金曄，袁海延，王好，周井祥，劉艷輝，李改娟，祖岫杰

(1.吉林農業(yè)大學動物科學技術學院，吉林長春130118；2.吉林省水產科學研究院，吉林長春130033)

錦鯉皰疹病毒病 (Koi Herpesvirus Diease，KHVD)是由錦鯉皰疹病毒 (Koi Herpesvirus，KHV)引起的一種高致病性和高死亡率的病毒性疾病，死亡率高達80%。KHVD是世界動物衛(wèi)生組織 (OIE)必報疾病之一[1]，給中國及世界多個國家鯉和錦鯉養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經濟損失。目前，沒有可供使用的特效藥物來治療該種疾病，接種疫苗一直被認為是有效的治療病毒性疾病的手段，但免疫效果一直未能達到良好的目標效果[2]。

熱休克蛋白 (Heat shock protein，HSP)是細胞或生物體在各種不利條件 (包括缺氧、鹽度、重金屬、自由基、病毒感染)刺激下產生的與抗逆性相關的一類應激蛋白[3－5]。根據分子量和等電點的不同，劃分為七大家族:小 HSP、HSP40、HSP60、 HSP70、 HSP90、 HSP110和泛素[6]。 在免疫過程中，熱休克蛋白可以作為佐劑、抗原、抗原載體，能提高專一性免疫效果[7]。研究人員通過構建重組HSP－肽段復合體進行抗腫瘤免疫試驗發(fā)現(xiàn)，HSP既具有增強免疫的功能，又具有免疫佐劑的一系列特征；在抗原呈遞中通過HSP將內源性和外源性抗原呈遞給MHCⅠ分子，專一啟動CD8＋T 細胞， 激活 CTLs免疫應答[8－11]。

與其他HSP家族相比，HSP90家族含量豐富，具有非常高的保守性[12]。HSP90可與細胞中多種不同功能的蛋白結合形成復合物，調節(jié)細胞的活性，增強結構穩(wěn)定性[13]。當受到有害物質脅迫時，HSP90表達水平提高，產生熱耐受作為分子伴侶來幫助細胞，維持機體穩(wěn)態(tài)[14－15]。近年來，HSP所具有的免疫增強作用在核酸疫苗中應用廣泛。焦鳳平等[14]將重組質粒 PC－P6－gBCTL－HSP70與單純皰疹病毒Ⅱ型 (HSV－2)疫苗聯(lián)合免疫發(fā)現(xiàn)，其具有同時增強體液免疫與細胞免疫的功能；李淑君[15]研究發(fā)現(xiàn)，加入佐劑HSP65后與DNA質粒聯(lián)合，比單一滅活苗或單一DNA質粒誘導細胞免疫水平均高；Bolhassani等[16]研究發(fā)現(xiàn)，HSPgp96作為佐劑與人體乳頭瘤E7(HPV E7蛋白)聯(lián)合免疫顯示，其具有特異性細胞免疫應答。因此，加入相關熱休克蛋白佐劑以提高核酸疫苗免疫效果是必不可少的。

目前，HSP90在作為水產動物免疫佐劑方面的應用還不常見。本研究中通過構建pEGFP－C1－HSP90真核表達載體，探究pEGFP－C1－HSP90作為免疫佐劑與pIRES－ORF81核酸疫苗 (吉林農業(yè)大學動物科學技術學院重點實驗室基于KHV主要保護性抗原囊膜蛋白ORF81研制的KHV核酸疫苗，保護率達80%以上，專利號為CN102988973A)[17－19]聯(lián)合免疫的免疫效果，旨在為錦鯉皰疹病毒病的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗魚 試驗魚購自長春市某養(yǎng)魚場，選取體質量為200～300 g的健康鯉150尾，在實驗室25℃水族箱中飼養(yǎng)2周以上。

1.1.2 質粒、細胞、病毒重組 質粒 pIRESORF81、KHV陽性血清和鯉腦細胞 (CCB)由吉林農業(yè)大學動物科學技術學院保存和凍存[20]。

1.1.3 試驗試劑 DNA Marker(DL2000、DL5000)及反轉錄酶、限制性內切酶、T4DNA連接酶均為TaKaRa產品；凝膠回收試劑盒、卡那霉素、氨芐青霉素購自AxyGen公司；焦磷酸二乙酯(DEPC)購自北京鼎國公司；EndoFectin TM－Max轉染試劑購自長春維爾特科技有限公司；抗鯉IgM單克隆抗體購自AQUATIC Diagnostic Ltd；羊抗鼠酶標二抗購自三箭生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純級別。

1.2 方法

1.2.1 HSP90基因的引物設計與合成 根據Gen-Bank上登錄的鯉 HSP90基因序列 (登錄號:L513382.1)，使用Primer Premiers 5.0軟件設計引物。上、下游引物分別為

其中畫線部分依次引入XhoⅠ和EcoRⅠ限制性酶切位點，由生工生物工程 (上海)股份有限公司合成。

1.2.2 HSP90基因的克隆與鑒定 將健康試驗鯉用體積分數為75%的乙醇消毒，在超凈工作臺上解剖魚體，取其頭腎組織。采用TRizol(Invitrogen)提取總RNA，并反轉錄為cDNA，建立100 μL反轉錄體系。PCR反應程序:95℃下預變性5 min；94℃下變性30 s，63.5℃下退火30 s，共進行35個循環(huán)；在72℃下延伸1 min，于4℃下保存，用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。

