于新然， 姚洪， 葉仕根， 黎睿君， 李華， 李強(qiáng)

(1.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023；2.鹽城工學(xué)院 海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城224051)

遲緩愛德華氏菌Edwardsiella tarda為革蘭氏陰性細(xì)菌，隸屬于腸桿菌科、愛德華菌屬，是一種人畜共患菌，感染范圍廣泛，可引起大菱鲆Scophthalmus maximus、鰻鱺 Anguilla japonica、鯉 Cyprinus carpio等多種海水及淡水魚類患病，是水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物主要病原菌之一[1－2]。該菌在大菱鲆養(yǎng)殖生產(chǎn)中危害尤為嚴(yán)重，大菱鲆感染遲緩愛德華氏菌可引起腹腔積水、充血，部分病魚底板發(fā)紅，同時(shí)，腹部?jī)蓚?cè)發(fā)生潰瘍且潰瘍邊緣出血，剖檢肝臟出現(xiàn)蒼白囊腫等臨床癥狀[3]。

遼寧省葫蘆島市是中國(guó)大菱鲆的主要養(yǎng)殖區(qū)，養(yǎng)殖產(chǎn)量占中國(guó)近60%，近年來(lái)，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和環(huán)境的惡化，魚類疾病已成為制約葫蘆島市大菱鲆產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素，其中遲緩愛德華氏菌感染引起的腹水、白便癥狀尤為嚴(yán)重。筆者所在研究團(tuán)隊(duì)一年來(lái)對(duì)葫蘆島市養(yǎng)殖大菱鲆感染遲緩愛德華氏菌情況進(jìn)行了調(diào)查，并對(duì)分離菌株的毒力進(jìn)行了分析，同時(shí)，結(jié)合ERIC－PCR技術(shù)對(duì)分離菌株進(jìn)行了指紋圖譜分析，以期為研究遲緩愛德華氏菌積累資料，并為葫蘆島市養(yǎng)殖大菱鲆遲緩愛德華氏菌感染的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

患病大菱鲆取自葫蘆島興城市4家養(yǎng)殖場(chǎng)和綏中縣5家養(yǎng)殖場(chǎng)，體長(zhǎng)為10～20 cm，主要癥狀為腹水、白便、腸炎和紅底板。采樣時(shí)間為2014年1月—2015年4月，每月定期采樣，共獲得135尾病魚。

遲緩愛德華氏菌參考菌株 (ATCC15947)和燦爛弧菌 (2CLM002)由大連海洋大學(xué)海珍品疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離 無(wú)菌條件下，取病魚肝、脾、腎和心等部位，以平板劃線分離法劃線接種于胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)24～48 h，挑選優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行純化。

1.2.2 細(xì)菌鑒定 選用遲緩愛德華氏菌特異性引物對(duì)分離菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，陽(yáng)性菌株保存?zhèn)溆?。正、反向引物[4]分別為

PCR 反應(yīng)體系 (25 μL):10×PCR buffer(含Mg2＋)2.5 μL， dNTP Mix 2 μL， 正、 反向引物 (10 pmol/μL) 各 0.5 μL， 模板 (40 ～ 80 ng)1 μL，Taq DNA Polymerase(BBI)0.125 μL， 用 ddH2O補(bǔ)足至 25 μL。

反應(yīng)程序?yàn)?94℃下預(yù)變性5 min；94℃下循環(huán)變性30 s，63℃下退火20 s，72℃下延伸20 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后在72℃下再延伸10 min。

1.2.3 毒力分析

(1)毒力基因檢測(cè)。選取遲緩愛德華氏菌的4個(gè)主要毒力基因，包括 esaV、katB、fimA、gadB，對(duì)遲緩愛德華氏菌分離株進(jìn)行毒力分析。PCR反應(yīng)體系 (25 μL):10×PCR buffer(含 Mg2＋)2.5 μL， dNTP Mix 2 μL， 正、 反向引物 (10 pmol/μL)各 0.5 μL， 模板 (40～80 ng)1 μL， Taq DNA Polymerase(BBI)0.125 μL， 用 ddH2O 補(bǔ)足至 25 μL。引物序列設(shè)計(jì)和條件參照張曉君等[5]、李杰[6]的研究，見表1。

毒力基因檢測(cè)PCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃下預(yù)變性5 min；94℃下循環(huán)變性30 s，72℃下延伸1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后在72℃下再延伸10 min。fimA、gadB基因在55℃下退火1 min。esav、katB基因在56℃下退火和延伸30 s，72℃下再延伸40 s。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行拍照和判定。

