陳文錦 羅亮 張麗 殷勤偉 徐如祥

神經(jīng)前體細胞（neural progenitor cells，NPCs）具有在特定微環(huán)境下分化為多種成熟神經(jīng)細胞的干細胞特點，是細胞移植治療神經(jīng)退行性疾病的一種理想細胞系。由于通過人腦組織內直接獲取NPCs進行原代培養(yǎng)受器官捐獻及倫理學限制而難以實施，因此，通過人間充質干細胞 （mesenchymal stem cells，MSCs）轉分化為神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）便成為一種理想的替代方式。MSCs是細胞移植治療神經(jīng)退行性病變等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的理想細胞來源[1-3]。然而，這類MSCs在體內或體外特定環(huán)境下誘導轉分化為類神經(jīng)干細胞 （neural stem-like cells，uNSCLs）的分子機制尚不明確[4]。表觀遺傳學的調控是MSCs誘導轉分化為uNSCLs的關鍵，如DNA甲基化、基因組印記、母體效應以及基因沉默等[5-7]。表觀遺傳學將基因型與表現(xiàn)型相互聯(lián)系，對干細胞命運決定、生長分化都起到了關鍵的調控作用[8]。MSCs轉分化過程中，組蛋白乙?；D移酶P300和DNA甲基化轉移酶 3A （DNA methyltransferase，DNMT3A）分別對組蛋白修飾和DNA甲基化起到關鍵性的調控[9]。

E1A樣轉分化抑制蛋白3（E1A-like inhibitor of differentiation 3，EID3）能夠綁定P300/CBP并通過直接結合細胞核受體小異二聚體伴侶分子（small heterodimer partner，SHP）及 SRC1 來抑制 P300/CBP依賴性基因轉錄過程從而調控細胞的轉化、生長和凋亡。DNA甲基化中，DNMT3A參與DNA的從頭甲基化，DNMT3A的功能缺失通常導致小鼠胚胎期死亡，而DNMT3A基因敲除的小鼠則表現(xiàn)為發(fā)育缺陷，在發(fā)育成熟前死亡[13]。同時DNMT3A作為甲基化轉移酶，具有甲基化與去甲基化的雙重作用[14]。研究表明，DNMT3A參與了NPC分化和胚胎期中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程，DNMT3A能夠精確地控制中樞神經(jīng)系統(tǒng)內NPCs的分裂、分化以及細胞的增殖過程[15-17]。然而，對DNMT3A的調控干細胞分裂分化等生理過程的詳細機制尚未明確，同時其與EID3之間可能存在的相互關系也尚未有研究，本研究目的是研究EID3在人臍帶間充質干細胞轉分化為uNSCLs過程關系發(fā)揮的作用以及過程中EID3和DNMT3A之間的。

材料與方法

一、UMSCs的獲取和培養(yǎng)

該研究中人臍帶來源于產婦捐贈，臍帶的使用和實驗目的產婦均知情理解，簽字同意。產婦分娩后捐贈的新鮮臍帶用75%的乙醇消毒30 s，放入Hanks平衡鹽溶液中浸泡1 ～6 h。將臍帶動靜脈去除，然后轉入裝有DMEM/F12培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用無菌眼科剪將臍帶剪成2 ～4 mm3的小塊，加入組織消化液（含0.5 mg/mL膠原酶、0.5%胰蛋白酶和0.5 mg/mL透明質酸酶），37℃培養(yǎng)箱中消化45 ～60 min。消化完畢后，用5 mL槍頭緩和吹打30 s，在用45 μm的濾網(wǎng)過濾消化后的組織，去除消化不完全的大塊組織。濾液經(jīng)離心機250×g離心5 min，用新鮮的DMEM/F12培養(yǎng)基 [含10%胎牛血清 （fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、1%雙抗 （100 U/mL 青霉素、0.1 mg/mL 鏈霉素）]重懸細胞。

二、抗體

實驗所用抗體：（1）一抗：DNMT3A 抗體（Cell Signaling Technology，Beverly，美國），beta-Actin 抗體（Abcam Inc，Cambridge，MA，美國），EID3 抗體（Abcam Inc，Cambridge，MA，美國），CBP/P300 抗體（Cell Signaling Technology，MA，美國），甘油醛-3-磷酸脫氫酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗 體 （Abcam Inc，Cambridge，MA，美 國 ），F(xiàn)ITC-CD34 抗體、FITC-CD29 抗體、FITC-CD106、PECD45、PE-CD44、PE-CD90 抗 體 （BD Biosciences，Piscataway，NJ，美國），根據(jù)廠家推薦濃度稀釋使用；（2）二抗：驢抗兔免疫球蛋白 G（immunoglobulin G，IgG）Alexa Fluor 488、驢抗鼠 lgG Alexa Fluor 568（Thermo Life，Pittsburg，PA，美國）。

