病抗性鑒定和篩選于2014-2016年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院本部試驗地實施，采用單花滴注的方法進行，調(diào)整禾谷鐮刀菌孢子液濃度為50 000 個·mL-1，于小麥?zhǔn)蓟ㄆ诎斫臃N，選取中上部剛開花小穗，滴加10 μL孢子液，21 d后調(diào)查病小穗率，病小穗率=(發(fā)病小穗數(shù)/總小穗數(shù))×100%。每個品種(系)重復(fù)2次，每重復(fù)調(diào)查10穗。每年病小穗率低于25%的品種(系)，下一年繼續(xù)進行赤霉病抗性鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘇麥3號抗赤霉病主效QTL向濟麥22導(dǎo)入的結(jié)果

蘇麥3號為春性紅皮小麥，其株高和株型均不適合用于黃淮麥區(qū)雜交配組，將其抗赤霉病主效QTL導(dǎo)入黃淮麥區(qū)主推品種，培育抗赤霉病近等基因系，再進行雜交配組將達到事半功倍的效果。本研究采用濟麥22為受體，通過連續(xù)回交與分子標(biāo)記輔助選擇相結(jié)合的方法將蘇麥3號赤霉病抗性主效QTL導(dǎo)入濟麥22。由圖1可見，由于蘇麥3號抗赤霉病主效QTL的導(dǎo)入，雜交F1后代的赤霉病病小穗數(shù)較受體親本有較大幅度減少。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，從F1到BC4，含有蘇麥3號抗赤霉病主效QTL的濟麥22衍生系平均病小穗率降低了51.2%，隨著回交次數(shù)的增加，濟麥22的背景不斷滲入，回交后代中來源于蘇麥3號的微效抗病基因逐漸丟失，其赤霉病抗性也逐漸降低，后代平均病小穗率的減少率由F1的55.3%降低到BC4的31.9%，而從回交后代分離的不含蘇麥3號抗赤霉病主效QTL的濟麥22衍生系的赤霉病抗性與受體親本相比，差異不顯著，表明主效QTL的抗病作用非常明顯(表2)。

1：濟麥22；2：蘇麥3號；3：F1。

1:Jimai 22; 2:Sumai 3; 3:F1.

圖1親本及F1的赤霉病抗性表現(xiàn)

Fig.1FHBresistanceofparentsandF1progeny

對BC4回交后代分子標(biāo)記檢測呈陽性的植株進行套袋自交，BC4F2采用與蘇麥3號赤霉病抗病主效QTL緊密連鎖的兩側(cè)分子標(biāo)記Xgwm533和Xgwm493以及報道的 Fhb1候選基因PFT的引物進行PCR擴增檢測(圖2)，篩選獲得赤霉病抗病基因純合的植株，繼續(xù)繁殖并進行農(nóng)藝性狀的篩選。已經(jīng)獲得十多個赤霉病抗性明顯提高的品系，但也發(fā)現(xiàn)多數(shù)品系的株高較受體親本濟麥22有所增加，表3選列了4個與濟麥22株高相仿、株型一致的品系，這些品系的穗長與濟麥22相仿或稍有增長，每穗粒數(shù)、千粒重和籽粒蛋白質(zhì)含量變化較大，這些品系將為今后黃淮麥區(qū)小麥赤霉病抗性的改良提供幫助。

2.2 黃淮麥區(qū)抗赤霉病新種質(zhì)篩選結(jié)果

對本研究室保存的黃淮麥區(qū)審定品種、國家區(qū)域試驗黃淮南片區(qū)試和預(yù)試材料、江蘇省淮北區(qū)域試驗區(qū)試和預(yù)試材料以及本研究室育成的高代品系采用人工單花滴注的方法進行赤霉病抗性鑒定，2014年鑒定416份，2015年鑒定148份，2016年繼續(xù)對平均病小穗率小于25%的材料進行抗性鑒定。由于黃淮麥區(qū)品種(系)多不含抗赤霉病基因，在鑒定期間沒有采取彌霧保濕措施，自然環(huán)境下部分品種的病小穗率仍然高達93.5%。

表2 F1及回交不同世代的赤霉病平均病小穗率Table 2 The FHB resistance of lines in F1 and different backcrossing generation (Average percentage of scabbed spikelets) %

+：含有蘇麥3號抗赤霉病主效QTL；-：不含蘇麥3號抗赤霉病主效QTL。

+:with the major QTL for FHB resistance of Sumai 3; -:without the major QTL for FHB resistance of Sumai 3.

