李夢蘭 帥世全 黨萬太, 何馨怡 孫紅兵 李天紅 楊婧 銀小雙 周京國

(1. 南充市中心醫(yī)院·川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院風(fēng)濕免疫科， 四川 南充 637000；2.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院， 四川 成都 610500)

痛風(fēng)是一種單鈉尿酸鹽沉積于組織或器官，引起急、慢性炎癥和組織損傷的臨床綜合征，與嘌呤代謝紊亂及(或)尿酸排泄減少所致的高尿酸血癥直接相關(guān)[1-2]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，痛風(fēng)患病率呈明顯的性別差異，痛風(fēng)患者中95%為男性，初次發(fā)作年齡一般為40歲以后，而女性痛風(fēng)大多出現(xiàn)在絕經(jīng)后[3]。De Souza等[4]對男女性痛風(fēng)患者研究發(fā)現(xiàn)，女性痛風(fēng)發(fā)病年齡平均比男性晚7年。Hak等[5]研究也發(fā)現(xiàn)自然絕經(jīng)的婦女，45歲前絕經(jīng)比50～55歲絕經(jīng)患痛風(fēng)的概率高，且絕經(jīng)后使用女性激素能在一定程度上降低患痛風(fēng)的危險(xiǎn)性。有研究表明，女性體內(nèi)的17β-雌二醇可使細(xì)胞器的磷脂膜抵抗尿酸鹽結(jié)晶沉淀，故雌激素可能對腎臟排泄尿酸有促進(jìn)作用[6]，資料提示雌激素可能在痛風(fēng)的發(fā)病中發(fā)揮了作用，但作用機(jī)制，目前尚未見到相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用CMIA檢測痛風(fēng)患者、高尿酸血癥患者、健康體檢者血清中雌二醇(Estradiol, E2)水平。同時(shí)通過RT-qPCR檢測其PBMCs中ERβ mRNA的表達(dá)水平，并分析兩者之間的相關(guān)性，探討雌激素及其受體ERβ在原發(fā)性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中的變化及其可能的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 36例男性原發(fā)性急性期痛風(fēng)患者(AG組)，年齡21～61歲，平均(42±10)歲；36例男性原發(fā)性間歇期痛風(fēng)患者(IG組)，年齡22～67歲，平均(44±13)歲；37例男性原發(fā)性慢性期痛風(fēng)患者(CG組)，年齡23～57歲，平均(43±8)歲均來自南充市中心醫(yī)院風(fēng)濕免疫科和川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科2015年12月～2016年12月門診或住院患者，所有患者均符合1977年ACR制定的痛風(fēng)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7],并排除腎臟疾病、血液疾病、藥物等引起的繼發(fā)性痛風(fēng)。另選38名男性健康體檢者(HC組)，年齡28～67歲，平均(42±8)歲和44例無癥狀高尿酸血癥(HUA組)患者，年齡25～66歲，平均(40±11)歲，均來自同期南充市中心醫(yī)院體檢中心和川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢中心。五組間年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有參與者均簽署知情同意書并得到南充市中心醫(yī)院和川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要試劑與儀器 人淋巴細(xì)胞分離液LS1077(天津?yàn)笊锕?，Trizol(Invitrogen公司, 美國)，Loading buffer(TaKaRa公司，日本)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司，日本)，RT-PCR試劑盒(TaKaRa公司，日本)，ERβ、內(nèi)參β肌動(dòng)蛋白基因引物(上海生工生物工程有限公司)，LH750血細(xì)胞分析儀(Beckman公司，美國)，DxC800生化分析(Beckman公司，美國)，低溫高速離心機(jī)5417R(Eppendorf公司，美國)，雅培化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(ABBOTT公司，美國)，紫外分光光度儀(Thermo Fisher公司，美國)，7900Real-Time PCR儀(Applied Biosystem公司，美國)。

