陳新華，李風(fēng)萍，陳昭宇，郭偉洪 （南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣東廣州510515）

0 引言

胃癌（gastric cancer，GC）的發(fā)病率和死亡率均位居全球前列，嚴(yán)重危害人類健康［1-2］，尤其在我國，GC以局部進展期胃癌（advanced gastric cancer，AGC）為主（80%～90%）［3］，腫瘤遷移和侵襲能力強、預(yù)后差的特點非常顯著［4］。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)的進步給腫瘤的診斷和治療提供了新思路。因此，分析和探索GC的分子生物學(xué)特性，并轉(zhuǎn)化為治療的新靶點和新方法，仍然具有非常高的臨床需求和很突出的時代需求。近年來，越來越多的研究［5-6］提示microRNAs（miRNA）是調(diào)節(jié) GC發(fā)生發(fā)展的重要機制，有望成為潛在的治療新靶點。

miRNAs是一類單鏈內(nèi)源性的非編碼微小RNA，能對細胞凋亡、增殖及分化、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)等眾多生命過程起到重要調(diào)控作用［7-8］。近期大量研究［9-11］表明，miRNAs的突變或異常表達與人體各種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，可以促進腫瘤的進展，也可以發(fā)揮抑癌作用。miR-532-5p位于人類染色體的Xp11．23上，具有3'非翻譯區(qū)的互補序列，可以通過抑制轉(zhuǎn)錄下調(diào)多種基因產(chǎn)物。miR-532-5p首先被發(fā)現(xiàn)在皮膚黑色素瘤中具有促癌作用［12］，但相繼也有研究［13-15］發(fā)現(xiàn)其在多種實體腫瘤，如卵巢癌、肺癌以及肝癌中表達下調(diào)，而細胞功能試驗也提示其有抑制腫瘤細胞增殖的作用。Xu等［16］首次報道了 miR-532-5p對人類GC細胞的調(diào)節(jié)作用和機制，體外試驗中過表達miR-532-5p可以顯著增加GC細胞集落形成和遷移的潛力，減少G1期細胞的比例，阻滯細胞周期，并且促進細胞凋亡，然而，在臨床胃癌組織的檢測中并未得到一致的結(jié)果。該研究未對此作進一步的延伸探索，但也提示我們，miR-532-5p與胃癌的發(fā)生發(fā)展可能存在一定關(guān)系。因此，結(jié)合目前臨床上胃癌的診治亟需開發(fā)潛在新靶點的時代需求，進一步深入明確和闡述miR-532-5p在GC發(fā)生發(fā)展過程的調(diào)節(jié)作用具有較大的科學(xué)意義，甚至可能為GC未來的診治提供更好的選擇。

模板按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，所得cDNA應(yīng)用 SYBR Green I法進行熒光定量 PCR反應(yīng)。試驗設(shè)置3個重復(fù)，以U6作為內(nèi)參，按照說明書推薦的程序進行擴增反應(yīng)。計算得到的miR-532-5p的相對表達量數(shù)值以中位數(shù)為截斷值，將miR-532-5p的表達水平分為低表達和高表達兩組，并分析其表達高低與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1．2．2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 胃癌MKN45細胞株常規(guī)培養(yǎng)使用含 10%胎牛血清的 1640培養(yǎng)基，置于37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細胞處于對數(shù)生長期時接種于6孔板，接種密度控制為4×105個／孔左右，24 h后按照轉(zhuǎn)染試劑說明書利用 Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染 miR-532-5p-NC，miR-532-5p-mimics和miR-532-5p-inhibitor，根據(jù)不同實驗時間要求后收集細胞進行后續(xù)實驗。實驗分為3組，陰性對照組（negative control， NC）、過表達組（mimics）以及干擾組（inhibitor）（表 1）。

