吳 瓊，盧 洲，馬東慎，邢 蕓，金 亮

（中國藥科大學生命科學與技術(shù)學院，南京210009）

胰島移植是一種新的有效控制1型糖尿病的方法，然而胰島來源有限，移植免疫排斥等問題限制了胰島移植的發(fā)展［1］?，F(xiàn)代科學技術(shù)能夠成功地體外培養(yǎng)胰腺成體干細胞，這一技術(shù)有望解決胰島缺失這一難題［2－4］，眾多的信號通路在胰腺干細胞的生長發(fā)育過程中有著廣泛的調(diào)節(jié)作用［5－8］，但其生長機制尚不完全明確。

MicroRNA是一種長度為18～24個核苷酸組成的短鏈非編碼RNA，在細胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移等過程中扮演重要角色［9－12］。miR-217是一種已知的具有抑制細胞增殖的microRNA，在多種細胞的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。在人胰腺導管腺腫瘤中，miR-217通過靶向Tpd52l2、Kras和E2F3等靶基因抑制細胞的增殖、侵襲和遷移［13－15］。在肝細胞癌中，miR-217靶向DKK1調(diào)控WNT信號通路進而影響腫瘤干細胞的干性［16］。但其在胰腺成體干細胞方面的研究尚未見報道。

本課題組前期對小鼠胰腺成體干細胞的高通量測序結(jié)果表明，與胰腺組織相比，在胰腺成體干細胞中miR-217的表達明顯降低［17］。本研究通過探索miR-217對胰腺成體干細胞增殖的調(diào)控作用，為胰腺成體干細胞的進一步研究提供參考依據(jù)。

1 材 料

1.1 試 劑

DMEM／F12、DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（美國 Gibco公司）；Lipo2000（美國 Thermo Fisher公司）；0.25%胰酶細胞消化液、雙熒光素酶試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；miR-217 mimics（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；Western blot電泳設(shè)備（美國 Bio-Rad公司）；兔抗-Cyclin D1抗體（美國 Selleck公司）；Ki-67抗體、小鼠抗 Sirt1抗體、兔抗-GAPDH抗體、HRP標記的山羊抗小鼠IgG和HRP標記的山羊抗兔IgG抗體［艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司］；DAPI（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；qPCR試劑（南京愛必夢生物材料有限公司和上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；其他試劑均為市售分析純。qPCR過程中所使用的引物和雙熒光素酶報告基因載體構(gòu)建中靶位點序列由蘇州金唯智公司合成。

1.2 儀 器

480Ⅱ?qū)崟r熒光定量PCR系統(tǒng)（上海羅氏制藥有限公司）；細胞培養(yǎng)箱、離心機（美國 Thermo Fisher公司）；TS2R倒置熒光顯微鏡（日本尼康公司）。

1.3 動物和細胞

6～8周齡的C57BL／6清潔級小鼠購自揚州大學比較醫(yī)學中心，許可證號為 SCXK（蘇）2017-0007，所有動物實驗均符合動物倫理委員會標準。HEK293T細胞保存于本實驗室。

2 方 法

2.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

二維體系培養(yǎng)的小鼠胰腺成體干細胞的培養(yǎng)方法參照文獻［17］，先用三維半固體體系培養(yǎng)胰腺成體干細胞的單克隆球，在無菌條件下用10μL槍頭將其挑出，用0.25%胰酶將其消化成單細胞，按每孔1×105個細胞的密度鋪于包被有matrigel膠的12孔細胞培養(yǎng)板中。HEK293T細胞使用DMEM高糖培養(yǎng)基（含100 U／mL青霉素，100μg／mL鏈霉素）培養(yǎng)。

當胰腺成體干細胞在細胞培養(yǎng)板中的融合度達到80%后，將培養(yǎng)基換成不含抗生素和血清的培養(yǎng)基300μL，將Lipo2000 1μL與miR-217mimics（20μmol／L）5μL加入到不含血清和抗生素的培養(yǎng)基100μL中，在室溫下孵育15 min后，將轉(zhuǎn)染混合物加入到二維培養(yǎng)的胰腺成體干細胞中。轉(zhuǎn)染后3 h，將培養(yǎng)基更換成完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)36 h。