三、細胞的培養(yǎng)

UMSCs用含10%FBS、4.5 g/L葡萄糖的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞融合度達80%時進行細胞傳代（0.25%trypsin-EDTA消化細胞，含血清的培養(yǎng)基終止消化），UMSCs在下一步實驗前先傳代2 ～4次。

HEK293用含10%FBS、2 mmol/L谷氨酰胺和1%雙抗 （100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素）的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。

NSCs（SCC007，Millipore，美國）的培養(yǎng)和擴增根據(jù)生產商提供的方案進行。細胞培養(yǎng)皿用層粘連蛋白和多聚賴氨酸包被，用含20 ng/mL堿性成纖維生長因子（basicfibroblastgrowthfactor，bFGF）（PeproTech，美國）、20 ng/mL表皮生長因子 （epidermal growth factor，EGF）（PeproTech，美國）的 ReNCell培養(yǎng)基培養(yǎng)。NSCs種板密度為5×105/mL，實驗中所使用的NSCs均在3 ～10代內。

四、UMSCs轉分化為uNSCL

UMSCs經(jīng)過0.05%的胰酶消化后，以（1.5 ～2.0）×105/cm2密度種植于低粘附培養(yǎng)瓶 （Corning Inc，Lowell，MA，美國），用含 1×N2B27、20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF的NSC細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)3 ～4 d時，離心收集細胞，用細胞消化液Accutase（Sigma，美國）消化細胞，然后再以（1.5 ～2.0）×105/cm2密度種植于低粘附培養(yǎng)瓶。培養(yǎng)7 ～10 d呈神經(jīng)球樣生長的細胞便可用于相關實驗使用。

五、流式細胞實驗

UMSC細胞經(jīng)胰蛋白酶-EDTA處理后，用含1%新生胎牛血清和0.02%疊氮鈉的磷酸緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）溶液清洗 2 遍。樣品采用FACSCalibur流式細胞儀和相應軟件（Becton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ，美國）進行分析，每個樣品納入分析數(shù)目不少于20 000個細胞。

六、質粒

含質粒 EID3（pcDNA3.1-Flag-EID3）和DNMT3A（pcEGFP-C1-DNMT3A）大腸桿菌菌液（Ampicillin 耐藥）購置于北京和元生物科技公司。菌液復蘇后，搖菌24 h，質粒大提試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）提取質粒（實驗步驟根據(jù)廠家說明）。

七、Western blot

總蛋白的提取使用含蛋白酶抑制劑成分RIPA細胞裂解液（Thermo Fisher，Pittsburg，PA，美國），蛋白濃度的測定使用BCA蛋白質檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。等量蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳分離后，電轉至聚偏二氟乙烯膜（Milipore，美國）。5%牛血清白蛋白溶液（bovine serum albumin，BSA）抗原封閉，一抗（EID3、DNMT3A、GAPDH、Flag、EGFP）孵育 4℃過夜，二抗孵育室溫搖床反應1 h，PBS吐溫洗膜液洗膜。條帶使用ECL檢測試劑盒顯影 （GE Healthcare Life Science，Pittsburgh，PA，美國），暗室曝光分析結果。

八、免疫共沉淀實驗

研究uNSCLs細胞內源性EID3和DNMT3A是否能夠免疫共沉淀時，收集uNSCLs細胞總蛋白后，分2組，各500 μg，對照組加入免疫球蛋白G磁珠（Milipore，美國），實驗組中加入 1.5 μL EID3 抗體，混勻4°C冰箱搖過夜，各加入20 μL A/G蛋白磁珠（Santa Cruz，CA，美國）混勻，4℃搖 4 h。 取出后離心小心吸出全部上清，PBS充分洗滌珠子，2×上樣緩沖液 （上海碧云天生物技術有限公司）混勻珠子后95℃煮樣10 min，冷卻后各吸取15 μL進行western blot實驗，檢測DNMT3A。相同方法加入DNMT3A抗體檢測EID3是否被共沉淀。

研究外源性EID3和DNMT3A在HEK293細胞中能夠發(fā)生免疫共沉淀時，向HEK293中轉染pcDNA-EID3（帶Flag標簽）和pcEGFP-DNMT3A（EGFP標簽）質粒，加入Flag抗體后檢測DNMT3A，同理加入EGFP抗體檢測Flag。其他方法步驟同內源性檢測。