表 1 miR-532-5p NC、mimics及 inhibitor序列

1 材料和方法

1．1 主要材料 組織標(biāo)本：60例新鮮冰凍癌組織和配對癌旁組織標(biāo)本選取自2016～2017年在南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院普通外科行手術(shù)治療的胃癌患者，所有患者術(shù)后均經(jīng)病理學(xué)檢查確診，在術(shù)前沒有接受放化療等抗腫瘤治療。試驗所取癌組織為距離病灶邊緣1 cm以內(nèi)組織，癌旁組織為距離癌灶3 cm以外的粘膜組織。所有組織標(biāo)本的采集均獲得患者知情同意，并且由南方醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

試劑：MKN45胃癌細胞購自中科院上海細胞庫；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購自Takara；引物由上海生工公司設(shè)計合成；D1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自HyClone；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen；Mir-532-5p干擾序列inhibitor及過表達序列mimics由江蘇吉瑪公司設(shè)計合成；CCK8細胞增殖檢測試劑盒購自上海碧云天公司；Matrigel基質(zhì)膠、Transwell培養(yǎng)板購自Corning公司。

1．2 方法

1．2．1 熒光定量 PCR檢測miR-532-5p的表達 按照RNAiso（TAKARA，日本）試劑說明書提取癌組織及其配對新鮮冰凍組織總RNA；取500 ng總RNA為

1．2．3 CCK8法檢測細胞的增殖能力 轉(zhuǎn)染 24 h后收集細胞，按照每孔 1×103的細胞數(shù)接種 96孔板，每組每個時間點均設(shè)置5個重復(fù)，每孔培養(yǎng)體積為100 μL。 24 h 細胞貼壁后，取0、12、24、48 h 作為時間點分別加入 10 μL CCK-8試劑（DOJINDO，日本），置于37℃環(huán)境中孵育2 h，然后在450 nm波長處測定吸光度，并繪制細胞生長曲線。

1．2．4 Transwell法檢測細胞的遷移能力 轉(zhuǎn)染 48 h后收集細胞，以200 μL不含胎牛血清的 RIPM 1640培養(yǎng)基重懸細胞，按照每孔 5×104的細胞加入到Transwell上室，下室加入 600 μL含10%胎牛血清的RIPM 1640培養(yǎng)基，孵育24 h后取出上室，去掉上室的培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定細胞15 min，用0．2%結(jié)晶紫染色25 min，用棉簽擦去上室細胞，用自來水洗上室3次，正置顯微鏡下隨機選擇5個視野進行細胞計數(shù)并拍照保存。

1．2．5 Transwell法檢測細胞的侵襲能力 實驗方法基本同遷移實驗，唯一區(qū)別為所使用是經(jīng)過Matrigel基質(zhì)膠包被的上室，制作方法為液態(tài)的基質(zhì)膠原液以不含胎牛血清的 RIPM 1640培養(yǎng)基稀釋8倍，取50 μL加入上室中，置于37℃環(huán)境，待基質(zhì)膠凝固30 min后使用。

1．2．6 劃痕試驗 培養(yǎng)板接種細胞之前先用marker筆在12孔板背面畫橫線標(biāo)記，細胞消化后種入12孔板，細胞鋪滿板底后，用10 μL槍頭垂直于孔板沿著橫線標(biāo)記均勻用力制造劃痕，吸去細胞培養(yǎng)液，用PBS輕輕沖洗孔板三次，洗去劃痕產(chǎn)生的細胞碎片。加入無血清培養(yǎng)基，拍照記錄。將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔4～6 h取出拍照，直至劃痕基本愈合。

1．3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS22．0軟件進行數(shù)據(jù)分析。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用Mann-Whitney U檢驗。CCK-8實驗和流式凋亡實驗多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間數(shù)據(jù)比較采用LSD-t檢驗。用卡方檢驗或 Fisher確切概率法及Spearman法進行相關(guān)性分析。檢驗水準(zhǔn)為α＝0．05，采用雙側(cè)性檢驗。

2 結(jié)果

2．1 GC癌組織和癌旁組織中miR-532-5p表達水平的比較 熒光定量PCR試驗分析表明，60例胃癌／癌旁組織中，83．3%呈低水平（圖1A），且miR-532-5p的相對表達量低于癌旁組織的相對表達水平（P＝0．0135，圖 1B）。

