楊鼎超，郝菲菲，張 揚，張林平，欒豐剛，曾菊平

（江西農(nóng)業(yè)大學 林學院， 江西 南昌 330045）

樹干注藥技術(shù)是將藥劑直接注入樹干內(nèi)[1]，藥劑在樹體內(nèi)具有較長的殘留期，相對于噴霧法和煙霧法，其對林木蛀干、枝梢等害蟲有良好的防治效果，且不易污染環(huán)境、殺傷天敵等，因此，樹干注藥技術(shù)在林木害蟲防治中得到極大應用[2-4]。唐光輝等研究表明有內(nèi)吸性的藥劑在樹體內(nèi)的活性不如無內(nèi)吸作用的藥劑[5]。這表明注干藥劑不等同于內(nèi)吸性藥劑，藥劑的防效取決于助劑類型。然而，藥劑在樹體內(nèi)與植物密切接觸，會對植物產(chǎn)生直接的影響[6]，故對樹干注藥開展安全性研究具有重要意義。

氯氟氰蟲酰胺是浙江省化工研究院有限公司自主開發(fā)的一類高效、作用機制獨特的鄰苯二甲酰胺類新型殺蟲劑[7]，與傳統(tǒng)的殺蟲劑無交互抗性，對哺乳動物較為安全，已廣泛用于鱗翅目害蟲的防治[8-11]。目前，國內(nèi)外有關(guān)氯氟氰蟲酰胺在林木中輸導及其安全性評價的研究尚未見報道，而氯氟氰蟲酰胺在林間對松材線蟲病Bursaphelenchus xylophilus表現(xiàn)出良好的防效[12]。為此，采用樹干注藥技術(shù)將氯氟氰蟲酰胺液體制劑注入馬尾松Pinus massoniana樹干內(nèi)，分析其對馬尾松針葉葉綠素含量、可溶性糖含量、丙二醛、苯丙氨酸解氨酶和超氧化物歧化酶的影響，探索其對馬尾松生理代謝的作用機制，為樹干注藥技術(shù)對馬尾松的安全性評價和松材線蟲病防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

4.8 %氯氟氰蟲酰胺乳油，4.5%甲維鹽乳油由江西大農(nóng)化工有限公司提供，分別裝至50 mL容量注射瓶內(nèi)。丙酮、丙二醛試劑盒、超氧岐化酶試劑盒、苯丙氨酸解氨酶試劑盒、蒽酮、乙酸乙酯等藥劑和試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司。

供試樹木馬尾松，于江西農(nóng)業(yè)大學南昌商學院校園內(nèi)選擇樹齡8 a，樹高5 ～ 6 m，胸徑8 cm左右，生長良好的馬尾松45棵。

1.2 樹干注藥及采樣

于2015年3月25日采用注干施藥技術(shù)，用便攜式電鉆傾斜45°在馬尾松樹干距地面1.3 m處打1個4 ～ 5 cm深的孔，每棵樹分別注入4.8%氯氟氰蟲酰胺乳油或4.5%甲維鹽乳油1瓶（50 mL），每個處理重復3次（每個重復5株，即2種藥劑各注15棵），以不注藥的等量馬尾松為對照（CK）。在注藥后的1 d，4 d，8 d，12 d，16 d分別在處理樹冠中部的東、西、南、北四個方向進行針葉取樣，每個方向每次取樣量不少于30 g，將針葉用自來水沖洗干凈擦干后，密封于真空封口袋中，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 生理指標測定

將待測的馬尾松針葉于105℃下殺青，80℃下烘干，稱重后研磨粉碎。葉綠素含量的測定采用丙酮法進行，具體方法參考張憲政[13]，并略有改動?？扇苄蕴呛康臏y定采用蒽酮比色法進行，具體方法參考李合生等[14]，并略有改動；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定[15]。

1.4 保護酶活性測定

酶粗提液的制備具體方法參照唐光輝等[16]，并稍作改動。苯丙氨酸解氨酶（PAL）通過測定D290值，以D290變化0.01為1個酶活力單位[17]；超氧化物歧化酶（SOD）采用黃氮藍四唑法（NBT）測定[14]，每分鐘內(nèi)抑制光氧化還原NBT 50%為1個酶活性單位（U），酶活性為每克鮮樣的U數(shù)（U·g-1）。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0軟件，Duncan法進行差異顯著性分析，作圖采用Excel軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹干注藥對馬尾松針葉葉綠素的影響