九、免疫細胞化學染色和激光共聚焦

細胞以1.5×104/cm2的密度種在已放入經(jīng)多聚賴氨酸包被細胞爬片的12孔細胞培養(yǎng)板中，細胞染色前，以4%多聚甲醛細胞固定液（1×PBS配置）進行細胞固定處理10 min。PBS浸潤洗滌3次，0.25%Triton-X100（5%BSA配置）細胞破膜處理5 min，室溫下5%BSA溶液抗原封閉處理1 h后去除封閉液，加入適量現(xiàn)配工作濃度一抗（EID3、DNMT3A），4℃過夜，一抗洗滌后進行二抗染色，室溫下避光孵育2 h。二抗洗滌，封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察染色結果和分析亞細胞結構染色情況。

十、RNA提取及RT-PCR和qRT-PCR分析

RNA 的提取利用 TRIzol（Invitrogen，美國），實驗步驟根據(jù)廠家說明。提取UMSCs、NSCs和uNSCLs細胞中的總RNA后，再用無RNA酶的DNA酶試劑處理，操作步驟根據(jù)廠家說明。為了評價mRNA的表達水平，總RNA經(jīng)逆轉錄處理，逆轉錄操作試劑盒使用 PrimeScript RT Reagent Kit（TaKaRa，Otsu，日本）。500 ng總RNA用于合成第一條cDNA。逆轉錄系統(tǒng)為Applied Biosystems ViiATM7 System，后續(xù)擴增使用SYBR Green PCR Master mix（TaKaRa，Otsu，日本）。

十一、統(tǒng)計學分析

采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學處理，實驗結果均以均數(shù)±標準差（±s）表示，2組組間比較采用兩獨立樣本的t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、誘導轉分化后的uNSCLs表現(xiàn)出NSC的細胞特點

UMSC經(jīng)過4 ～6代后，通過特定培養(yǎng)條件下（見實驗方法），細胞逐漸表現(xiàn)出NSCs的成球成長特征，體外培養(yǎng)的uNSCLs細胞倍增時間約為2.6 d，連續(xù)體外培養(yǎng)細胞形態(tài)學至少能維持8周時間 （圖1A ～B）。同時，相比較UMSCs，uNSCLs高表達NSCs的 相 關 mRNA： 在 NESTIN、PAX6、VIMENTIN、GFAP、MUSASHI1和NEUROD1基因mRNA的水平上增加了3 ～13.2倍，差異具有統(tǒng)計學意義（t=9.925、14.089、4.303、8.994、10.122、22.327、1.876；P=0.018、0.0005、0.026、0.0003、0.017、0.002、0.258，圖 1C）。

圖1 UMSCs和由UMSCs轉分化而來的uNSCLs細胞形態(tài)及免疫學特征

二 、EID3 和 DNMT3A 在 uNSCL、UMSCs 和NSCs細胞中的表達變化

為了研究uNSCLs細胞中甲基化和乙?；钢g的關系，通過qRT-PCR檢測相關表觀遺傳學基因的表達情況， 包括 DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、HDAC1、P300、EID1和 EID3。結果顯示 DNMT3A 在uNSCLs和NSC中的表達量明顯高于UMSCs，具有統(tǒng)計學差異 （tuNSCLs=7.453，PuNSCLs=0.006；tNSCs=12.924，PNSCs=0.001）（圖 2A）。 隨后，檢測 UMSC、uNSCLs和NSC細胞中DNMT3A和EID3的蛋白表達水平。結果顯示，DNMT3A和EID3在上述細胞中的蛋白表達量呈現(xiàn)相反的趨勢，在UMSC中，EID3高表達而DNMT3A低表達；經(jīng)過誘導轉化后的uNSCLs與UMSC比較，EID3表達量降低而DNMT3A的表達量升高；NSCs與uNSCLs比較，EID3的表達量進一步降低，并且DNMT3A的表達量進一步升高（圖2B ～C）。

圖2 UMSCs、uNSCLs、NSCs中表觀遺傳基因mRNA水平比較及EID3和DNMT3A蛋白水平比較

圖3 EID3和DNMT3A在UMSCs、uNSCLs、NSCs中免疫熒光情況

亞細胞水平表達定位研究發(fā)現(xiàn)，EID3和DNMT3A都優(yōu)先在細胞核中富集，而后，EID3在細胞漿和細胞核中均有表達，而DNMT3A則大部分表達在細胞核中，與EID3存在共定位表達現(xiàn)象（圖3）。