圖1 miR-532-5p在GC癌組織中的表達量

2．2 miR-532-5p在GC癌組織中表達量與臨床參數(shù)之間的關(guān)系 miR-532-5p表達量與腫瘤直徑（r＝0．314， P＝0．024）、遠處轉(zhuǎn)移（r＝ 0．536， P＝ 0．035）具有顯著相關(guān)性（表2）。

2．3 NC、mimics和 inhibitors組的 MKN45 細胞內(nèi)miR-532-5p表達水平 MKN45細胞轉(zhuǎn)染后，與NC空白對照組相比，mimics組的miR-532-5p表達顯著上調(diào)（??P＝0．00015），而轉(zhuǎn)染 inhibitor后，miR-532-5p表達顯著下調(diào)（?P＝0．00295），這提示 miR-532-5p低表達和過表達細胞模型構(gòu)建成功。

表2 miR-532-5p表達與GC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

圖2 NC、mimics和inhibitors組的MKN45細胞內(nèi)miR-532-5p表達情況（?p ＜0．005，??p ＜0．001）

2．4 NC、mimics和 inhibitors組 MKN45 細胞增殖能力的比較 CCK8增殖實驗顯示，相比NC空白對照組，mimics組miR-532-5p表達上調(diào)后MKN45細胞生長曲線在4天時間點顯著位于NC組下方（???p＜0．001），inhibitors組 MKN45 細胞生長曲線在 2 天（?p＜0．05）、3 天（???p＜0．001）、4 天（???p＜0．001）時間點均顯著位于NC組上方。這表明，說明增強miR-532-5p的表達可以抑制MKN45細胞的增殖，而敲低miR-532-5p的表達可以增強MKN45細胞的增殖。

圖3 miR-532-5p NC、mimics和inhibitors轉(zhuǎn)染MKN45細胞后在1、2、3、4天時間點加入CCK8，在490 nm處分析去熒光OD值（?p ＜0．05， ???p ＜0．001）

2．5 NC、mimics和 inhibitors組 MKN45 細胞遷移實驗 遷移實驗結(jié)果顯示，相對于NC對照組（實驗細胞穿過上室的數(shù)量為 185．0±5．8），mimics 組發(fā)生遷移的細胞數(shù)目（60．0±2．9）顯著減少（???P ＝0．0005），inhibitors 組發(fā)生遷移的細胞數(shù)目（292．0+6．9）顯著增加（?P＝0．0318）。 說明過表達 miR-532-5p可以抑制MKN45細胞的遷移能力，反過來敲低miR-532-5p表達可以增強MKN45細胞的遷移能力。

圖4 NC、mimics和inhibitors組MKN45細胞遷移能力比較。（?表示 p ＜0．05， ???表示 p ＜0．001， 標(biāo)尺為 200×）

2．6 NC、mimics和 inhibitors組 MKN45 細胞侵襲能力的比較 細胞侵襲實驗結(jié)果顯示：相對于NC對照組（實驗細胞穿過上室的數(shù)量為 103．3±5．3），mimics組發(fā)生侵襲的細胞數(shù)目（20．7±2．2）較 NC 組顯著減少（??P＝0．0061），inhibitors組發(fā)生遷移的細胞數(shù)目（223．0±11．6）較 NC 組顯著增加（??P＝ 0．0054）。說明過表達miR-532-5p可以抑制MKN45細胞侵襲能力，干擾miR-532-5p表達可以增強MKN45細胞的侵襲能力。

圖5 NC、mimics和inhibitors組MKN45細胞、侵襲能力比較。（?表示 p ＜0．05， ???表示 p ＜0．0001， 標(biāo)尺為 200×）。

2．7 NC、mimics和inhibitors組的劃痕實驗結(jié)果

相對于NC對照組，mimics組MKN45細胞在24h時內(nèi)的遷移比例相對降低（?P＝0．0192），而 inhibitors組MKN45細胞在24 h時的遷移比例相對增強（?P＝0．0105）。說明過表達miR-532-5p可以抑制MKN45細胞遷移能力，干擾 miR-532-5p表達可以增強MKN45細胞遷移能力。