A：Xgwm533；B：Xgwm493；C：PFT。1～15:回交后代；16：蘇麥3號；17：濟麥22；M：Marker。

A：Xgwm533；B：Xgwm493；C：PFT.1-15：Lines of backcrossing; 16:Sumai 3; 17:Jimai 22; M:Marker.

圖2 部分BC4F2植株的分子標(biāo)記輔助選擇

綜合連續(xù)3年鑒定的結(jié)果以及對照蘇麥3號(抗赤霉病)、寧麥13(中抗赤霉病)和安農(nóng)8455(感赤霉病)等對照品種的赤霉病發(fā)病情況，共篩選到赤霉病抗性中感以上的小麥品種(系)18份，其赤霉病抗性鑒定結(jié)果見表4。

為了探尋這些種質(zhì)材料是否與赤霉病抗源蘇麥3號擁有相同的抗病主效QTL，分別采用分子標(biāo)記Xgwm533和Xgwm493對供試種質(zhì)材料進行檢測，發(fā)現(xiàn)南農(nóng)13Y106與蘇麥3號的Xgwm533標(biāo)記帶型相同；淮麥30、百農(nóng)898、信資10-804、山農(nóng)12號、眾麥8號、南農(nóng)13Y106與蘇麥3號的Xgwm493標(biāo)記帶型相同。采用蘇麥3號赤霉病抗病主效QTL重要候選基因PFT引物分析供試種質(zhì)材料，發(fā)現(xiàn)淮麥30、百農(nóng)898、信資10-804、眾麥8號、南農(nóng)13Y106、濟揚06037、百農(nóng)201、宛麥23和濟揚81205含有PFT基因，推測其可能與蘇麥3號擁有相同的赤霉病抗病主效基因?；春?2013、皖麥27、豫教6號、山農(nóng)12、邯鄲6172、JX109、豐麥518、農(nóng)豐146和FY-1等則可能含有與蘇麥3號不同的赤霉病抗病主效基因(圖3)。

表4 赤霉病抗性穩(wěn)定的小麥品種(系)的平均病小穗率Table 4 Average percentage of scabbed spikelets of varieties with stable FHB resistance %

A：Xgwm533；B：Xgwm493；C：PFT。1：淮麥30；2：淮核12013；3：皖麥27；4：百農(nóng)898；5：豫教6號；6：信資10-804；7：山農(nóng)12號；8：邯鄲6172；9：眾麥8號；10：南農(nóng)13Y106；11：JX109；12：豐麥518；13：農(nóng)豐146；14：FY-1；15：濟揚06037；16：百農(nóng)201；17：宛麥23；18：濟揚81205；19：蘇麥3號；M：Marker。

A：Xgwm533；B：Xgwm493；C：PFT.1:Huaimai 30; 2:Huaihe 12013; 3:Wanmai 27; 4:Bainong 898; 5:Yujiao 6; 6:Xinzi 10-804; 7:shannong 12; 8:Handan 6172; 9:Zongmai 8; 10:Nannong 13Y106; 11:JX109; 12:Fengmai 518; 13:Nongfeng 146; 14:FY-1; 15:Jiyang 06037; 16:Bainong 201; 17:Wanmai 23; 18:Jiyang 81205; 19:Sumai 3; M:Marker.