由圖1可知，處理4 d時2種藥劑均可導致總?cè)~綠素，葉綠素a，b含量下降，其中氯氟氰蟲酰胺處理葉綠素a含量降低最多（10.3%），但處理8 d后2種藥劑又可引起總?cè)~綠素，葉綠素a，b含量呈不同程度升高，仍以氯氟氰蟲酰胺的刺激作用較為顯著，16 d時葉綠素a含量較對照提高了10.5%。因此，樹干注藥對馬尾松針葉內(nèi)總?cè)~綠素含量沒有顯著影響，但對葉綠素a含量有顯著影響（表1）。

圖1 樹干注藥對馬尾松針葉葉綠素含量的影響Figure 1 Trunk injection of 2 pesticides on the chlorophyll content in leaves of P. massoniana

表1 樹干注藥后馬尾松針葉葉綠素方差分析Table 1 ANOVA on chlorophyll content in leaves of P. massoniana after trunk injection

2.2 樹干注藥對可溶性總糖含量的影響

由圖2可知，2種藥劑處理對馬尾松針葉中可溶性總糖含量有不同程度的影響。氯氟氰蟲酰胺處理8 d時可溶性總糖含量最低，比對照降低15%，12 d達到最高；甲維鹽注藥4 d時可溶性總糖含量最高，12 d時可溶性總糖含量最低，比對照降低35%。由方差分析可知，不同藥劑樹干注射對馬尾松針葉內(nèi)總可溶性糖含量沒有顯著影響（表2）。

表2 樹干注藥后馬尾松針葉可溶性糖方差分析Table 2 ANOVA on soluble sugar content in leaves of P. massoniana after trunk injection

圖2 樹干注藥對針葉中可溶性總糖含量的影響Figure 2 Effect trunk injection of pesticides on total soluble sugar content of in leaves of P. massoniana

圖3 樹干注藥后馬尾松針葉內(nèi)MDA含量的變化Figure 3 Effect trunk injection of pesticides on MDA content in leaves of P. massoniana

2.3 樹干注藥對馬尾松針葉中MDA含量的影響

由圖3可知，樹干注藥后MDA含量經(jīng)歷上升-下降的變化。2種藥劑處理4 d時，MDA含量均達到最高，與對照相比均上升了42%；藥后16 d時各藥劑處理組的MDA含量均已接近對照水平。由表3可知，不同藥劑樹干注射對馬尾松針葉內(nèi)MDA含量有顯著影響。

表3 樹干注藥后馬尾松針葉丙二醛方差分析Table 3 Variance analysis of MDA content of P. massoniana by trunk injection

2.4 樹干注藥對馬尾松針葉內(nèi)SOD活性的影響

由表4可知，不同藥劑樹干注射對馬尾松針葉內(nèi)SOD酶活性有顯著影響。由圖4可知，樹干注藥后SOD活性呈上升-下降-上升-下降的波動變化。氯氟氰蟲酰胺處理對SOD活性影響較顯著，注藥后4 d酶活性達到最高，與對照相比上升了39.5%；而甲維鹽處理4 d后酶活性也達到最高，與對照相比上升了31.7%，而處理8 d時酶活性達到最低。藥后16 d 2種藥劑處理SOD活性均逐漸接近對照水平。

表4 樹干注藥后馬尾松針葉SOD酶活性方差分析Table 4 ANOVA on SOD avtivity in leaves of P. massoniana after trunk injection

圖4 樹干注藥后馬尾松針葉內(nèi)SOD酶活性的變化Figure 4 Effect of trunk injection of pesticides on SOD activity in leaves of P. massoniana

圖5 樹干注藥后馬尾松針葉內(nèi)PAL酶活性的變化Figure 5 Effect of trunk injection of pesticides on PAL activity in leaves of P. massoniana

