韓天坤， 楊鳳、2， 賈甲， 李曉旭， 閆喜武、2

(1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連116023；2.遼寧省貝類良種繁育工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116023)

菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum隸屬于軟體動(dòng)物門Mollusca、雙殼綱Bivalvia、簾形目Veneroida、簾蛤科 Veneridae、蛤仔屬 Ruditapes，是世界性養(yǎng)殖貝類，也是中國(guó)單種產(chǎn)量最高的養(yǎng)殖貝類。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于菲律賓蛤仔的研究主要集中在繁殖生物學(xué)[1－3]、 養(yǎng)殖技術(shù)與工藝[4]、養(yǎng)殖生態(tài)學(xué)[5－8]和遺傳育種[9－10]等方面， 而關(guān)于總氨態(tài)氮(TAN)對(duì)菲律賓蛤仔的影響研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

TAN是養(yǎng)殖生產(chǎn)中最容易積累的有毒物質(zhì)，關(guān)于TAN與貝類關(guān)系的研究已有報(bào)道。Ferretti等[11]研究表明，在pH為 (8.14±0.06)、溫度為(19.7±0.4)℃、鹽度為 (31.0±0.5) 條件下，海水中的氨對(duì)蛤蜊Spisula solidissima幼蟲的48 h LC50為10.6 mg/L(非離子氨濃度為0.53 mg/L)。楊鳳等[12]研究表明，在 pH為 7.63、7.98、8.34、8.74時(shí)，總氨對(duì)海灣扇貝Argopecten irradians幼貝的 96 h LC50依次為 20.01、 11.85、 3.32、 0.55 mg/L。師尚麗等[13]和羅杰等[14]的研究表明，隨著鹽度的降低和pH的升高，氨氮對(duì)方斑東方螺Babylonia areolata和管角螺Hemifusus tuba稚貝的毒性增強(qiáng)。欒紅兵等[15]研究表明，氨氮濃度達(dá)到0.14 mg/L時(shí)，不影響海灣扇貝幼體發(fā)育。譚燁輝等[16]研究表明，在皺紋盤鮑用水和養(yǎng)鮑自污染水中，非離子氨濃度分別低于0.035、0.010 mg/L時(shí)，對(duì)皺紋盤鮑生長(zhǎng)無(wú)影響。Reddy－Lopata等[17]研究表明，氨對(duì)南非鮑魚Haliotis midae Linnaeus存活和生長(zhǎng)都具有負(fù)面影響。Wang等[18]研究表明，溫度和氨濃度對(duì)近江牡蠣Crassostrea ariakensis受精率和孵化率的二次效應(yīng)極顯著。呂永林等[19]研究表明，隨著溫度的升高，氨氮對(duì)泥蚶Tegillarca granosa的毒性增強(qiáng)。上述研究結(jié)果均表明，氨態(tài)氮對(duì)貝類的毒性受鹽度、pH和溫度的影響。

本研究中，研究了菲律賓蛤仔受精卵至稚貝階段 (室內(nèi)培育階段)對(duì)TAN的耐受性，以期為建立和完善菲律賓蛤仔室內(nèi)人工育苗水質(zhì)指標(biāo)及改進(jìn)育苗技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用菲律賓蛤仔 (以下簡(jiǎn)稱蛤仔)的受精卵、浮游階段和稚貝階段的幼體均由大連市莊河貝類養(yǎng)殖場(chǎng)育苗場(chǎng)提供。用于人工催產(chǎn)的親貝殼長(zhǎng)為(3.32±2.6)cm，殼高為 (2.09±0.3)cm，體質(zhì)量為 (7.78±2.7)g。

