韓佳縈，蘇伊玲，熊 麗，耿 輝*

（1.華中師大一附中，武漢 430223；2.華中師范大學生命科學學院，武漢 430079）

鄰苯二甲酸二－2－乙基己酯（di－2－ethylhexylphthalate，DEHP），又名鄰苯二甲酸二異辛酯，是鄰苯二甲酸酯類化合物（PAE）的重要成員，是塑料材料中使用量最大的增塑劑，在PVC材料中DEHP含量高達30%～50%[1]。DEHP在塑料中以游離的形式存在，其與塑料成分之間不是以共價化學鍵結合，而是通過氫鍵或范德華力相連，因此極容易釋放到環(huán)境中。據(jù)文獻報道，DEHP在長江、黃河、珠江、遼河和海河等我國主要水系流域均有高濃度檢出。有文獻報道重慶市和三峽庫區(qū)水環(huán)境中 DEHP 最高濃度達到 5.421 μg·L－1，對浙江省10個水廠的源水進行抽樣分析，發(fā)現(xiàn)每個水廠均有鄰苯二甲酸酯類檢出，其中DEHP最高含量達到 17 μg·L－1[2]。而且 DEHP 很難降解，在環(huán)境中存留時間較長，在生物體內(nèi)具有富集效應，對人體健康和環(huán)境安全造成極大的威脅。

DEHP受到廣泛的關注還與其多重毒性作用有關。許多動物毒理學研究表明，DEHP具有肝臟毒性、生殖毒性、發(fā)育毒性和致癌性等多種毒性，并具有類雌性激素活性[1，3－7]。目前有關 DEHP 對免疫系統(tǒng)作用，特別是介導超敏反應發(fā)生已有一些研究。Lee等[8]報道DEHP可誘導CD4+T細胞向Th2型細胞分化并分泌IL－4，IL－4刺激B細胞產(chǎn)生IgE型抗體并通過介導炎癥級聯(lián)反應導致超敏反應。流行病學調(diào)查研究證實，職業(yè)性接觸DEHP的人群發(fā)生哮喘的幾率大幅增加。Hoppin等[9]報道DEHP及其體內(nèi)代謝產(chǎn)物鄰苯二甲酸單芐酯（Monobenzyl phthalate，MBzP）能夠誘導與哮喘、花粉熱、關節(jié)炎等疾病密切相關的19種特異性IgE抗體的產(chǎn)生，提示DEHP接觸與哮喘、花粉熱、關節(jié)炎等超敏反應及關節(jié)炎為代表的自身免疫性疾病的發(fā)病有關。DEHP可明顯增加人和大鼠免疫細胞膜表面分子CD11b的表達，CD11b專司免疫細胞從血管至炎癥部位的遷移與附著，表明DEHP能夠影響免疫炎癥反應[10]。Kuo等[11]發(fā)現(xiàn)DEHP通過抑制MAPKMEK1/2－ERK－ELK1和 NFκB 信號傳導途徑，抑制髓系DC細胞分泌IFN－α/IFN－β，從而削弱DC細胞對T細胞的輔佐作用，誘導免疫應答反應向Th2方向發(fā)展。Eljezi等[3]發(fā)現(xiàn) 0.1 μg·L－1濃度劑量的 DEHP 對鼠細胞系L929表現(xiàn)明顯的細胞毒性作用。人角膜內(nèi)皮細胞B4G12體外暴露于DEHP后，炎癥相關因子IL－1β、IL－8 和 IL－16的分泌增加，基因表達水平也升高[12]。以上研究提示DEHP暴露可能從多方面影響免疫應答。

由于DEHP在日常用品中的廣泛使用，土壤、水體等均已受到不同程度的DEHP污染。DEHP可以通過食品攝入、呼吸空氣、飲用水、皮膚吸收等多種途徑進入人體。2009年美國CDC開展的第四次針對環(huán)境化合物暴露檢測報告顯示，接受檢查的2636例受檢者體內(nèi)都可以檢測到DEHP及其代謝產(chǎn)物的存在（www.cdc.gov/exposurereport/pdf/fourthreport.pdf）。 本文選用小鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞和腹腔巨噬細胞作為研究材料，通過檢測DEHP對巨噬細胞吞噬活性、細胞因子產(chǎn)生、活性氧水平的變化，探討DEHP暴露對機體免疫系統(tǒng)的毒性作用，為DEHP暴露對免疫系統(tǒng)干擾/毒性風險評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