1.2.2 標(biāo)本采集與處理 所有病例均空腹抽取外周靜脈血3ml，肝素抗凝，2000r/min，離心5min，分離血漿，-80℃保存，為檢測血清E2水平備用，另一部分血液采用人淋巴細(xì)胞分離液提取外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，加Trizol以提取PBMCs中總RNA，紫外分光光度儀測定吸光度(A)260/280(1.8～2.0者采用)。按照TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，取總RNA 2ul，5gDNA Eraser Buffer 4ul，gDNA Eraser 2ul, RNase Free dH2O 12ul于離心管混合，室溫反應(yīng)30min，再加入配制好的Master Mix，包括PrimeScript RT Enzyme Mix2ul，RT Primer Mix2ul，5PrimeScript Buffer 2 8ul，RNase Free dH2O 8ul，置于PCR儀中， 37℃15 min 85℃5sec,4℃ 60min，終止反應(yīng)，將反轉(zhuǎn)錄cDNA凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 常規(guī)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的測定 常規(guī)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)測定均在南充市中心醫(yī)和川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科完成。包括WBC、HGB、GR、MO、CRP、AST、ALT、ESR、UA、TCH、TG、GLU、HDL-C、LDL-C、apoA1等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。

1.2.4 血清E2水平檢測 將收集血漿室溫溶解，震蕩混勻后，12000r/min，離心10min。送川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測法檢測血清中E2水平。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測PBMCs中ERβ、β-actin mRNA的表達(dá)水平 所有基因?qū)?yīng)引物由上海生工生物有限公司合成，基因名稱和上、下游引物序列和產(chǎn)物長度(表1)。在QuantStudioTM12k Flex實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)上進(jìn)行Realtime-PCR，反應(yīng)體系為： 10ul Power SYBR Green PCR Master Mix，ROX D也0.4ul，上下游引物各0.15ul，cDNA 2ul，ddH2O補(bǔ)充至20ul。反應(yīng)條件為：95℃ 30sec，95℃ 5sec，60℃ 34sec，共40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后作溶解曲線，每份標(biāo)本均設(shè)復(fù)孔。以目的基因的Ct值減去內(nèi)參基因的Ct值為Ct，2-Ct值表示目的基因mRNA表達(dá)的高低[8-9]。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物Table 1 Real time quantitative PCR primers

2 結(jié)果

2.1 臨床資料比較 痛風(fēng)組(AG組、IG組、CG組)和HUA組尿酸、TG均高于HC組(P<0.05)，且痛風(fēng)組ALT、AST均高于HUA和HC組(P<0.05)。AG組WBC顯著高于其他四組(P<0.05)。CG組Urea、Crea、VLDL-C、apoB1、CysC高于其他四組(P<0.05)。AG組中ESR、GR、LY、MO、ALT、AST、VLDL-C和血糖均高于HC組(P<0.05)，但其HGB、HDL-C、LDL-C卻低于HC組(P<0.05)。AG組GR、MO均高于IG、CG組(P<0.05)。IG組GR、VLDL-C、apoB1、CysC均高于HC組(P<0.05)。IG組apoA1高于AG組(P<0.05)，而其ESR、HDL-C低于AG組(P<0.05)。CG組ESR、GR、MO、GLU均高于HC組(P<0.05),其LY、apoA1低于HC組(P<0.05)，見表2。

表2 HC、HUA、AG、IG、CG組臨床資料分析Table 2 Analysis of the clinical data of group HC, HUA, AG, IG and CG

組別nPLT(×109/L)UA(μmol/L)Urea(mmol/L)Crea(umol/L)ALT(U/L)AST(U/L)TG(mmol/L)HC組38195±453483±44247±11③78±10③21±923±5129±044HUA組44188±424877±375①54±12②81±11③30±1525±7190±085①AG組36197±744931±1190①45±11③79±13③41±54①35±9①④167±085③IG組36193±584855±1298①50±16③85±22③36±23①33±8①④212±092①CG組37189±884611±1507①60±2796±2830±1735±11①④223±132aF01169025321242882058169804883P0989<001<001<0010071<001<001

組別nHDL?C(mmol/L)LDL?C(mmol/L)VLDL?C(mmol/L)apoAl(g/L)apoBl(g/L)CysC(mg/L)GLU(mmol/L)HC組38135±026③281±076②036±012③122±013074±02207±01490±070②③HUA組44129±034③301±085②030±003③114±063①083±016③07±02509±067②③AG組36123±023①③248±048060±024①③④116±013080±016③08±02③581±227IG組36109±112①②④260±068④07±025①③④123±013②③④085±021①③09±03①③④542±064CG組37102±098283±076②093±025113±019①112±021①12±05①④563±141F11778311947403336715088119223444P<001<001<001<001<001<001<001