1.2 方法

在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上按等對(duì)數(shù)間距設(shè)置TAN濃度梯度，以不加NH4Cl(分析純)的天然海水作為對(duì)照。試驗(yàn)用水為沙濾海水，全部試驗(yàn)均在2.5 L聚乙烯桶中進(jìn)行，用恒溫加熱棒水浴控溫。試驗(yàn)期間，用pHS－3C型數(shù)字酸度計(jì)測(cè)定pH，采用奈氏試劑法測(cè)定TAN濃度，采用重氮－偶氮比色法測(cè)定亞硝酸鹽含量。試驗(yàn)水溫為21～24℃，pH為7.9～8.3，鹽度為 27～30，亞硝酸鹽為 0.02～0.07 mg/L。孵化期、浮游期和稚貝期TAN毒性試驗(yàn)中TAN的實(shí)際濃度如表1所示。

表1 孵化期、浮游期和稚貝期毒性試驗(yàn)中TAN的濃度Tab.1 Experimental contents of TAN during incubation，pelagic stage and juvenile in Manila clam Ruditapes philippinarum mg/L

1.2.1 孵化階段毒性試驗(yàn) 試驗(yàn)設(shè)7個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組 (表1)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)濃度組受精卵密度為80個(gè)/mL。試驗(yàn)期間，白天攪水夜間充氣，整個(gè)過(guò)程不投餌。24 h后測(cè)定D形幼蟲密度，同時(shí)測(cè)定換水前后TAN、亞硝酸鹽含量和pH，并按下式計(jì)算孵化率和畸形率:

1.2.2 浮游階段毒性試驗(yàn) 試驗(yàn)設(shè)6個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組 (表1)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)濃度組中放入剛孵化的殼長(zhǎng)為 (103.2±3.0)μm的D形幼蟲，密度為4～5個(gè)/mL，試驗(yàn)密度以放入后實(shí)測(cè)值為準(zhǔn)。每24 h全量換水1次，每天投餌4次，前期每天投喂等鞭金藻5000 cells/mL，后期每天逐步增至 40 000 cells/mL。在24、48、72、96 h時(shí)，測(cè)定D形幼蟲的密度和殼長(zhǎng)，同時(shí)測(cè)定換水前后TAN、亞硝酸鹽含量和pH。以試驗(yàn)期間TAN濃度和pH的平均值作為試驗(yàn)和計(jì)算非離子氨(UIA)的真實(shí)值。相關(guān)計(jì)算公式為

1.2.3 稚貝階段毒性試驗(yàn) 試驗(yàn)設(shè)7個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組 (表1)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)濃度組放入殼長(zhǎng)為(318.1±27.3)μm、殼高為 (291.0±41.1)μm的試驗(yàn)稚貝，密度為120個(gè)/L，每24 h全量換水1次，每天投餌2次，按水體積的1%混合投喂金藻、新月菱形藻和小球藻。96 h后測(cè)定稚貝存活率和殼長(zhǎng)、殼高，同時(shí)測(cè)定換水前后TAN、亞硝酸鹽含量和pH。存活率、相對(duì)生長(zhǎng)和校正死亡率的計(jì)算同 “1.2.2”節(jié)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用概率單位法求半致死濃度LC50和LC5(死亡率為5%時(shí)的TAN濃度)，當(dāng)數(shù)據(jù)不符合概率單位法的基本原理時(shí)，選擇50%死亡率附近的濃度，用直線內(nèi)插法求LC50[20]。設(shè)定對(duì)觀測(cè)指標(biāo) (孵化率、相對(duì)生長(zhǎng))產(chǎn)生5%負(fù)面影響的TAN濃度為無(wú)影響的TAN有效濃度 (EC5)，根據(jù)觀測(cè)指標(biāo)與TAN濃度的關(guān)系曲線求5%有效濃度EC5和半數(shù)有效濃度EC50(使觀測(cè)指標(biāo)下降5%或50%所對(duì)應(yīng)的TAN濃度)。

非離子氨含量ρNH3－N按下式計(jì)算:

2 結(jié)果與分析

2.1 TAN對(duì)蛤仔孵化率和初孵D形幼蟲畸形率的影響

從圖1可見(jiàn)，在pH為 (8.28±0.03)、鹽度為30、水溫為 (22.6±1.2)℃時(shí)，TAN≤29.5 mg/L(UIA≤2.03 mg/L)條件下，蛤仔受精卵均可孵化出D形幼蟲，但是隨著TAN濃度的逐漸升高，其孵化率逐漸下降，畸形率逐漸升高。