DEHP購于上海阿拉丁試劑公司（純度≥98%），DMEM培養(yǎng)基購于Gibco公司，胎牛血清購于杭州四季青公司，Giemsa染色試劑購自南京建成生物公司，TNF－α、IL－12、IL－23 ELISA 檢測試劑盒購自三鷹生物，2，7－二氯熒光素二乙酸酯（DCFH－DA）購自江蘇凱基生物公司，其他相關試劑均為國產(chǎn)分析純。二氧化碳培養(yǎng)箱型號為Thermo－BB15，倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)型號為Olympus IX－50，Spectra Max M5多功能酶標儀型號為Molecular Devices－SpectraMax i3x。

1.2 巨噬細胞系RAW264.7細胞培養(yǎng)

巨噬細胞系RAW264.7細胞系華中科技大學基礎醫(yī)學院生物化學教研室惠贈。復蘇凍存的RAW264.7細胞方法如下：從液氮罐中取出保存RAW264.7細胞的凍存管，立即將其置于40℃的溫水中快速解凍。70%酒精噴灑細胞凍存管消毒，置于超凈工作臺內(nèi)，移液器吸取將細胞轉移至15 mL離心管中，再補加10倍體積的10%胎牛血清－DMEM培養(yǎng)基，1000 r·min－1離心 8 min，棄上清，重新加入含有10%血清的DMEM完全培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻，轉移至25 cm2細胞培養(yǎng)瓶，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。定時觀察培養(yǎng)基顏色變化及細胞狀態(tài)，及時更換新鮮培養(yǎng)基，待細胞長滿整個培養(yǎng)瓶底部，進行傳代培養(yǎng)。

1.3 DEHP處理RAW264.7細胞

將正常RAW264.7細胞接種到培養(yǎng)瓶中，待培養(yǎng)細胞的密度達到80%后進行DEHP暴露。設置1、5、10、20、40、80 mg·L－1DEHP 處理組、0.05%的丙酮溶劑和DMEM完全培養(yǎng)基對照組。DEHP暴露48 h更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)24～48 h，連續(xù)細胞傳代和貼壁再生長，待培養(yǎng)細胞的密度達到80%后進行DEHP暴露，如此重復10代。染毒DEHP暴露10代后收獲細胞，用于紅細胞吞噬實驗、細胞因子分泌、活性氧水平檢測。巨噬存活率經(jīng)0.04%臺盼藍染色確定細胞存活。

1.4 腹腔巨噬細胞分離培養(yǎng)

BALB/c小鼠購于湖北省疾病預防醫(yī)學科學院。小鼠暴露濃度設計依據(jù)體外實驗結果確定。選取30只8～12周齡雄性健康BALB/c小鼠隨機分成5組，分別設置為 1、5、10 mg·L－1DEHP 處理組、0.05%的丙酮溶劑和蒸餾水對照組，采用自由飲水方式喂飼小鼠，連續(xù)飼養(yǎng)20周后頸椎脫臼處死小鼠，75%酒精浸泡5 min，剪開腹下部皮膚打開腹腔，用吸管吸取PBS反復沖洗腹腔，收集腹腔滲出液，1000 r·min－1離心 8 min，棄上清，PBS洗滌2遍。用10%胎牛血清－DMEM培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細胞濃度至5×106細胞·mL－1，接種于24孔板中，每孔2 mL，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2 h定時取出培養(yǎng)板于倒置顯微鏡下觀察巨噬細胞貼壁情況。

1.5 紅細胞吞噬實驗

向培養(yǎng)有巨噬細胞的培養(yǎng)板中按1∶50比率加入綿羊紅細胞，放回CO2培養(yǎng)箱中孵育，3 h后取出培養(yǎng)板，PBS反復沖洗未被巨噬細胞吞噬的紅細胞，自然干燥后加入冷丙酮溶液固定5 min。滴加Giemsa染液10 min，自來水沖干凈，在顯微鏡下觀察計數(shù)吞噬百分率和吞噬指數(shù)。