圖3抗病種質(zhì)分子標(biāo)記和Fhb1基因檢測結(jié)果

Fig.3IdentificationofgermplasmresistancetoFHBusingmolecularmarkersandFhb1gene

3 討 論

培育和推廣抗赤霉病小麥品種是減少小麥赤霉病危害最有效的措施。經(jīng)過多年努力，長江中下游麥區(qū)赤霉病危害有所緩解，但黃淮麥區(qū)抗病品種依然匱乏。據(jù)統(tǒng)計，2014-2016年長江中下游麥區(qū)進入國家區(qū)試生產(chǎn)試驗的13個品種中，4個中抗赤霉病，其余均達中感；而同期進入黃淮南片國家區(qū)試生產(chǎn)試驗的62個品種中，只有2個中感，其余均為高感[9-11]。直接采用長江中下游麥區(qū)小麥品種作為赤霉病抗源用于黃淮麥區(qū)小麥品種改良，由于兩者在生態(tài)類型、株型、株高和籽粒顏色等方面差異較大，雜交后代分離嚴(yán)重，選育赤霉病抗性提高且聚合諸多適合黃淮麥區(qū)的優(yōu)良農(nóng)藝性狀的品種較為困難，如將抗赤霉病基因先導(dǎo)入黃淮麥區(qū)大面積推廣小麥品種，再進行雜交配組和選育，則相對容易。本研究采用分子標(biāo)記輔助選擇與常規(guī)雜交相結(jié)合的方法，將蘇麥3號的抗病主效QTL導(dǎo)入到濟麥22中，獲得生育期、株高、株型、籽粒顏色等性狀與濟麥22相仿，且赤霉病抗性顯著提高的半冬性小麥品系，這些品系可直接用于黃淮麥區(qū)育種的雜交配組，提高小麥赤霉病抗性，本課題組也將進一步對其產(chǎn)量進行評估，以期篩選出赤霉病抗性顯著提高且同時擁有濟麥22豐產(chǎn)性的小麥新品種(系)。

從黃淮麥區(qū)小麥品種(系)中篩選小麥赤霉病抗病新種質(zhì)以及挖掘抗赤霉病新基因也是加快黃淮麥區(qū)抗赤霉病品種培育進程的重要途徑，目前這方面的研究只有零星報道，黃 杰等[4]對參加2014-2015年河南省水地組小麥區(qū)試53個品種(系)的赤霉病抗性進行了分析，發(fā)現(xiàn)只有濮麥8026中抗赤霉病，囤豐809和金麥205達到中感，其余均為高感赤霉病。張玲麗等[3]研究表明，西農(nóng)979具有與蘇麥3號相同的 Fhb1基因，該品種在大田對赤霉病的抗性達到中感至中抗水平。為了挖掘新的赤霉病抗病基因，呂 超等[12]采用偃展1號×內(nèi)鄉(xiāng)188重組自交系群體，在2D、4B、4D、5B、5D等染色體上均發(fā)現(xiàn)了抗赤霉病QTL，表型解釋率在2.27%～12.87%。以上研究表明，盡管黃淮麥區(qū)小麥赤霉病抗源匱乏，但部分小麥品種(系)也存在抗赤霉病基因，本研究對564份黃淮麥區(qū)小麥品種(系)的赤霉病抗性鑒定結(jié)果也證實了這一結(jié)論，共篩選到赤霉病中感以上材料18份，其中9份不含有蘇麥3號赤霉病抗病主效基因，可能含有新的赤霉病抗性基因。

在蘇麥3號抗赤霉病主效基因 Fhb1克隆之前，研究人員多采用Xgwm533和Xgwm493這兩個標(biāo)記對蘇麥3號抗赤霉病主效QTL進行輔助選擇，盡管兩分子標(biāo)記位于主效基因 Fhb1的兩側(cè)，但與該基因仍有不小遺傳距離，輔助選擇中常有主效基因丟失情況發(fā)生。本研究基于 Fhb1基因開發(fā)了新的分子標(biāo)記，可直接對 Fhb1基因本身進行選擇，無疑提高了選擇效率。

長江中下游麥區(qū)的育種經(jīng)驗表明，選用綜合性狀及豐產(chǎn)性好且赤霉病輕的親本配組，后代選擇注重豐產(chǎn)和抗病兼顧，可以培育出抗赤霉病高產(chǎn)品種[2]。利用含有蘇麥3號赤霉病抗病主效QTL的濟麥22以及篩選獲得的黃淮麥區(qū)抗赤霉病新種質(zhì)，通過雜交以及分子標(biāo)記輔助選擇等手段，將抗赤霉病基因逐漸向黃淮麥區(qū)骨干親本中轉(zhuǎn)移和累積，再用赤霉病抗性逐步提高的骨干親本進行配組，極有可能選育出適合黃淮麥區(qū)種植、高產(chǎn)抗赤霉病新品種。

參考文獻：

[1] 陸維忠,程順和,王裕中.小麥赤霉病研究[M].北京:科學(xué)出版社,2001:3.