回歸分析表明，TAN濃度的常用對(duì)數(shù) (x)與孵化率 (yf)呈極顯著負(fù)相關(guān) (圖2)，回歸方程為

圖1 TAN對(duì)菲律賓蛤仔孵化率和畸形率的影響Fig.1 Effect of TAN on hatching rate and deformityrate in Manila clam Ruditapes philippinarum

把對(duì)照組的孵化率按100%計(jì)算，由回歸方程求得TAN對(duì)蛤仔孵化率的24 h EC5為1.89 mg/L(UIA濃度為0.13 mg/L)，24 h EC50為7.29 mg/L(UIA濃度為0.502 mg/L)。

回歸分析表明，TAN濃度的常用對(duì)數(shù) (x)與畸形率 (yj)呈極顯著直線正相關(guān) (圖2)，回歸方程為

把對(duì)照組的畸形率按0%計(jì)算，由回歸方程求得TAN對(duì)蛤仔畸形率的24 h EC5為0.316 mg/L(UIA濃度為0.022 mg/L)。計(jì)算得24 h EC50濃度較大，孵化時(shí)期一般達(dá)不到此濃度，故在此不進(jìn)行討論。

圖2 TAN濃度對(duì)數(shù)與菲律賓蛤仔孵化率和畸形率的關(guān)系Fig.2 Relationship between the logarithm of TAN concentration and hatching rate and deformity rate in Manila clam Ruditapes philippinarum

2.2 TAN對(duì)浮游期幼蟲死亡率和生長(zhǎng)的影響

2.2.1 對(duì)浮游期幼蟲死亡率的影響 從圖3可見(jiàn):水溫為 (22.0±0.2)℃、鹽度為27、pH為 (7.9±0.09)條件下脅迫96 h時(shí)，TAN為29.3 mg/L濃度組的D形幼蟲100%死亡；當(dāng)TAN≤11.8 mg/L時(shí)，各試驗(yàn)組均有幼蟲存活，而TAN濃度為0.055 mg/L(UIA濃度為0.001 mg/L)和0.334 mg/L(UIA濃度為0.009 mg/L)組的幼蟲平均死亡率為0；當(dāng)TAN≥4.72 mg/L(UIA≥0.126 mg/L)時(shí)，死亡率隨TAN濃度的升高而直線上升。

由直線內(nèi)插法求得TAN對(duì)D形幼蟲死亡率的24、 48、 72、 96 h LC50依次為 17.0、 15.8、 10.2、7.94 mg/L，相應(yīng)的 UIA濃度分別為 0.454、0.422、 0.272、 0.212 mg/L。

圖3 不同TAN濃度下D形幼蟲的死亡率Fig.3 Mortality of D－larval Manila clam Ruditapes philippinarum exposed to various TAN concentrations

2.2.2 對(duì)浮游期幼蟲相對(duì)生長(zhǎng)的影響 從圖4可見(jiàn):當(dāng)TAN≤0.784 mg/L時(shí)，對(duì)浮游期幼蟲相對(duì)生長(zhǎng)沒(méi)有影響，甚至比對(duì)照組還高；當(dāng)TAN濃度為0.784～29.3 mg/L時(shí)，隨著TAN濃度的增加，相對(duì)生長(zhǎng)減慢。在濃度為0.784～29.3 mg/L范圍內(nèi)線性回歸表明，24、48、72、96 h的相對(duì)生長(zhǎng)與TAN濃度的常用對(duì)數(shù)均呈顯著直線相關(guān) (表4)。

取TAN濃度為0.055、0.334、0.784 mg/L組相對(duì)生長(zhǎng)的平均值為100%，根據(jù)回歸方程 (表4)求得 24 h EC5、 48 h EC5、 72 h EC5和 96 h EC5依次為3.22、1.20、1.84、3.16 mg/L，相應(yīng)的 UIA濃度分別為0.086、 0.032、0.049、0.084 mg/L。