吞噬百分率=吞噬紅細胞的巨噬細胞/100個巨噬細胞×100%

吞噬指數(shù)=被吞噬的紅細胞/100個巨噬細胞

1.6 ELISA 檢測 TNF－α、IL－12、IL－23 細胞因子表達

將經(jīng)過DEHP處理的RAW264.7細胞濃度調(diào)至1×107·mL－1，培養(yǎng)于 24 孔板中，每孔加入 1 mL 細胞懸液和 2×10－3μg·L－1LPS 刺激（每種劑量濃度 DEHP 均設3個重復孔），培養(yǎng)72 h后，吸取培養(yǎng)上清液用于細胞因子的測定。以雙抗體夾心ELISA法，測定培養(yǎng)上清液中 TNF－α、IL－12、IL－23 細胞因子濃度。操作步驟按三鷹生物公司提供的檢測試劑盒中說明書進行。

1.7 活性氧（ROS）水平檢測

將經(jīng)過DEHP連續(xù)處理10代的RAW264.7細胞濃度調(diào)至 1×107·mL－1，接種于 24 孔板，加入 2×10－3μg·L－1LPS刺激2 h后，按照凱基活性氧檢測試劑盒的操作說明，采用對ROS敏感的熒光探針DCFH－DA標記細胞，利用熒光酶標儀在488nm激發(fā)波長、525nm發(fā)射波長下測定不同細胞樣品中DCF的熒光值，檢測DEHP不同濃度處理組細胞內(nèi)活性氧的變化。

1.8 統(tǒng)計學處理

應用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析（One－Way ANOVA），實驗數(shù)據(jù)以 X±SD 表示，兩組間計量資料的比較采用t檢驗。P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 DEHP對RAW264.7細胞的毒性作用

為評估DEHP暴露對巨噬細胞的毒性作用，首先用不同濃度劑量的 DEHP（1、5、10、20、40、80 mg·L－1）處理巨噬細胞株RAW264.7細胞。RAW264.7細胞暴露于 1、5、10 mg·L－1DEHP 48 h 后，未發(fā)現(xiàn)細胞活力狀態(tài)及死亡細胞數(shù)目發(fā)生變化（圖1）。然而經(jīng)20、40、80 mg·L－1DEHP 處理后，RAW264.7 細胞的活力狀態(tài)變?nèi)?，死亡細胞的?shù)目顯著增加（圖2）。

2.2 DEHP對RAW264.7細胞吞噬能力的影響

鑒于動物與人體接觸環(huán)境中DEHP的實際情況是低劑量長時間暴露，我們采用 1、5、10 mg·L－1濃度劑量的DEHP對巨噬細胞株RAW264.7進行持續(xù)染毒。經(jīng)連續(xù)染毒處理10代后，RAW264.7細胞的活力、形態(tài)以及繁殖傳代時間未見顯著變化（結果未顯示）。細胞吞噬功能測定顯示，向DMEM完全培養(yǎng)基和丙酮對照組RAW264.7細胞中加入綿羊紅細胞2 h后，可觀察到巨噬細胞吞噬紅細胞，被吞噬紅細胞及巨噬細胞形態(tài)輪廓清晰可辨，被吞噬紅細胞數(shù)目從一個到多個不等，有部分紅細胞粘附在巨噬細胞外圍將要被吞噬（圖3）。而經(jīng)DEHP連續(xù)處理10代后，RAW264.7細胞的吞噬紅細胞能力顯著減弱（圖3）。每組實驗重復3次，統(tǒng)計結果顯示DMEM完全培養(yǎng)基與丙酮對照組相比，吞噬百分率和吞噬指數(shù)無統(tǒng)計學差異（表 1），而 1、5、10 mg·L－1DEHP 各暴露組與丙酮對照組相比，吞噬百分率和吞噬指數(shù)均呈現(xiàn)顯著下降趨勢（P＜0.05）。