2.2 免疫熒光技術(shù)檢測Ki-67的表達

將培養(yǎng)的細胞先用4%多聚甲醛在室溫固定15 min，加入配制好的0.2%Tritonx-100破膜液，使其能夠充分浸潤細胞，在室溫下破膜作用30 min。每孔加入PBST＋1%BSA溶液300μL使其封閉，根據(jù)待檢測一抗說明書按比例稀釋一抗溶液，于4℃孵育過夜。用PBST清洗后加入相應的按比例稀釋的二抗溶液，于37℃避光孵育染色1 h。DAPI復染后用PBST充分洗凈后在倒置熒光顯微鏡下拍照。此實驗中每個步驟結(jié)束后均用PBST清洗細胞3次。

2.3 Western blot法檢測 Cyclin D1、Sirt1蛋白的表達

在細胞中加入RIPA裂解液（含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑）使細胞充分裂解，加入5×上樣緩沖液溶液和PBS調(diào)整蛋白濃度為1μg／μL，于100℃金屬浴中煮沸10 min。10%分離膠和5%濃縮膠電泳，電壓為160 V，電泳持續(xù)約45 min。使用半干轉(zhuǎn)的方法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，于5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h。分別加入相應的按1∶1 000稀釋的一抗：rabbit anti-Cyclin D1，rabbit anti-GAPDH，mouse anti-Sirt1抗體，在4℃冰箱中過夜孵育。洗膜3次后加入相對應的二抗避光孵育1 h，繼續(xù)洗膜3次后于曝光儀中曝光。

2.4 RNA的提取和qPCR

在每個細胞樣本中加入Trizol裂解液1 mL將細胞充分裂解后提取細胞RNA，使用qPCR試劑盒，分別將RNA反轉(zhuǎn)錄成普通cDNA和miR-217的cDNA，將其加到96孔qPCR板中，進行實時定量PCR。qPCR過程中所使用的引物序列如表1所示。

Table 1 Primers used for qPCR

2.5 雙熒光素酶檢測實驗

根據(jù)TargetScan網(wǎng)站預測miR-217的3個潛在的靶基因，并合成包含酶切位點和目的片段3′-UTR種子序列的59 bp的片段。片段序列如表2所示。

Table 2 Sequence used for luciferase report assay

將合成的單鏈退火，使用T4-DNA連接酶將退火產(chǎn)物與酶切后的PMIR-REPORT質(zhì)粒進行連接重組，并將其轉(zhuǎn)化進大腸埃希菌中，提取質(zhì)粒。microRNA與PMIR-REPORT重組質(zhì)粒、海腎質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞：提前將HEK293T細胞均勻鋪到24孔板中，轉(zhuǎn)染3種質(zhì)粒，每種設(shè)置3個平行孔。HEK293T鋪板密度為每孔2×105個，體系500μL，轉(zhuǎn)染前將24孔板中細胞換成400μL不含抗生素和血清的培養(yǎng)基，4～6 h后開始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染結(jié)束后36 h使用雙熒光素酶報告試劑盒對其熒光值進行檢測。

2.6 統(tǒng)計學處理

3 結(jié) 果

3.1 Sirt1在胰腺成體干細胞中的表達

提取三維半固體體系培養(yǎng)的胰腺成體干細胞和小鼠胰腺組織的 RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，qPCR方法檢測胰腺成體干細胞中Sirt1 mRNA的表達水平。結(jié)果如圖1所示，在mRNA水平，Sirt1的表達沒有明顯變化。

Figure 1 Expression of Sirt1 in mouse adult pancreatic stem cells detected by qPCR

提取小鼠胰腺成體干細胞和胰腺組織的蛋白質(zhì)，驗證胰腺成體干細胞中Sirt1蛋白的表達差異。實驗結(jié)果顯示（圖2），在胰腺成體干細胞中Sirt1的蛋白表達明顯升高。