圖4 不同TAN濃度下菲律賓蛤仔D形幼蟲的相對(duì)生長(zhǎng)Fig.4 Relative growth of D－larval Manila clam Ruditapes philippinarum exposed to different TAN concentrations

表4 菲律賓蛤仔D形幼蟲相對(duì)生長(zhǎng) (yt)與TAN濃度對(duì)數(shù) (lg x)的回歸方程參數(shù)及EC5Tab.4 Parameters of logarithmic regression equation between relative growth(yt)and TAN(lg x)concentrations and effective concentration(EC5)for D－larval Manila clam Ruditapes philippinarum

2.3 TAN對(duì)稚貝的急性毒性分析

2.3.1 對(duì)稚貝死亡率的影響 從圖5可見(jiàn):在pH為 (8.13±0.04)、鹽度為 30、水溫為 (20.5±1.22)℃條件下脅迫96 h時(shí)，隨著TAN濃度的升高稚貝死亡率升高；當(dāng)TAN≤9.76 mg/L(UIA≤0.418 mg/L)時(shí)，對(duì)稚貝死亡無(wú)明顯影響；當(dāng)TAN≥14.5 mg/L(UIA≥0.623 mg/L)時(shí)，隨著TAN濃度的增加稚貝死亡率增加。

由概率單位法求得TAN對(duì)稚貝死亡率的96 h LC5為9.62 mg/L(UIA濃度為0.412 mg/L)，96 h LC50為49.0 mg/L(UIA濃度為2.10 mg/L)(圖6)。

圖5 不同TAN濃度下菲律賓蛤仔稚貝的死亡率Fig.5 Mortality of juvenile Manila clam Ruditapes philippinarum exposed to various TAN concentrations

圖6 TAN濃度對(duì)數(shù)與菲律賓蛤仔稚貝死亡率概率單位的關(guān)系Fig.6 Relationship between the logarithm of TAN concentrations and the probability unit of juvenile Manila clam Ruditapes philippinarum

2.3.2 對(duì)稚貝相對(duì)生長(zhǎng)的影響 從圖7可見(jiàn):脅迫96 h時(shí)，各個(gè)試驗(yàn)組稚貝的殼長(zhǎng)相對(duì)生長(zhǎng)均低于對(duì)照組；當(dāng) TAN≤14.5 mg/L(UIA≤0.623 mg/L)時(shí)，殼長(zhǎng)相對(duì)生長(zhǎng)呈直線下降；當(dāng)TAN≥21.7 mg/L(UIA≥0.928 mg/L)時(shí)，稚貝相對(duì)生長(zhǎng)無(wú)明顯規(guī)律，甚至為負(fù)生長(zhǎng)。

圖7 不同TAN濃度下菲律賓蛤仔稚貝殼長(zhǎng)的相對(duì)生長(zhǎng)Fig.7 Relative growth of shell length of juvenile Manila clam Ruditapes philippinarum exposed to different TAN concentrations

將對(duì)照組的殼長(zhǎng)相對(duì)生長(zhǎng)校正為100%，在TAN濃度14.5 mg/L(UIA濃度為0.623 mg/L)以下，以TAN的濃度對(duì)數(shù)與殼長(zhǎng)相對(duì)生長(zhǎng)作回歸(圖8)，得到回歸方程為

由回歸方程求得TAN對(duì)稚貝殼長(zhǎng)相對(duì)生長(zhǎng)的96 h EC5為0.45 mg/L(UIA濃度為0.019 mg/L)，96 h EC50為4.9 mg/L(UIA濃度為0.21 mg/L)。

從圖9可見(jiàn):各試驗(yàn)組的殼高相對(duì)生長(zhǎng)均低于對(duì)照組；當(dāng)TAN≤21.7 mg/L(UIA≤0.928 mg/L)時(shí)，稚貝殼高相對(duì)生長(zhǎng)呈直線下降；當(dāng) TAN≥31.4 mg/L(UIA≥1.35 mg/L)時(shí)，稚貝殼高相對(duì)生長(zhǎng)無(wú)明顯規(guī)律。