圖6 NC、mimics和inhibitors組MKN45細胞劃痕實驗（?p ＜0．05，標(biāo)尺為 200×）

3 討論

成熟的miRNA可以通過抑制轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)多種基因產(chǎn)物，在組織中具有空間和時間的表達特異性，在細胞增殖、凋亡和分化中起重要作用［7-8，17］。 近期大量研究［11，18］表明 miRNA和腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。 其中，miR-532-5p被研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中具有調(diào)節(jié)腫瘤生物特性的功能［12，14，19］。 miR-532-5p 和 GC 發(fā)生發(fā)展的關(guān)系也有相關(guān)研究。Xu等［16］的體外實驗表明，過表達miR-532-5p可以增強胃癌細胞的增殖能力，其體內(nèi)實驗也證實，過表達miR-532-5p可以增加小鼠體內(nèi)肺重量及肺移植瘤數(shù)量。然而，該研究對新鮮GC癌組織標(biāo)本進行檢測，并未得到相應(yīng)的實驗結(jié)果。該研究未對此進一步延伸探索，但也提示我們，miR-532-5p與胃癌的發(fā)生發(fā)展可能存在一定關(guān)系。鑒于miR-532-5p潛在的腫瘤增殖調(diào)節(jié)功能和胃癌對診治新靶標(biāo)的需求，我們對此進行了進一步深入探究，以明確miR-532-5p與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。我們利用熒光定量PCR實驗檢測60例GC患者癌組織及其配對癌旁組織中miR-532-5p的表達水平，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中miR-532-5p的相對表達量低于癌旁組織的相對表達水平。進一步分析miR-532-5p表達與胃癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)腫瘤體積較大者（直徑≥3 cm）和發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的癌組織中的miR-532-5p表達水平顯著下調(diào)。因此，我們有理由假設(shè)miR-532-5p可以抑制GC的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并且進行了后續(xù)的細胞功能實驗作為驗證。后續(xù)細胞功能實驗進一步證實，miR-532-5p參與抑制GC的增殖、遷移和侵襲。

細胞增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移能力強是惡性腫瘤的主要特征，主要表現(xiàn)為腫瘤細胞的無限增殖能力、細胞周期和侵襲轉(zhuǎn)移的異常調(diào)控［20-21］。目前對GC病情判斷的診療手段有限，主要是體表超聲、CT檢查、MRI檢查、PET-CT檢查、超聲內(nèi)鏡，往往難以精確判斷病情進展［22］。而目前對GC病情的分期主要基于UICC／AJCC制定的TNM分期，現(xiàn)有診斷技術(shù)基礎(chǔ)上進行TMN分期難以在治療前對病情做出精確預(yù)判［22］，不利于做出最佳治療方案的選擇，只有結(jié)合分子生物學(xué)診斷，才能做到個體化和精準(zhǔn)化治療［5］。結(jié)合臨床觀察，GC癌組織的miRNA異常表達與胃癌的惡性程度及預(yù)后存在密切的聯(lián)系，在胃癌的動態(tài)監(jiān)測復(fù)發(fā)、預(yù)后甚至治療等方面具有潛在的應(yīng)用前景［5］。而本研究提示miR-532-5p能夠抑制GC的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，GC癌組織中 miR-532-5p低表達可作為腫瘤體積較大、發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的標(biāo)志，因此，miR-532-5p能夠作為胃癌的病情評估、治療方式選擇和判斷預(yù)后的潛在依據(jù)。綜上所述，本研究提示miR-532-5p可能通過抑制GC的增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移能力而發(fā)揮抑癌作用，潛在可能作為GC抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用靶點。miR-532-5p在GC演進中的生物相關(guān)性是一個值得深入研究的方向，可以為發(fā)病率高、預(yù)后差的GC的生物學(xué)研究提供新的方法和思路。

本研究尚存在一些不足，如組織樣本較少，后期可能需要進一步大樣本、多中心前瞻性臨床研究來驗證；其次，miR-532-5p對GC的抑癌機制尚未進一步研究，需要后續(xù)進一步實驗補充。

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