Figure 2 Expression of Sirt1 in mouse adult pancreatic stem cells（PPCs）detected by Western blot

3.2 miR-217 mimics轉(zhuǎn)染的過表達效率

將三維體系培養(yǎng)的胰腺成體干細胞轉(zhuǎn)到二維體系后，轉(zhuǎn)染miR-217 mimics使miR-217過表達，其過表達效率如圖3所示，與對照組相比，miR-217 mimics轉(zhuǎn)染組中miR-217的表達顯著上調(diào)，比對照組增高50倍。結(jié)果表明miR-217 mimics可以作為上調(diào)miR-217的有效工具。

Figure 3 Expression of miR-217 in miR-217 mimics-transfected mouse adult pancreatic stem cells***P＜0.001 vs contorl group

3.3 miR-217對細胞增殖的影響

為了驗證miR-217對細胞增殖的影響，在二維體系中培養(yǎng)的胰腺成體干細胞中過表達miR-217，觀察miR-217對增殖的影響。通過Western blot方法檢測細胞增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1的表達，實驗結(jié)果如圖4所示，通過轉(zhuǎn)染 miR-217 mimics使miR-217的表達上調(diào)后，與對照細胞相比，miR-217能夠降低細胞增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1的表達。

Figure 4 Protein expression level of Cyclin D1 in miR-217 mimicstransfected mouse adult pancreatic stem cells

免疫熒光實驗（圖5）也表明在二維體系培養(yǎng)的胰腺成體干細胞中過表達miR-217后增殖相關(guān)蛋白Ki-67的表達也明顯降低，這些結(jié)果一致說明miR-217能夠明顯抑制胰腺成體干細胞的增殖。

3.4 雙熒光素酶報告基因篩選miR-217的靶基因

使用生物信息學的軟件篩選miR-217的潛在靶基因，通過TargetScan軟件預測出3個潛在靶基因：Sirt1、Maf和Pcna，并將其潛在靶基因的包含種子序列的3′-UTR序列構(gòu)建在PMIR-REPORT質(zhì)粒載體的螢火蟲熒光素酶報告基因下游的MCS區(qū)。雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示（圖6），只有Sirt1螢火蟲熒光素酶的相對熒光值能夠被miR-217抑制，而Maf和Pcna的螢火蟲熒光素酶相對熒光值沒有影響。實驗結(jié)果說明Sirt1是miR-217的靶基因。

Figure5 Ki-67 expression inmiR-217mimics-transfectedmouseadult pancreatic stem cells（×200）

Figure 6 miR-217 directly targeting 3′UTR of Sirt1，but not Maf or Pcna，evaluated by dual-luciferase activity assay）***P＜0.001 vs contorl group

3.5 miR-217對Sirt1的靶向調(diào)控作用

為了進一步驗證miR-217對Sirt1的直接靶向調(diào)控作用，通過qPCR和Western blot的方法驗證miR-217對靶基因的調(diào)控作用，如圖7中的qPCR結(jié)果顯示，在胰腺成體干細胞中過表達miR-217后，其靶點的mRNA水平?jīng)]有明顯變化，表明miR-217對Sirt1的mRNA水平?jīng)]有明顯作用。然而，與對照組相比較，胰腺成體干細胞在過表達miR-217后Sirt1的蛋白表達明顯被抑制，說明在胰腺成體干細胞中miR-217通過抑制Sirt1的蛋白表達來發(fā)揮對下游的調(diào)控作用。

3.6 Sirt1對細胞增殖的影響

為了驗證Sirt1對胰腺成體干細胞增殖的作用，使用 Sirt1的激動劑白藜蘆醇（Res，10μmol／L）和 Sirt1的抑制劑尼克酰胺（NAM，40 mmol／L）來驗證Sirt1對胰腺成體干細胞中Cyclin D1表達的影響。實驗結(jié)果如圖8所示，白藜蘆醇能夠在蛋白水平和mRNA水平促進Cyclin D1的影響，而尼克酰胺對其具有抑制作用。