將回收純化的HSP90目的基因連接至pMD－19T克隆載體，連接產物轉化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞中，經雙酶切和PCR鑒定均為陽性的重組克隆質粒保種，由生工生物工程 (上海)股份有限公司測序，將測序結果與GenBank登陸的基因序列進行BLAST比對。

1.2.3 pEGFP－C1－HSP90重組質粒的構建回收

用T4DNA連接酶將pMD19－T－HSP9目的基因與pEGFP－C1酶切回收的大片段連接后，轉入至大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α中，用含有卡那霉素液體的LB培養(yǎng)基進行篩選后，經PCR和雙酶切進行驗證。選取陽性質粒命名為pEGFP－C1－HSP90并由生工生物工程 (上海)股份有限公司進行測序。

1.2.4 重組質粒pEGFP－C1－HSP90的細胞表達將純化重組表達質粒pEGFP－C1－HSP90及pIRESORF81菌液劃線培養(yǎng)。挑取單一乳白色菌落接種到液體LB培養(yǎng)基 (Kan抗性)中，培養(yǎng)至對數生長期后進行擴搖，收集菌體進行重組質粒的大量提取。使用Nanodrop 2000超微量分光光度計測定重組表達質粒在260 nm波長時的吸光值，并計算重組表達質粒濃度 (μg/μL)，其計算公式為

用L－15培養(yǎng)基分別稀釋重組表達質粒pEGFP－C1－HSP90和轉染試劑 EndoFectionTM Max，并置于室溫。用125 μL L－15培養(yǎng)基分別稀釋重組表達質粒 pEGFP－C1－HSP90(2.5 μg) 和不同劑量 (5.0、7.5、10.0 μg) 的轉染試劑EndoFectionTM Max，并將兩者充分混勻，靜置10～20 min，形成DNA－EndoFectionTM混合物，并將混合物逐滴加入到每個細胞培養(yǎng)孔中，在26℃培養(yǎng)箱中孵育轉染細胞，24 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞轉染情況并采集圖片。

1.2.5 重組質粒 pEGFP－C1－HSP90與 pIRESORF81聯(lián)合免疫 隨機選取10尾鯉頭腎組織樣品進行PCR檢測，鑒定結果顯示均未感染KHV。將試驗魚平均分為6組，每組10尾，將表1試劑按組分配，每組配制成2000 μL，給每尾鯉肌肉注射，劑量均為200 μL。每周免疫1次，共免疫3次。

1.2.6 重組表達質粒pEGFP－C1－HSP90誘導鯉的免疫效果檢測 采用尾靜脈取血方法，免疫前采血一次，共進行3次免疫，第一次和第二次免疫一周后采血一次，第三次免疫后第一周、第二周、第三周分別采血一次。制備血清后進行間接ELISA檢測，結果通過酶標儀OD450nm測定。

表1 鯉免疫分組及注射量Tab.1 Immune groups and injection volumes in common carp

2 結果與分析

2.1 HSP90基因的PCR擴增

將鯉頭腎組織所提取的RNA進行反轉錄，獲得cDNA模板，以HSP90－F1、R2為引物進行PCR擴增，獲得與預期片段大小相符的687 bp基因，結果如圖1所示。

圖1 鯉HSP90基因的PCR擴增Fig.1 The PCR amplification product of HSP90 in common carp

2.2 克隆質粒pMD19－T－HSP90的雙酶切鑒定

使用XhoⅠ和EcoRⅠ兩種內切酶對重組質粒pMD19－T－HSP90進行雙酶切鑒定。結果顯示，符合預期結果大小，在687 bp處有明顯條帶 (圖2)，表明成功構建了重組質粒pMD19－T－HSP90。

2.3 測序結果的BLAST比對

將HSP90的測序結果在GenBank中進行BLAST比對，結果見圖3，所克隆的HSP90基因與GenBank中登入的鯉HSP90基因序列匹配度相同。

2.4 重組表達質粒pEGFP－C1－HSP90的雙酶切鑒定

將重組質粒pEGFP－C1－HSP90進行雙酶切鑒定。結果顯示，在687 bp處有明顯條帶，另一條帶在5000 bp左右 (圖4)，與預期結果相符。表明成功構建了重組質粒pEGFP－C1－HSP90。

圖 2 pMD19－T－HSP90的雙酶切Fig.2 Identification of double restriction enzyme digestion for pMD19－T－HSP90

2.5 重組質粒pEGFP－C1－HSP90的細胞表達

2.5.1 重組表達質粒濃度 根據濃度公式計算出pEGFP－C1－HSP90、 pIRES－ORF81 重組表達質粒的濃度分別為 0.95、 0.63 μg/μL。