LU W Z,CHENG S H,WANG Y Z.Studies on Fusarium head blight of wheat [M].Beijing:Science Press,2001:3.

[2] 程順和,張 勇,別同德,等.中國小麥赤霉病的危害及抗性遺傳改良[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報,2012,28(5):938.

CHENG S H,ZHANG Y,BIE T D,etal.Damage of wheat Fusarium head blight(FHB) epidemics and genetic improvement of wheat for scab resistance in China [J].JiangsuJournalofAgriculturalScience,2012,28(5):938.

[3] 張玲麗,孫道杰,馮 毅,等.西農(nóng)979抗赤霉病基因 Fhb1 的分子鑒定及其親緣關(guān)系分析[J].麥類作物學(xué)報,2014,34(9):1199.

ZHANG L L,SUN D J,FENG Y,etal.Molecular identification of FHB resistance gene Fhb1 in Xinong 979 and its pedigree [J].JournalofTriticeaeCrops,2014,34(9):1199 .

[4] 黃 杰,喬冀良,張振永,等.河南省小麥品種對赤霉病的抗性分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2017,45(8):31,52.

HUANG J,QIAO J L,ZHANG Z Y,etal.Resistance analysis of Henan wheat varieties against gibberellic disease [J].JournalofAnhuiAgriculturalScience,2017,45(8):31,52.

[5] 劉易科,佟漢文,朱展望,等.小麥赤霉病抗性改良研究進展[J].麥類作物學(xué)報,2016,36(1):51.

LIU Y K,TONG H W,ZHU Z W,etal.Review on improvement of Fusarium head blight resistance in wheat [J].JournalofTriticeaeCrops,2016,36(1):51.

[6] BUERSTMAYR H,BAN T,ANDERSON J A.QTL mapping and marker-assisted selection for Fusarium head blight resistance in wheat:a review [J].PlantBreeding,2009,128:1.

[7] RAWAT N,PUMPHREY O M,LIU S.Wheat Fhb1 encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance to Fusarium head blight [J].NatureGenetics,2016,48:1576.

[8] 周淼平,任麗娟,張 旭,等.3B 染色體短臂小麥赤霉病抗性主效QTL的分析[J].遺傳學(xué)報,2003,30(6):571.

ZHOU M P,REN L J,ZHANG X,etal.Analysis of major QTL for Fusarium head blight resistance on the short arm of chromosome 3B in wheat [J].ActaGeneticaSinica,2003,30(6):571.

[9] 全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心.中國冬小麥新品種動態(tài):2013-2014年度國家冬小麥品種區(qū)域試驗匯總報告[M].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社,2015:38,77.

The National Agro-Tech Extension and Service Center.New varieties of winter wheat in China:Summary report of National Winter Wheat Regional Trials in 2013-2014[M].Beijing:China Agricultural Science and Technology Press,2015:38,77.

[10] 農(nóng)業(yè)部種子管理局,全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心.2014-2015年度冬小麥國家區(qū)試品種報告[M].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社, 2016:34,87.

Seed Management Bureau of Ministry of Agriculture and the National Agro-Tech Extension and Service Center.Varieties report of National Winter Wheat Regional Trials in 2014-2015 [M].Beijing:China Agricultural Science and Technology Press,2016:34,87.

[11] 農(nóng)業(yè)部種子管理局,全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心.2015-2016年度冬小麥國家區(qū)試品種報告[M].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社, 2017:31,77.

Seed Management Bureau of Ministry of Agriculture and the National Agro-Tech Extension and Service Center.Varieties report of National Winter Wheat Regional Trials in 2015-2016 [M].Beijing:China Agricultural Science and Technology Press,2017:31,77.

[12] 呂 超,姚 琴,宋彥霞,等.偃展1號×內(nèi)鄉(xiāng)188群體抗小麥赤霉病QTL分析[J].麥類作物學(xué)報,2014,34(12):1633.

Lü C,YAO Q,SONG Y X,etal.QTL analysis for Fusarium head blight(FHB) resistance in RIL population from Yanzhan 1×Neixiang 188 [J].JournalofTriticeaeCrops,2014,34(12):1633.