陳韌剛，魯 艷，魏三舟，孫 飛，李 敏

(1.湖北省孝感市孝昌縣第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 432900;2.湖北省孝感市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科 432100)

乙型肝炎是全世界常見的傳染病之一，如今我國仍是感染乙型肝炎病毒(HBV)最多的國家，據(jù)統(tǒng)計(jì)有9 000萬人感染HBV，其中的1/4發(fā)展成慢性乙型肝炎，與HBV感染相關(guān)的肝硬化和肝癌嚴(yán)重威脅患者的生命安全[1-2]。乙型肝炎患者的病程進(jìn)展受多階段、多因素綜合影響，有研究表明乙型肝炎的發(fā)展與患者的自身免疫應(yīng)答、肝細(xì)胞損傷和炎性反應(yīng)有關(guān)。感染HBV的患者體內(nèi)出現(xiàn)多種自身抗體，如抗核抗體(ANA)、抗平滑肌抗體(ASMA)、抗肝腎微粒體(LKM)等[3]。在肝炎患者治療過程中，一些患者會(huì)出現(xiàn)耐藥突變情況，這影響了治療效果[4]。本研究主要選取慢性乙型肝炎患者，探討其自身抗體與基因分型及耐藥突變的相關(guān)因素的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年4月至2017年4月孝昌縣第一人民醫(yī)院慢性乙型肝炎患者216例，其中男164例，女52例，平均年齡44.6歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者診斷符合慢性乙型肝炎防治指南(2014年版)的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 患者入院次日清晨空腹采集靜脈血3 mL，離心分離血清-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2標(biāo)本檢測 (1)自身抗體檢測：ANA、ASMA和LKM檢測采用間接免疫熒光法，待檢血清起始稀釋濃度為 1∶100，將稀釋血清與生物載片共同孵育 30 min，洗滌后加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的抗人免疫球蛋白抗體孵育 30 min，洗片、封片后熒光顯微鏡觀察結(jié)果?？箍扇苄愿慰乖?肝-胰抗體(抗SLA/LP)、抗肝細(xì)胞溶質(zhì)抗原Ⅰ型抗體(抗LC-1)和抗線粒體抗體Ⅱ型(AMA-M2)采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測，將待測血清1∶100稀釋后加入印跡膜條，室溫?fù)u床30 min，洗膜后加酶標(biāo)記二抗，室溫?fù)u床30 min，洗膜后顯色10 min，終止觀察結(jié)果。試劑盒購自德國(歐蒙)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷有限公司。

(2)HBV基因分型檢測：采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和Taqman熒光探針技術(shù)(FAM 標(biāo)記的B型特異性探針和HEX標(biāo)記的C型特異性探針)同時(shí)檢測標(biāo)本基因B型和C型。

(3)耐藥突變位點(diǎn)檢測：HBV P區(qū)擴(kuò)增在PCR擴(kuò)增引物下完成，將擴(kuò)增產(chǎn)物純化處理后進(jìn)行測序和基因分型、耐藥突變位點(diǎn)檢測。測序后突變應(yīng)用BLAST、DNAstar GeneBank等軟件來確定突變位點(diǎn)。主要對(duì)rt204、rt181、rt236等耐藥位點(diǎn)進(jìn)行分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件處理本研究所有數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以n或%表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1自身抗體檢測結(jié)果 216例患者自身抗體檢測結(jié)果，見圖1。216例患者中至少檢測出1種的患者有89例，總陽性率為41.2%。其中以ANA陽性為主，有58例，以低滴度1∶100為主；LKM陽性13例；AMA-M2陽性12例；ASMA陽性7例；抗SLA/LP陽性3例；抗LC陽性4例。