將對(duì)照組的殼高相對(duì)生長(zhǎng)校正為100%，在TAN濃度為21.7 mg/L(UIA濃度為0.928 mg/L)以下時(shí)，以TAN的濃度對(duì)數(shù) (x)與殼高 (yg)的相對(duì)生長(zhǎng)作回歸，得到回歸方程為

由回歸方程求得TAN對(duì)稚貝殼高相對(duì)生長(zhǎng)的96 h EC5為0.508 mg/L(UIA濃度為0.022 mg/L)，96 h EC50為10.5 mg/L(UIA濃度為0.448 mg/L)。

圖8 TAN濃度對(duì)數(shù)與菲律賓蛤仔稚貝殼長(zhǎng)相對(duì)生長(zhǎng)的關(guān)系Fig.8 Relationship between the logarithm of TAN concentration and relative growth of shell length of juvenile Manila clam Ruditapes philippinarum

圖9 不同TAN濃度下菲律賓蛤仔稚貝殼高的相對(duì)生長(zhǎng)Fig.9 Relative growth of shell height of juveniles of Manila clam Ruditapes philippinarum at different TAN concentrations

圖10 TAN濃度對(duì)數(shù)與菲律賓蛤仔稚貝殼高相對(duì)生長(zhǎng)的關(guān)系Fig.10 Relationship between the logarithm of TAN concentration and relative growth of shell height of juvenile Manila clam Ruditapes philippinarum

3 討論

3.1 總氨態(tài)氮對(duì)菲律賓蛤仔幼體發(fā)育和生長(zhǎng)的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著TAN濃度的升高，蛤仔的畸形率 (圖1、圖2)、D形幼蟲死亡率 (圖3)和稚貝死亡率 (圖5、圖6)呈上升趨勢(shì)，而孵化率 (圖1、圖2)、D形幼蟲相對(duì)生長(zhǎng) (圖4)及稚貝的相對(duì)生長(zhǎng) (圖7～圖10)呈下降趨勢(shì)。但在不同階段，蛤仔對(duì)TAN的耐受力不同。不同時(shí)期蛤仔對(duì)TAN耐受力的比較見(jiàn)表5。

通常用半致死濃度LC50和半數(shù)有效濃度EC50來(lái)比較試驗(yàn)生物對(duì)毒物的耐受能力，因?yàn)長(zhǎng)C50和EC50能夠較好地消除個(gè)體差異對(duì)毒物毒性的反應(yīng)[20]。由表5可知，非離子氨對(duì)D形幼蟲的96 h LC50(0.212 mg/L)＜對(duì)孵化率的24 h EC50(0.502 mg/L) ＜對(duì)稚貝的96 h LC50(2.10 mg/L)。說(shuō)明浮游期對(duì)TAN最敏感，稚貝階段對(duì)TAN的耐受性最強(qiáng)。這一結(jié)論與袁洪梅等[21]對(duì)海灣扇貝的研究結(jié)果相似。其原因可能是與營(yíng)浮游生活的D形幼蟲相比，稚貝有更加堅(jiān)固的貝殼保護(hù)，并且經(jīng)過(guò)變態(tài)發(fā)育后體內(nèi)各個(gè)器官發(fā)育更加完善，從而提高了機(jī)體對(duì)TAN的耐受力。而受精卵有卵膜保護(hù)，并且孵化期只有24 h，脅迫時(shí)間較短。因此，在蛤仔育苗期間，注意調(diào)控和保持浮游期水質(zhì)在良好狀態(tài)，將有利于提高蛤仔苗種培育的成活率。

從稚貝階段相對(duì)生長(zhǎng)的EC5和EC50可以看出，TAN對(duì)殼長(zhǎng)生長(zhǎng)的影響比對(duì)殼高生長(zhǎng)影響要大，具體原因還有待于進(jìn)一步研究。