注：ESR：血沉，GR：中性粒細(xì)胞，LY：淋巴細(xì)胞，MO：單核細(xì)胞，HGB：血紅蛋白，UA：血尿酸，ALT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶，AST：谷草轉(zhuǎn)氨酶，HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇，LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇，VLDL-C：極低密度脂蛋白膽固醇，apoA1：載脂蛋白A1，apoB1：載脂蛋白B100，CysC：胱抑素，GLU：血糖。與HC組比較，①P<0.05；與AG組比較，②P<0.05；與CG組比較，③P<0.05；與HUA組比較,④P<0.05

2.2 血清E2變化與臨床資料的相關(guān)性分析 HC組血清中E2水平顯著高于HUA、AG、IG、CG組(P<0.05)。AG組E2水平低于HUA、IG、CG組(P<0.05)。IG組E2水平低于HUA組(P<0.05)。CG組與HUA組和IG組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)HUA組E2水平與PLT、VLDL-C、apoB1呈正相關(guān)，與apoA1呈負(fù)相關(guān)，AG組E2水平與Crea呈正相關(guān)，CG組E2水平與UA呈正相關(guān)，見表3、表4。

表3 HC、HUA、AG、IG、CG組血清E2水平(M±Q)Table 3 Serum E2 levels in HC, HUA, AG, IG and CG groups

注：與HC組比較，①P<0.05；與AG組比較，②P<0.05；與IG組比較，③P<0.05

表4 HUA、AG、IG、CG組血清E2水平與臨床資料相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of serum E2 levels in HUA, AG, IG and CG groups with clinical data

項(xiàng)目HUAAGIGCGrPrPrPrPALT?0039080200040983?01880271?01050537AST00620688?0063071700220898?00290866TG?0153032300080961?0210021901210476HDL?C?01650285?02210195?0246014902320167LDL?C0073063602180202?0176030501250463VLDL?C0391000901490387?0081063702480139apoA1?0322003302930083?00430804?00240889apoB10361001602100218?0067069700360833cysC?0043078301270461?01190491?00500770GLU?01020512?0129045200320855?00790643

2.3 PBMCs中ERβ mRNA的表達(dá)變化 在外周血中，HC組ERβ mRNA表達(dá)水平均高于AG、IG、CG組(均P<0.05)。HUA組ERβ mRNA表達(dá)水平均高于AG、IG、CG組(均P<0.05)。AG組ERβ mRNA表達(dá)水平低于IG組(均P<0.05)。CG組與AG組和IG組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)HC、HUA、AG、IG、CG組E2水平與ERβ mRNA水平間均無相關(guān)性(均P>0.05)，見表5、表6。

表5HC、HUA、AG、IG、CG組PBMCs中ERβmRNA的表達(dá)水平(M±Q)

Table5ExpressionlevelofERβmRNAinPBMCsofgroupHC,HUA,AG,IGandCG

組別nERβmRNAHC組380006258±0004310HUA組440004760±0003902AG組360003382±0002533①②IG組360004086±0002812①②③CG組370003451±0002588①②F12090P<001

注：與HC組比較，①P<0.05；與HUA組比較，②P<0.05；與AG組比較，③P<0.05

表6 HC、HUA、AG、IG、CG組E2水平與ERβ mRNA水平相關(guān)性分析Table 6 Correlation analysis of E2 level with ERβ mRNA in HC, HUA, AG, IG and CG groups

3 討論

近年來，在世界范圍內(nèi)痛風(fēng)的發(fā)病率呈逐年升高的趨勢，國內(nèi)痛風(fēng)的患病率為0.15%～0.67%[10-11]。我國痛風(fēng)患者平均年齡為48.28歲(男性47.95歲，女性53.14歲)，男：女為15：1，且隨著生活習(xí)慣、飲食結(jié)構(gòu)等的改變，女性患痛風(fēng)比例呈上升趨勢，且多發(fā)生于絕經(jīng)后[12-14]。這與絕經(jīng)后女性體內(nèi)雌激素水平下降可能有關(guān)[15]。