圖2 RAW264.7細胞接受不同濃度劑量DEHP處理后的死亡率（n=3）Figure 2 The mortality of RAW264.7 cells by treated with different dosages of DEHP（n=3）

圖1 不同濃度劑量DEHP處理RAW264.7細胞48 h后的鏡檢結果（放大倍數(shù)：×200）Figure 1 Microscopic images of RAW264.7 cells treated with different dosages of DEHP after 48 h treatment（Magnification：×200）

圖3 RAW264.7細胞吞噬紅細胞鏡檢結果（放大倍數(shù)：×400）Figure 3 Microscopic examination of phagocytosis efficiency with RAW264.7 cell（Magnification：×400）

2.3 DEHP 對 RAW264.7細胞分泌 TNF－α、IL－12、IL－23細胞因子的影響

1、5、10 mg·L－1DEHP 連續(xù)處理 10 代后，換用正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h，再接受LPS刺激72 h后收集細胞上清液，TNF－α、IL－12、IL－23 的變化趨勢見圖 4。由圖 4 可以看出，經(jīng) 1、5、10 mg·L－1的 DEHP 連續(xù)處理后，RAW264.7 細胞分泌 TNF－α、IL－12、IL－23等細胞因子的能力較丙酮對照組比較顯著降低。并且TNF－α、IL－12、IL－23 下降趨勢與 DEHP 暴露濃度呈現(xiàn)劑量－效應關系，提示DEHP能抑制RAW264.7細胞分泌 TNF－α、IL－12、IL－23等細胞因子。

表1 不同劑量DEHP暴露對RAW264.7細胞吞噬活性的影響Table 1 Effects of different dose DEHP exposure on phagocytosis of RAW264.7

圖4 DEHP暴露對RAW264.7細胞因子分泌的影響（OD：光密度，n=3，*P＜0.05）Figure 4 Effects of different dosages of DEHP on cytokines secretion of RAW264.7（OD：Optical density，n=3，*P＜0.05）

2.4 DEHP對RAW264.7細胞ROS產(chǎn)生的影響

1、5、10 mg·L－1DEHP 連續(xù)處理 10 代后，換用正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，加入 2×10－3μg·L－1LPS 刺激2 h后，用DCFH－DA熒光探針標記RAW264.7細胞，測定細胞內(nèi)熒光強度以反映ROS的產(chǎn)生量。圖5顯示，經(jīng) 1、5、10 mg·L－1濃度劑量的 DEHP 連續(xù)染毒后，RAW264.7細胞內(nèi)的ROS水平與丙酮對照組相比顯著下降，隨著DEHP濃度的加大，DEHP對RAW264.7細胞ROS水平的抑制作用逐漸增強，當DEHP濃度達到10 mg·L－1時，細胞內(nèi)ROS水平降至對照組水平的34.69%。

2.5 DEHP對腹腔巨噬細胞貼壁及吞噬能力的影響

為進一步驗證DEHP對巨噬細胞免疫功能的影響，我們還選用了小鼠腹腔巨噬細胞作為研究材料。采用 1、5、10 mg·L－1DEHP 喂飼小鼠，連續(xù)飼養(yǎng) 20 周后收集小鼠腹腔巨噬細胞，隔2 h于倒置顯微鏡下觀察巨噬細胞粘附貼壁情況及形態(tài)變化。對照組腹腔巨噬細胞于體外培養(yǎng)2 h后逐漸伸展增大，4 h后能粘附到24孔培養(yǎng)板上，形狀呈梭形或不規(guī)則形并有偽足或突起伸出。而各劑量濃度DEHP對巨噬細胞黏附伸展能力均有一定的影響，其中5、10 mg·L－1DEHP暴露組巨噬細胞黏附伸展能力下降顯著，分別需要12、14 h才能完全貼壁。紅細胞吞噬實驗顯示，各劑量濃度DEHP暴露與丙酮對照組相比，巨噬細胞吞噬紅細胞數(shù)目、吞噬百分率及吞噬指數(shù)均顯著降低（表2）。