浮游期高濃度組 (≥4.72 mg/L)72 h和96 h的相對(duì)生長(zhǎng)較24 h和48 h時(shí)異常升高 (圖4)，原因可能是，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，高濃度組的D形幼蟲死亡率高、密度小，每個(gè)個(gè)體獲得餌料量較低濃度組多，相對(duì)空間更大，導(dǎo)致高濃度組存活下來(lái)的幼體生長(zhǎng)速度可能比低濃度組更快。而稚貝階段的殼長(zhǎng)相對(duì)生長(zhǎng)在高濃度組出現(xiàn)了負(fù)增長(zhǎng) (圖7)，原因可能是高濃度組的TAN脅迫導(dǎo)致稚貝沒(méi)有生長(zhǎng)，并且較大個(gè)體中毒死亡所致。

3.2 菲律賓蛤仔對(duì)TAN耐受能力與其他貝類比較

關(guān)于貝類受精卵、D形幼蟲和稚貝對(duì)TAN的耐受性研究報(bào)道較少。與其他學(xué)者的研究進(jìn)行比較結(jié)果發(fā)現(xiàn):蛤仔在浮游階段 (殼長(zhǎng)0.103 mm)對(duì)非離子氨的耐受能力較殼長(zhǎng)為0.103～0.245 mm的海灣扇貝[21]強(qiáng)；蛤仔在稚貝階段 (殼長(zhǎng) 0.318 mm)對(duì)非離子氨的耐受能力比魁蚶 (殼長(zhǎng)2.01 mm)[22]、橄欖蚶 (殼長(zhǎng)2.72 mm)[23]弱，但比美國(guó)牡蠣 (殼長(zhǎng)13～17 mm)[24]、日本海神蛤 (殼長(zhǎng)10 mm)[25]、海灣扇貝 (殼長(zhǎng)10～15 mm)[12]和毛蚶[26](殼長(zhǎng)1.58 mm) 強(qiáng) (表6)。

表5 菲律賓蛤仔幼體不同發(fā)育階段對(duì)TAN的耐受性比較Tab.5 Tolerance of larval Manila clam Ruditapes philippinarum to TAN at different developmental stages mg/L

表6 TAN對(duì)幾種貝類的96 h LC50的比較Tab.6 Comparison of 96 h LC50of TAN with other molluscs

3.3 菲律賓蛤仔育苗用水中總氨態(tài)氮的安全濃度

毒物的安全濃度是指對(duì)特定生物整個(gè)生活史均沒(méi)有影響的濃度，可以依據(jù)96 h LC50×f計(jì)算得到，其中f為系數(shù)[20]。對(duì)于容易降解的有毒物質(zhì) (如TAN)，f值可取0.1[20]。由此，根據(jù)D形幼蟲的96 h LC50(表5)計(jì)算得到非離子氨的安全濃度為0.021 mg/L，根據(jù)稚貝的96 h LC50(表5)計(jì)算得到非離子氨的安全濃度為0.210 mg/L?？梢?jiàn)，用不同發(fā)育階段的受試生物進(jìn)行毒性試驗(yàn)所得安全濃度不同。從嚴(yán)控制水質(zhì)的話，根據(jù)最敏感的D形幼蟲階段試驗(yàn)結(jié)果，可以計(jì)算得到其非離子氨的安全濃度為0.021 mg/L，該值接近漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的0.020 mg/L[27]。綜合各個(gè)階段的EC5和EC50，建議蛤仔育苗期間浮游期非離子氨濃度控制在0.020 mg/L以下為好 (pH＜8.5時(shí)，TAN＜0.200 mg/L)，稚貝階段非離子氨濃度控制在0.030 mg/L以下為好 (pH＜8.5時(shí)，TAN＜0.700 mg/L)。

在蛤仔苗種生產(chǎn)中TAN的主要來(lái)源是殘餌和排泄物的分解，所以要適量投喂新鮮優(yōu)質(zhì)餌料。由于高pH條件下氨態(tài)氮的毒性增強(qiáng)，所以要經(jīng)常監(jiān)測(cè)pH和氨態(tài)氮的含量，避免高pH時(shí)氨態(tài)氮中毒。本研究中所得結(jié)論為完善菲律賓蛤仔生態(tài)學(xué)及育苗期間的水質(zhì)調(diào)控技術(shù)提供了參考。

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