Figure 7 Sirt1 expression after transfected with miR-217 mimics detected with Western blot（A）and qPCR（B）

Figure 8 Proliferation rate of adult pancreatic stem cells.Cyclin D1 expression after treated with resveratrol（Res）or niacinamide（NAM）detected with Western blot（A）and qPCR（B）**P＜0.01，***P＜0.001 vs DMSO group

為了進一步驗證Sirt1對胰腺成體干細胞成球能力的影響，在三維半固體培養(yǎng)體系中加入Sirt1的激動劑白藜蘆醇和抑制劑尼克酰胺，實驗結(jié)果如圖9所示，加入白藜蘆醇能夠促進胰腺成體干細胞的成球能力，而當尼克酰胺的使用濃度為40 mmol／L時，能夠明顯抑制胰腺成體干細胞的成球能力。綜上所述，促進Sirt1能夠促進胰腺成體干細胞的增殖能力，而抑制Sirt1能夠抑制胰腺成體干細胞的增殖。

Figure 9 Colony formation ability of pancreas resulted from Res and NAM，respectively（×40）.（A）control；（B）Res 10μmol／L；（C）NAM 40 mmol／L

4 討 論

為了尋找胰島移植的替代物，人們通過培養(yǎng)胚胎干細胞成功將其誘導為能夠分泌胰島素的細胞，但其來源缺乏以及存在倫理等問題，胚胎干細胞的運用受到局限。對成體胰腺干細胞的體外培養(yǎng)已經(jīng)穩(wěn)定地建立起來，這對胰島移植的治療具有一定促進作用。

為了探索胰腺成體干細胞生長發(fā)育過程中的調(diào)控作用，本研究以前期的高通量測序結(jié)果為參考，以miR-217為研究對象。MicroRNA的調(diào)控是一個極其龐大又復雜的網(wǎng)絡(luò)，本研究中過表達miR-217后能夠明顯抑制細胞增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1和Ki-67的表達，說明miR-217能夠抑制胰腺成體干細胞的增殖，在其發(fā)育過程中低表達的miR-217有助于維持其細胞增殖。為了進一步探索miR-217對胰腺成體干細胞增殖的抑制作用，通過Targetscan網(wǎng)站預測了miR-217的潛在靶基因，篩選出3個和胰腺成體干細胞發(fā)育存在相關(guān)性的基因。利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-217與其潛在靶點的直接相關(guān)性，驗證了Sirt1是miR-217的一個靶基因。同時在胰腺成體干細胞中過表達miR-217后發(fā)現(xiàn)其靶點的蛋白水平的表達顯著降低，說明miR-217通過靶向調(diào)控Sirt1來調(diào)控胰腺成體干細胞的增殖。

Sirt1是一種NAD＋依賴的蛋白去乙?；?，在調(diào)節(jié)基因沉默、細胞衰老、細胞代謝等方面發(fā)揮重要的作用［18］。白藜蘆醇是Sirt1的激動劑，能夠緩和成體干細胞的衰退［19］。在豬胎胰腺干細胞中，白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)Sirt1的表達，明顯促進了胰腺干細胞的增殖［20］。本研究使用Sirt1抑制劑尼克酰胺和激動劑白藜蘆醇來探索Sirt1在胰腺成體干細胞發(fā)育過程中對細胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)抑制Sirt1的表達后胰腺成體干細胞的成球能力和增殖被抑制，而提高Sirt1的表達后促進了胰腺成體干細胞的增殖。說明miR-217能夠通過Sirt1信號通路來調(diào)節(jié)胰腺成體干細胞的增殖，然而，Sirt1是如何調(diào)控胰腺成體干細胞的增殖還需要進一步探索。

總之，本研究考察了miR-217對胰腺成體干細胞增殖的影響，初步探討了其調(diào)控機制，為胰腺成體干細胞和糖尿病等胰腺疾病的治療奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

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