雌激素是一類具有廣泛生物活性的類固醇化合物，男性和絕經(jīng)后的女性可以在一些非性腺的器官或組織以旁分泌或自分泌的形式合成雌激素并在局部發(fā)揮作用[16]。許多研究都提示雌激素能抑制細(xì)胞免疫和刺激體液免疫，在細(xì)胞核內(nèi)，其主要調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和產(chǎn)生的蛋白質(zhì)來確定性類固醇激素的細(xì)胞生物學(xué)行為[17]。雌激素受體(Estrogen receptor，ER)是屬于甾體激素受體大家族中的核受體超家族成員，由17β-雌二醇激活，可介導(dǎo)雌激素發(fā)揮其生物學(xué)功能[18]。ERβ為其核受體之一，現(xiàn)已被證明了在多源卵巢顆粒細(xì)胞膜、腎、腦、骨、心、肺、腸粘膜、前列腺癌、內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)[19-20]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在兔的軟骨細(xì)胞中E2可顯著抑制IL-1β誘導(dǎo)的p65的DNA結(jié)合活性[21]。Hirano等[22]發(fā)現(xiàn)，在Jurkat細(xì)胞及外周血T淋巴細(xì)胞中，E2在生理性高濃度下可通過ERβ增強(qiáng)NF-κB及DNA的活性，抑制T細(xì)胞的凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)，用雌激素替代療法治療絕經(jīng)后合并高尿酸血癥的女性，其尿酸水平下降，提示雌激素可能有促進(jìn)尿酸排泄作用[22-23]。早在20世紀(jì)國外就有學(xué)者研究男女性痛風(fēng)患者血漿性激素水平，發(fā)現(xiàn)痛風(fēng)患者血漿E2水平顯著低于健康體檢者[24]。之后Mukhin等[25]研究發(fā)現(xiàn)男性痛風(fēng)患者E2合成減少，可能是由于高尿酸血癥調(diào)節(jié)下丘腦的激素分泌,導(dǎo)致促卵泡激素生成減少，進(jìn)而限制了雌激素的生成。本研究結(jié)果顯示HC組血清E2水平高于HUA組、痛風(fēng)組(AG、IG、CG組)，HUA組又高于AG、IG組，五組中AG組血清E2水平最低，CG組處于HUA組與IG組間，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此研究結(jié)果與前面相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道痛風(fēng)患者E2水平低于正常人的結(jié)果是一致的。當(dāng)細(xì)化痛風(fēng)患者分組后我們發(fā)現(xiàn)，痛風(fēng)患者在急性發(fā)作期時(shí)血清E2降低尤為明顯，說明E2很可能參與了痛風(fēng)的發(fā)生和發(fā)展過程。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，HUA組E2水平與PLT、VLDL-C、apoB1呈正相關(guān)，與apoA1呈負(fù)相關(guān)，AG組E2水平與Crea呈正相關(guān)，CG組E2水平與UA呈正相關(guān)。此結(jié)果表明，E2可能與體內(nèi)脂蛋白、尿酸的水平和腎臟功能有關(guān)，但也可能是樣本差異原因出現(xiàn)此結(jié)果，所以還需進(jìn)一步擴(kuò)大、分選樣本來證實(shí)。本研究還顯示，在外周血中，HC、HUA組ERβ mRNA表達(dá)水平均顯著高于痛風(fēng)組(AG、IG、CG組)，AG組低于IG組，HC組與HUA組、CG組與AG組和IG組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。此結(jié)果與其血漿中各組E2表達(dá)水平基本吻合。但相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)HC、HUA、AG、IG、CG組E2水平與ERβ mRNA表達(dá)水平間均無相關(guān)性(均P>0.05)。說明在痛風(fēng)患者中E2及其受體ERβ的表達(dá)水平均是降低的，而在急性發(fā)作期降低尤為明顯，提示雌激素及其受體ERβ可能參與了痛風(fēng)的發(fā)生發(fā)展，但具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本文研究結(jié)果顯示，痛風(fēng)患者雌激素及其受體ERβ表達(dá)水平降低，提示其可能參與了痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展；其有望為痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的臨床診斷、治療與預(yù)防提供新途徑。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Krishnan E, Akhras KS, Sharma H,etal. Relative and attributable diabetes risk associated with hyperuricemia in US veterans with gout [J]. QJM, 2013, 106(8): 721-729.

[2]Hainer BL, Matheson E, Wilkes RT. Diagnosis, treatment and prevention of gout [J]. Am Fam Physician, 2014, 90(12) :831-836.

[3]Hak AE, Choi HK. Menopause, postmenopausal hormone use and serum uric acid levels in US Women-the Third National Health and Nutrition Examination Survey[J]. Arthritis Res Ther, 2008, 10(5): R116.