三、EID3直接結合DNMT3A

通過免疫共沉淀實驗進一步檢測EID3和DNMT3A之間確切關系，EID3抗體能夠將uNSCLs細胞總蛋白中DNMT3A蛋白沉淀下來，并且DNMT3A抗體也能夠將uNSCLs細胞總蛋白中EID3蛋白沉淀下來 （圖4A）。這部分實驗證明，在uNSCLs細胞中，EID3和DNMT3A之間存在直接結合作用。

為了進一步驗證細胞內EID3與DNMT3A蛋白之間能夠直接結合，本研究在HEK293細胞系中共轉染表達EID3（Flag標簽）和DNMT3A（EGFP標簽）的外源性質粒，外源性轉染基因表達蛋白的免疫共沉淀實驗結果發(fā)現(xiàn)，外源性Flag-EID3與pEGFPDNMT3A之間同樣能夠相互沉淀下來。這就說明，外源性EID3和DNMT3A蛋白同樣存在直接結合的現(xiàn)象（圖 4B）。

討 論

圖4 EID3和DNMT3A免疫共沉淀

成熟神經(jīng)細胞因其有限的自我更新能力，移植NSCs成為神經(jīng)退行性病變的一種理想可行的治療方案。目前，NSCs移植治療在再生醫(yī)學領域實際應用尚存在許多未能解決的難題，其中最大難題在于如何快速獲取大量的NSCs[18]。直接提取uNSCLs進行原代培養(yǎng)擴增因存在諸多限制，實際操作無法實現(xiàn)。幸運的是，人類干細胞轉分化領域大量研究成果表明，MSCs為NSCs的大量獲取提供了可能。MSCs來源豐富，容易分離培養(yǎng)，細胞增殖速度快，并且研究已經(jīng)表明MSCs能夠在較短的時間內通過人工誘導轉分化，從而獲取大量具有NSCs功能特性的一種uNSCLs樣細胞[19,20]。然而，關于MSCs是否能夠在不引入外源性轉錄因子而自然的轉分化為uNSCLs的問題，仍然存在許多爭論。

在本研究中，由UMSCs轉分化而來的uNSCLs，能夠6次以上進行傳代而保持自身細胞特征的穩(wěn)定性。筆者認為，uNSCLs體現(xiàn)的是MSCs轉分化為NSCs的一種中間狀態(tài)，理由如下：（1）在無血清培養(yǎng)基中，UMSCs傾向聚集成球生長，但是這并不等同于NSC/NPC神經(jīng)球，因為后者成球生長的原因是因其自身的細胞增殖所致；（2）盡管uNSCLs細胞表達許多NSCs的細胞表面蛋白和轉錄因子標記物，但是一些重要的NSCs標記物并沒有顯著表達，如SOX2。雖然存在以上的問題，uNSCLs仍然表現(xiàn)出了類似NSCs的諸多特性，uNSCLs細胞能夠成球狀增殖，并且表達NSCs相關標記蛋白，同時能夠進一步分化為不同類型的神經(jīng)細胞。因此，筆者認為uNSCLs細胞作為MSCs轉分化為NSCs研究的細胞模型具有重大的價值。

在體細胞的重編碼的過程中，DNA甲基化和去甲基化平衡能夠維持DNA的甲基化譜，但其中去甲基化的機制尚不明確。相關研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，DNMT3A作為一個從頭甲基化酶，卻能表現(xiàn)出脫羥基甲基化酶活性[21,22]。然而，在細胞的轉分化過程中，DNMT3A是如何協(xié)調自身甲基化和去甲基化雙重作用尚不得知。筆者檢測EID3和DNMT3A分別在uNSCLs、UMSCs和NSCs中的表達水平，結果發(fā)現(xiàn)，EID3和DNMT3A之間的表達水平存在相關關系，在UMSCs轉分化為uNSCLs之前，細胞高表達EID3而低表達DNMT3A；UMSCs轉分化為uNSCLs之后，細胞低表達EID3而高表達DNMT3A。隨后，本研究進一步發(fā)現(xiàn)了EID3在UMSCs轉分化的過程中直接結合了DNMT3A。因此，EID3很可能參與調控了DNMT3A所表現(xiàn)出的甲基化和去甲基化雙重功能的轉變過程，調控了UMSCs轉分化為uNSCLs過程中DNA重編碼中的甲基化和去甲基化平衡。

EID3作為組蛋白乙?；窹300抑制蛋白，能夠直接結合甲基化轉移酶DNMT3A，并調控DNMT3A的功能狀態(tài)，反映了MSCs轉分化過程中存在復雜的外源性調控，且需要更加全面地進行多種因素研究來進一步探索干細胞轉分化機制。

[1] Zuk PA,Zhu M,Ashjian P,et al.Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells[J].Mol Biol Cell,2002,13(12):4279-4295.