2.5 樹干注藥對馬尾松針葉中苯丙氨酸解氨酶PAL活性的影響

樹干注藥后PAL活性經(jīng)歷上升-下降的變化，且氯氟氰蟲酰胺對PAL酶活性影響顯著（圖5，表5）。2種藥劑處理8 d后酶活性達到最高，其中氯氟氰蟲酰胺處理與對照相比，酶活性上升了40.7%，之后迅速下降；而甲維鹽處理后8 d，與對照相比酶活性上升了22.8%，隨后緩慢下降。

表5 樹干注藥后馬尾松針葉PAL酶活性方差分析Table 5 ANOVA on PAL activity in leaves of P. massoniana after trunk injection

3 結(jié)論與討論

2種注干藥劑經(jīng)樹干注射后對馬尾松針葉內(nèi)葉綠素、可溶性總糖、MDA含量和SOD、PAL酶活性均可產(chǎn)生一定的影響，進而可能會對馬尾松的正常生理代謝產(chǎn)生一定的影響。2種注干藥劑對葉綠素、可溶性總糖含量的影響主要表現(xiàn)為先抑制后增高，而對MDA含量的影響主要表現(xiàn)為先增高后降低。藥劑處理后SOD、PAL活性均呈現(xiàn)出先上升、后抑制的波動變化，其中藥劑氯氟氰蟲酰胺對SOD、PAL活性影響較為明顯。

農(nóng)藥使用后對非靶標植物生長[18]和生理代謝的影響日益受到研究人員的關(guān)注，垂柳Salix babylonicaLinn.樹干注藥后，導致其葉片葉綠素和可溶性蛋白含量下降，垂柳的正常生理代謝受到抑制[19]；桃Amygdalus persicaL.采用樹干注藥和葉面噴霧 2種施藥方法，結(jié)果葉面噴霧造成葉綠素含量下降、凈光合速率降低，而樹干注藥則增加葉綠素含量并提高凈光合速率[20]，上述研究結(jié)果表明，農(nóng)藥可以抑制植物的生長和代謝。本研究結(jié)果表明，氯氟氰蟲酰胺和甲維鹽樹干注藥后可在短期內(nèi)使馬尾松針葉葉綠素、可溶性糖含量降低，表明該2種藥劑對葉綠素、可溶性糖含量具有抑制作用，隨著處理時間的延長，針葉抵制藥劑富集作用后逐漸適應，葉綠素、可溶性糖含量又可恢復至對照水平，而 MDA含量先增加后減少，表明樹干注藥后馬尾松的防御系統(tǒng)首先產(chǎn)生應激反應，生產(chǎn)大量MDA，隨著時間的推移，藥劑對馬尾松的脅迫逐漸減弱，馬尾松樹體可通過自身的調(diào)節(jié)作用恢復正常的生理生化代謝水平。同時，氯氟氰蟲酰胺樹干注射不同程度地提高馬尾松針葉內(nèi)SOD，PAL的活性，這與唐光輝等[16]研究結(jié)果相一致。此外，脯氨酸（與細胞壁的形成有關(guān)）含量變化和其他生理指標測定在后續(xù)的試驗中進行完善，同時將測定氯氟氰蟲酰胺注干后土壤相關(guān)酶變化等，以便更好評價氯氟氰蟲酰胺注干后對馬尾松生長和代謝的影響。

樹干注藥的藥劑使用不當會對樹體產(chǎn)生藥害，周家華等[21]進行柑橘Citrus reticulataBlanco保果試驗時，大劑量使用“噴施靈”增加了柑橘的落果量；陳運全等[22]使用高濃度營養(yǎng)液注射柑橘枝干后導致受害枝葉全部脫落。本試驗過程中發(fā)現(xiàn)，用30 mL氯氟氰蟲酰胺和甲維鹽液體制劑注射3 ～ 4年生馬尾松苗時，導致部分松苗死亡，而注射5年生以上馬尾松苗時，則未出現(xiàn)松苗死亡現(xiàn)象，表明藥劑不論注干還是葉面噴施時使用劑量要適量。有關(guān)氯氟氰蟲酰胺樹干注射的有效劑量，藥劑在馬尾松樹體內(nèi)的殘留時間以及馬尾松樹體應對氯氟氰蟲酰胺脅迫和自我調(diào)節(jié)恢復機制，有待于進一步深入研究。

參考文獻：

[1] 王慧瑜，趙玉安，賈耀軍. 樹干注射施藥技術(shù)研究概況[J]. 農(nóng)藥學學報，2005，7（2）：104-108.