[4]De Souza AW, Fernandes V, Ferrari AJ. Female gout:clinical and laboratory features[J]. Rheumatol, 2005, 32(11): 2186-2188.

[5]Hak AE, Curha n GC, Grodstein F,etal. Menopause, postmenopausal hormone use and risk of in cident gout[J]. AnnRheumDis, 2010, 69( 7) : 1305-1309.

[6]Tsai EC, Boyko EJ, Leonetti DL, et a1, Low sernnl testosterone level as a predictor of increased visceral fat in Japanese-American men [J]. Int J Obes Relat Metab Disord, 2000, 24(4):485-491.

[7]Wallace SL, Robinson H, Masi AT,etal. Preliminary criteria for the classification of the acute arthritis of primary gout [J]. Arthritis Rheum, 1977, 20(3): 895-900.

[8]Schmittgen TD, Livak KJ. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method [J]. Nat Protoc, 2008, 3(6): 1101-1108.

[9]Elgar G, Vavouri T. Tuning in to the signals: noncoding sequence conservation in vertebrate genomes [J]. Trends Genet, 2008, 24(7): 344-352.

[10] Weaver AL. Epidemiology of gout [J]. Cleve Clin J Med, 2008, 75(5): S9-12.

[11] Lee SJ, Hirsch JD, Terkeltaub R,etal. Perceptions of disease and health-related quality of life among patients with gout[J]. Rheumatology (Oxford), 2009, 48(5): 582-586.

[12] Wallace KL, Riedel AA, Joseph-ridge N,etal. Increasing prevalence of gout and hyperuricemi over 10 years among older adults in a managed care population[J]. Jrheu-matol, 2004, 31(8): 1582-1587.

[13] Chiou W K, Wang M H, Huangd H,etal. The relationship between serum uric acid level and metabolic syndrome: differences by sex and age in Taiwanese [J]. Journal of Epidemiology, 2010, 20(3): 219-224.

[14] Jansen Dirken-Heukensfeldt KJM, Teunissen TAM, Van de Lisdonk EH,etal. Clinical features of women with gout arthritis: a systematic review [J]. Clinical Rheumatology, 2010, 29(6): 575-582.

[15] Suminoh H, Ichikawa, S, Kanda T,etal. Reduction of serum uric acid by hormone replacement therapy in postmenopausal women with hyperuricaemia[J]. LANCET, 1999, 345(9179): 650-652.

[16] Simpson ER. Sources of estrogen and their importance[J]. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 2003, 86: 225-230.

[17] Levin ER. Integration of the extranuclear and nuclear actions of estrogen[J]. Molecular Endocrinology, 2005, 19(8): 1951-1959.

[18] Dahlman-Wright K, Cavailles V, Fuqua SA,etal. International Union of Pharmacology. LXIV. Estrogen receptors[J]. Pharmacol Rev, 2006, 58(4): 773-781.

[19] Babiker FA, De Windt LJ, van EickelsM,etal. Estrogenic hormone action in the heart: regulatory network and function[J]. Cardiovascular Research, 2002, 53(3): 709-719.

[20] Younes M, Honma N. Estrogen receptorβ[J]. Arch Pathol Lab Med, 2011, 135(1): 63-66.

[21] Richette P, Dumontier MF, Tahiri K,etal. Oestrogens inhibit interleukin 1beta-mediated nitric oxide synthase expression in articular chondrecytes through nuclear factor-kappa B impairment[J]. Ann Rheum Dis, 2007, 66(3): 345-350.

[22] Hirano S, Furutama D, Hanafusa T. Physiologically high concentrations of 17beta-estradiol enhance NF-kappaB activity in human T cells[J]. Am J Physiol Regnl Integr Comp Physiol, 2007, 292(4): R1465-1471.

[23] Mikuls T R, Farrar J T, Bilker W B,etal. gout epidemiology: results from the UK general Practice Research Database, 1990-1999[J]. Ann Rheum Dis, 2005, 64(2): 267-272.

[24] Enrico M, Giuseppe RS, Roberto M,etal. Plasma follicle-stimulating hormone, luteinizing hormone, and sex hormones in patients with gout[J]. Arthritis and Rheumatology, 1985, 28(2): 127-131.

[25] Mukhin IV, Ignatenko GA, Nikolenko VY. Dyshormonal disorders in gout: experimental and clinical studies[J]. Bull ExpBiolMed, 2002, 133(4): 493-591.