3 討論

DEHP是日常生活中使用和接觸最多的增塑劑，DEHP可不斷地從塑料中釋放。從近年來我國各大水系的檢測結果來看，水環(huán)境中DEHP的含量已經(jīng)超出我國水環(huán)境中允許的濃度范圍[13]。由于DEHP具有較高的脂－水分配系數(shù)，可被土壤吸附并且可被生物富集，因此生物體中DEHP的含量要遠高于水體和土壤[14]。

表2 不同劑量DEHP暴露對小鼠腹腔巨嗜細胞吞噬活性的影響Table 2 Effects of different dose DEHP exposure on phagocytosis of murine peritoneal macrophages

圖5 DEHP對RAW264.7細胞ROS產(chǎn)生的影響（n=3，重復檢測次數(shù)：2 次，*P＜0.05）Figure 5 DEHP inhibited ROS production in RAW264.7 cells（n=3，Repeated detection times：2，*P＜0.05）

自1981年首次報道DEHP誘發(fā)嚙齒類動物腫瘤以來，關于DEHP毒性研究的文獻日漸增多。巨噬細胞是機體內(nèi)重要的免疫效應細胞，具有多種免疫功能，包括免疫防御、免疫監(jiān)視、免疫調(diào)節(jié)以及抗原呈遞等，在機體的免疫系統(tǒng)中起著重要作用[15]。由于巨噬細胞株RAW264.7細胞已經(jīng)成功建系，易于體外傳代培養(yǎng)，因此本研究首先選用RAW264.7細胞作為研究對象，探討DEHP對巨噬細胞功能的影響。結果顯示，雖然較低濃度劑量（1、5、10 mg·L－1）DEHP 暴露并沒有急性毒性作用，然而經(jīng)連續(xù)10代持續(xù)暴露后，DEHP對細胞株RAW264.7吞噬功能有明顯抑制作用。接受外來抗原刺激后分泌細胞因子（如TNF－α、IL－12、IL－23）是巨噬細胞應答的基本反應[16]。本研究證實，DEHP對RAW264.7細胞接受LPS刺激后分泌TNF－α、IL－12、IL－23 等細胞因子有明顯的抑制作用，且呈一定的劑量－效應關系。細胞內(nèi)ROS水平也是反映巨噬細胞功能的指標之一[17]。吞噬細胞受到刺激時通過呼吸暴發(fā)機制，產(chǎn)生大量ROS，ROS是吞噬細胞發(fā)揮吞噬和殺傷作用的主要介質。在機體免疫防御過程中，巨噬細胞通過產(chǎn)生一定量的ROS，破壞細菌的細胞膜和病毒的蛋白質，從而消滅外來病原微生物。本研究發(fā)現(xiàn)，DEHP連續(xù)處理巨噬細胞株RAW264.7后，再接受LPS刺激2 h后，用DCFH－DA熒光探針法檢測ROS的產(chǎn)生，顯示細胞ROS的產(chǎn)生受到抑制，并且隨著DEHP濃度的增大，細胞內(nèi)ROS水平下降愈加明顯。這些結果說明DEHP對巨噬細胞正常功能發(fā)揮具有顯著的抑制作用。

由于腹腔巨嗜細胞游離存在于腹腔的腹水中，易于獲得，因此本研究還選用腹腔巨噬細胞作為研究對象。結果表明DEHP對腹腔巨噬細胞粘附貼壁及吞噬能力均有顯著抑制作用。粘附貼壁能力反應巨噬細胞的活力狀態(tài)，吞噬能力是反映其免疫防御能力的一個重要指標[18]，DEHP抑制腹腔巨噬細胞的粘附貼壁及吞噬能力，表明DEHP可影響巨噬細胞的免疫防御功能，從而對機體的免疫能力產(chǎn)生抑制作用。

4 結論

（1）高濃度（20、40 和 80 mg·L－1）DEHP 暴露可對巨噬細胞株RAW264.7細胞造成急性損傷。

（2）低濃度（1、5、10 mg·L－1）DEHP 長時間暴露對RAW264.7和腹腔巨噬細胞有免疫毒性作用。

（3）本研究評估了DEHP對巨噬細胞的免疫毒性作用，這對全面了解DEHP的毒性具有十分重要的意義，研究結果可為DEHP的免疫毒性風險評估提供一定的科學依據(jù)。

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