[2] 高瑞桐，馮秀麗，沈波，等. 吡蟲啉殺蟲劑注干對4種鞘翅目害蟲毒殺效果研究[J]. 林業(yè)科學研究，2004，17（2）：263-266.

[3] 馬云萍，楊群輝，樊永言，等. 32%樹蟲凈樹干注射防治香樟大蓑蛾試驗[J]. 云南農(nóng)業(yè)科技，2011（5）：56-57.

[4] 周林森，王衛(wèi)斌. 兩種樹干打孔注射工具對防治注干害蟲的效果研究[J]. 山東林業(yè)科技，2012（01）：35-36，38.

[5] 唐光輝，江志利，張文鋒，等. 樹干注藥防治椰心葉甲藥效試驗[J]. 中國森林病蟲，2006，25（4）：39-41.

[6] 唐光輝. 30%敵敵畏、氧化樂果注干液劑對木本植物的藥害機理及藥效研究[D]. 咸陽：西北農(nóng)林科技大學，2001：37.

[7] 刑家華，孔小林，彭偉立，等. 一種含氰基的鄰苯二甲酰胺類化合物、制備方法和作為農(nóng)用化學品殺蟲劑的用途：CN 101935291 A[P].2011.

[8] TOHNISHI M，NAKAO H，F(xiàn)URUYA T，et al. Flubendiamide, a novel insecticide highly active against lepidopterous Insect Pests[J]. J Pestic Sci，2005，30（4）：354-360.

[9] 李洋，李淼，柴寶山，等. 新型殺蟲劑氟蟲酰胺[J]. 農(nóng)藥，2006，45（10）：698-699.

[10] 邢家華，朱冰春，袁靜，等. 新型殺蟲劑氯氟氰蟲酰胺對不同鱗翅目害蟲的毒力及田間防效[J]. 農(nóng)藥學學報，2013，15（2）：159-164.

[11] 邢家華，袁靜，郁季平，等. 新型殺蟲劑氯氟氰蟲酰胺對棉鈴蟲的毒力和田間防效[J]. 農(nóng)藥，2015，54（11）：842-843.

[12] 溫小遂，廖三臘，張林平，等. 氯氟氰蟲酰胺與數(shù)種農(nóng)藥林間防治松材線蟲病效果比較[J]. 生物災害科學，2016，39（3）：199-202.

[13] 張憲政. 植物生理學實驗技術(shù)[M]. 沈陽：遼寧科學技術(shù)出版社，1989，62-70.

[14] 李合生. 植物生理生化實驗原理與技術(shù)[M]. 北京：高等教育出版社，2001，195-196.

[15] 王學奎. 植物生理生化實驗原理和技術(shù)[ M]. 北京：高等教育出版社，2006，5.

[16] 唐光輝，張璟，何軍，等. 樹干注藥對柳樹幾種保護酶活性及游離脯氨酸含量的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學學報，2007，12（3）：32-36.

[17] 高俊鳳. 植物生理學試驗技術(shù)[M]. 北京：世界圖書出版公司，2000：203-204.

[18] DEDEK W.，PAPE J. Integrated pest control in forest management combined use of pheromones and insecticides for attracting and killing the bark bettle Ipetypo graphus. Studies with 32 p labeled Metham idophos in the Ascending sap of spruce[J]. For Ecol Manag，1988，26（1）：47-61.

[19] 唐光輝，田鵬鵬，馮俊濤. 樹干注藥對柳樹葉片幾種生理指標的影響[J]. 農(nóng)藥學學報，2006，8（4）：383-386.

[20] 董英，汪維云，吳春篤，等. 桃樹莖部施藥的生理基礎研究[J]. 農(nóng)業(yè)機械學報，1999，30（5）：76-80.

[21] 周家華. 柑桔樹干注液保花保果試驗[J]. 中國柑桔，1993，22（4）：29.

[22] 陳運全. 柑桔樹干注射營養(yǎng)液的經(jīng)驗[J]. 中國柑桔，1993，22（4）：29.