2.5.2 重組表達質粒的轉染 將重組質粒pEGFPC1－HSP90(2.5 μg) 分別與3種不同劑量 (5.0、7.5、 10.0 μg) 的轉染試劑 EndoFectionTM Max混合后轉染至鯉腦細胞中，轉染24 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察轉染情況并成像。結果顯示，轉染試劑EndoFectionTM Max劑量為5.0 μg時轉染效果最佳，重組質粒在鯉腦細胞中的轉染熒光圖見圖5。

2.6 對試驗動物的PCR檢測

隨機選取10尾試驗鯉，對其頭腎組織樣品基因組進行PCR擴增，以KHV病毒作為陽性對照。結果顯示，所選10尾試驗鯉均為KHV陰性 (圖6)，未攜帶KHV病毒，可以進行免疫試驗。

2.7 抗體水平ELISA檢測

圖3 鯉HSP90基因的BLAST比對Fig.3 The BLAST contrast of HSP90 gene in common carp

圖4 pEGFP－C1－HSP90的雙酶切鑒定Fig.4 The PCR identification of recombinant plasmid pEGFP－C1－HSP90

圖5 pEGFP－C1－HSP90在鯉腦細胞中的表達 (5 μg)Fig.5 Expression in common carp brain(CCB)cells of pEGFP－C1－HSP90(5 μg)

通過間接ELISA方法檢測抗體水平，在450 nm處吸光值平均數和標準差的計算結果如表2所示。從表2可見，空白對照組與PBS對照組均沒有特異性抗體產生，而重組質粒單獨免疫或聯(lián)合免疫均可以獲得較高的抗體水平，免疫次數增加的同時抗體水平也隨之增加。與單獨用pIRES－ORF81核酸免疫相比，pEGFP－C1－HSP90作為佐劑聯(lián)合免疫抗體水平相對升高，其中第6組即pIRESORF81(10 μg) ＋pEGFP－C1－HSP90(20 μg) 在各免疫劑量組中相對較好，第三次免疫后兩周，抗體水平達到最高 (1.316 9)，但與其他組無顯著性差異 (P＞0.05)。后續(xù)為驗證重組質粒的安全性，在結束試驗后對試驗魚暫養(yǎng)一個月，未發(fā)現(xiàn)對魚體健康存在不良影響，并隨機篩選部分試驗魚進行了組織病理學觀察，也未發(fā)現(xiàn)異常。

表2 ELISA檢測抗體水平 (OD450 nm)Tab.2 Antibody detection(OD450 nm)by ELISA

圖6 試驗鯉的PCR檢測Fig.6 The PCR detections of the test common carp

3 討論

3.1 KHV相關疫苗研制情況

自20世紀90年代末首次對KHV的描述以來，這種病毒已經在世界范圍內流行，對鯉和錦鯉產業(yè)可持續(xù)健康發(fā)展造成極大危害。KHV也通過影響野生鯉種群進而對環(huán)境產生負面影響，其作為水生動物疫病病毒越來越被重視。但現(xiàn)有開發(fā)的核酸疫苗都或多或少存在一些問題。其中，弱毒苗雖然免疫效果較好[21－22]，但存在散毒和返強的危險，后經Yasumoto等[23]研發(fā)的用質體脂包裹甲醛滅活的KHV滅活疫苗與弱毒疫苗相比，具有安全性好、不存在散布病毒和造成KHV新疫源的危險，但其產生的保護力不強，僅為65%，需要反復多次免疫，一直未能達到預期效果。因此，為了增強核酸疫苗的免疫原性，加入如佐劑的免疫刺激劑尤為重要。

3.2 HSP90免疫佐劑研究情況

相關學者研究表明，病毒HSP90高度保守，在生物體內發(fā)揮極其重要的功能。王婷婷等[24]研究發(fā)現(xiàn)，菱鲆Psetta maxima胚胎細胞系在感染鰻弧菌Vibrio anguillarum 6 h后，HSP90β即可被檢測到且顯著上調；馮儷等[25]通過構建 PVAXHSP90重組質粒聯(lián)合核酸疫苗顯示出良好的免疫保護作用，都具有良好的免疫應答和抗原呈遞作用。

本試驗中，為增強pIRES－ORF81核酸疫苗的免疫活性，選擇 HSP90作為 KHV pIRES－ORF81疫苗的佐劑。用 pIRES－ORF81與重組表達質粒pEGFP－C1－HSP90聯(lián)合免疫患病鯉，采集鯉血清，通過間接ELISA檢測抗體水平。研究結果表明，重組質粒單獨免疫或聯(lián)合免疫均可以獲得較高的抗體水平，與單獨用pIRES－ORF81核酸免疫效果相比， pEGFP－C1－HSP90與 pIRES－ORF81聯(lián)合免疫后抗體水平相對升高?？梢钥闯觯琀SP90可以提高專一性免疫效果，重組表達質粒 pEGFP－C1－HSP90對pIRES－ORF81的抗體水平起到了促進作用，與上述學者的研究結果相似。本研究結果可為后續(xù)水生動物熱休克蛋白研究提供參考數據，還可為錦鯉皰疹病毒病的疫苗研制及用免疫佐劑聯(lián)合免疫治療提供新的思路。

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