圖1 自身抗體檢測結(jié)果

表1 自身抗體在兩種基因型中分布

2.2HBV基因分型結(jié)果及自身抗體分布 HBV分型結(jié)果顯示，216例患者中B型有30例(13.9%)，男18例，女12例；C型有186例(86.1%)，男128例，女58例。自身抗體在兩種基因型中分布見表1。在自身抗體總陽性對(duì)比中，基因型B型和C型比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；各種類型自身抗體比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3HBV P區(qū)基因逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)的序列突變及耐藥情況 216例患者中共發(fā)現(xiàn)耐藥突變的患者有39例，變異率為18.1%。各耐藥相關(guān)位點(diǎn)突變基因型分布見表2?？偰退幬稽c(diǎn)在兩個(gè)基因型中分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；各位點(diǎn)在兩個(gè)基因型中分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各耐藥相關(guān)位點(diǎn)突變基因型分布

3 討 論

HBV感染后患者出現(xiàn)急性肝炎的可能性低，患者極易慢性化，隨著慢性乙型肝炎的發(fā)展，患者逐漸轉(zhuǎn)變成肝硬化，更嚴(yán)重的轉(zhuǎn)變?yōu)楦伟5]。HBV在感染患者的同時(shí)，也會(huì)通過多種反應(yīng)來影響機(jī)體的免疫系統(tǒng)，損害機(jī)體的免疫耐受性，誘導(dǎo)發(fā)生自身免疫反應(yīng)，加劇肝細(xì)胞損壞，使病情遷延不愈，增加治療難度[6-7]。之前，關(guān)于慢性乙型肝炎患者出現(xiàn)自身抗體的報(bào)道較多，本研究結(jié)果顯示，216例慢性乙型肝炎患者中自身抗體陽性的患者有89例，占41.2%，其中ANA陽性的最多，有58例，陽性率為26.9%，之后依次是LKM陽性13例；AMA-M2陽性12例；ASMA陽性7例；抗SLA/LP陽性3例；抗LC陽性4例。這說明，自身抗體的出現(xiàn)是造成慢性乙型肝炎患者肝細(xì)胞損傷的機(jī)制之一。故而慢性乙型肝炎患者檢測自身抗體有助于治療和對(duì)疾病的了解，還對(duì)探討HBV致病機(jī)制具有十分重要的指導(dǎo)意義。

在我國，HBV基因型以B型和C型為主，不同的基因型，因基因的差異可造成致病性的差異，從而影響病情的發(fā)生、發(fā)展，以及自身機(jī)體的反應(yīng)[8-9]。HBV基因型一直是乙型肝炎的研究熱點(diǎn)，自身抗體在不同基因型的HBV患者中分布是否也有差別？本研究基因分型結(jié)果表明，B型HBV有30例患者，C型HBV有186例，自身抗體在兩種基因型中的分布C型高于B型，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這表明自身抗體的出現(xiàn)與基因型可能沒有關(guān)聯(lián)，C型更容易產(chǎn)生自身抗體有待于證實(shí)。

在過去的報(bào)道中，HBV DNA可自然地發(fā)生耐藥位點(diǎn)的突變，在使用抗病毒藥物之后，通過免疫、藥物和自然突變多種因素的影響產(chǎn)生耐藥的HBV，這給治療難度帶來巨大的挑戰(zhàn)。在治療過程中對(duì)耐藥位點(diǎn)突變進(jìn)行檢測，有助于評(píng)估藥物療效，從而更好地選擇治療方案和預(yù)防處理耐藥問題[10]。本研究選取LAM耐藥相關(guān)位點(diǎn)(M204I、M204V、L180M)和ADV耐藥相關(guān)位點(diǎn)(N236T、A181T、A181V)，基因位點(diǎn)在B型和C型中的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與孫麗娜等[11]研究中M204V、N236T、A181T、A181V 4個(gè)位點(diǎn)在B型和C型中的分布存在差異，這可能是由于此次標(biāo)本量較少所導(dǎo)致的，應(yīng)增加患者例數(shù)再做分析。

綜上所述，自身抗體與慢性乙型肝炎患者的病程發(fā)展有一定聯(lián)系，不同基因型產(chǎn)生自身抗體和耐藥位點(diǎn)突變?cè)诨蛐椭械姆植柬氝M(jìn)一步進(jìn)行研究。

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