[2] Buzanska L,Jurga M,Stachowiak EK,et al.Neural stem-like cell line derived from a nonhematopoietic population of human umbilical cord blood[J].Stem Cells Dev,2006,15(3):391-406.

[3] Hsueh YY,Chiang YL,Wu CC,et al.Spheroid formation and neural induction in human adipose-derived stem cells on a chitosan-coated surface[J].Cells Tissues Organs,2012,196(2):117-128.

[4] 彭鋼,陳建泉,朱劍虹.異體神經(jīng)干細胞腦移植后免疫排斥反應的研究[J].中華神經(jīng)醫(yī)學雜志,2010,9(8):785-788.

[5] Mung KL,Tsui YP,Tai EW,et al.Rapid and efficient generation of neural progenitors from adult bone marrow stromal cells by hypoxic preconditioning[J].Stem Cell Res Ther,2016,7(1):146.

[6] Hermann A,Gastl R,Liebau S,et al.Efficient generation of neural stem cell-like cells from adult human bone marrow stromal cells[J].J Cell Sci,2004,117(Pt 19):4411-4422.

[7] 張永彪,褚嘉祐.表觀遺傳學與人類疾病的研究進展[J].遺傳,2005,27(3):466-472.

[8] 高亮,章小清.神經(jīng)干細胞與創(chuàng)傷性顱腦損傷后的神經(jīng)修復[J].中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志,2015,1(3):41-44.

[9] Ozkul Y, Galderisi U. The Impact of Epigenetics on Mesenchymal Stem Cell Biology[J].J Cell Physiol,2016,231(11):2393-2401.

[10] Miyake S,Sellers WR,Safran M,et al.Cells degrade a novel inhibitor of differentiation with E1A-like properties upon exiting the cell cycle[J].Mol Cell Biol,2000,20(23):8889-8902.

[11] Ji A,Dao D,Chen J,et al.EID-2,a novel member of the EID family of p300-binding proteins inhibits transactivation by MyoD[J].Gene,2003,318:35-43.

[12] B?vner A,Matthews J,Sanyal S,et al.EID3 is a novel EID family member and an inhibitor of CBP-dependent co-activation[J].Nucleic Acids Res,2005,33(11):3561-3569.

[13] Okano M,Bell DW,Haber DA,et al.DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development[J].Cell,1999,99(3):247-257.

[14] MétivierR,GallaisR,TiffocheC,etal.CyclicalDNA methylation of a transcriptionally active promoter[J].Nature,2008,452(7183):45-50.

[15] Wu Z,Huang K,Yu J,et al.Dnmt3a regulates both proliferation and differentiation of mouse neural stem cells[J].J Neurosci Res,2012,90(10):1883-1891.

[16] Colquitt BM,Markenscoff-Papadimitriou E,Duffie R,et al.Dnmt3a regulates global gene expression in olfactory sensory neurons and enables odorant-induced transcription[J].Neuron,2014,83(4):823-838.

[17] Tatton-Brown K,Seal S,Ruark E,et al.Mutations in the DNA methyltransferase gene DNMT3A cause an overgrowth syndrome with intellectual disability[J].Nat Genet,2014,46(4):385-388.

[18] 賀曉生.神經(jīng)干細胞移植在創(chuàng)傷性腦損傷再生與修復中的作用和影響因素[J].中華神經(jīng)外科疾病研究雜志,2012,11(1):1-3.

[19] Leite C,Silva NT,Mendes S,et al.Differentiation of human umbilical cord matrix mesenchymal stem cells into neural-like progenitor cells and maturation into an oligodendroglial-like lineage[J].PLoS One,2014,9(10):e111059.

[20] Shahbazi A,Safa M,Alikarami F,et al.Rapid induction of neural differentiation in human umbilical cord matrix mesenchymal stem cells by cAMP-elevating agents[J].Int J Mol Cell Med,2016,5(3):167-177.

[21]Chen CC,Wang KY,Shen CK.The mammalian de novo DNA methyltransferases DNMT3A and DNMT3B are also DNA 5-hydroxymethylcytosine dehydroxymethylases[J].J Biol Chem,2012,287(40):33116-33121.

[22] Kangaspeska S,Stride B,Métivier R,et al.Transient cyclical methylation of promoter DNA[J].Nature,2008,452(7183):112-115.