(2)人工感染試驗(yàn)。選取健康大菱鲆 (體長(zhǎng)為10 cm，體質(zhì)量為30 g)，在規(guī)格為60 cm×40 cm×30 cm的水槽中暫養(yǎng)7 d，養(yǎng)殖用水為大連市黑石礁海域沙濾海水，養(yǎng)殖期間鹽度為30，水溫為15～16℃，24 h不間斷充氧。試驗(yàn)前將魚隨機(jī)分為23組，每組15尾魚。選取22株遲緩愛德華氏菌分離株，活化培養(yǎng)后制成菌濃度為1.0×108cell/mL的菌懸液，對(duì)魚進(jìn)行腹腔注射，每尾注射0.2 mL，對(duì)照組注射等量生理鹽水。連續(xù)觀察14 d，每天換水并記錄魚的死亡情況。

1.2.4 ERIC－PCR分型 ERIC－PCR引物參照Maiti等[7]的設(shè)計(jì)。正、反向引物分別為

PCR 反應(yīng)體系 (25 μL):10×PCR buffer(含Mg2＋)2.5 μL， dNTP Mix 2 μL， 正、 反向引物(10 pmol/μL) 各 1 μL， 模板 (40～80 ng)2 μL，Taq DNA Polymerase(BBI)0.125 μL， 用 ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃下預(yù)變性7 min；94℃下循環(huán)變性30 s，52℃下退火復(fù)性1 min，65℃下延伸8 min，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；最后在65℃下再延伸16 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離與鑒定結(jié)果

從135尾患病大菱鲆中共分離獲得98株優(yōu)勢(shì)菌，選用遲緩愛德華氏菌特異性引物對(duì)分離菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共鑒定出22株遲緩愛德華氏菌 (圖1)。

2.2 毒力基因檢測(cè)

采用4種毒力基因的特異性引物對(duì)22株遲緩愛德華氏菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，22株分離株在目的條帶處均出現(xiàn)清晰條帶 (圖2)。22株遲緩愛德華氏菌4種毒力基因的攜帶率均為100%，毒力基因型為 esaV＋fimA＋gadB＋katB＋。

2.3 人工感染試驗(yàn)結(jié)果

22株遲緩愛德華氏菌人工感染試驗(yàn)結(jié)果 (表2)顯示，感染組第2天出現(xiàn)死亡，第3天出現(xiàn)死亡高峰，5 d內(nèi)致死率均為100%，菌株毒力較強(qiáng)。感染大菱鲆臨床癥狀主要以紅底板為主，伴有紅嘴，鰭基部充血發(fā)紅。剖檢發(fā)現(xiàn)，肝臟蒼白，腸道紅腫并出現(xiàn)不同程度充血，腹腔內(nèi)充斥少量淡紅色或淺黃色黏液。

圖1 22株遲緩愛德華氏菌分離株特異性引物鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of 22 isolates by PCR with the specific primers of Edwardsiella tarda

圖2 22株遲緩愛德華氏菌分離株毒力基因esaV、fimA、gadB、katB的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The PCR amplification product of virulence genes esaV，fimA，gadB，and katB in 22 isolates of Edwardsiella tarda

2.4 ERIC－PCR 分型

遲緩愛德華氏菌分離株和參考株ATCC15947經(jīng)ERIC－PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物為6～17條，主帶4～8條，大小介于100～2000 bp(圖3)。經(jīng)聚類分析，22株遲緩愛德華氏菌與ATCC15947株可分為2個(gè)基因型，分別標(biāo)記為Ⅰ和Ⅱ型 (圖4)。其中葫蘆島市22株遲緩愛德華氏菌分離株呈現(xiàn)相似的聚類特征，均為Ⅱ型，與ATCC15947株為Ⅰ型明顯不同。根據(jù) Hunter等[8]的計(jì)算方法，該分型方法的辨別指數(shù)值為87%。

3 討論

本研究中對(duì)遼寧省葫蘆島市養(yǎng)殖大菱鲆遲緩愛德華氏菌感染情況進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葫蘆島市大菱鲆感染遲緩愛德華氏菌后呈現(xiàn)高發(fā)病率和高死亡率，一年四季均有感染，其中，8、9月份高水溫期病情有加重的趨勢(shì)。患病大菱鲆中共分離獲

得了89株優(yōu)勢(shì)菌，其中22株被鑒定為遲緩愛德華氏菌，說(shuō)明遲緩愛德華氏菌是葫蘆島地區(qū)養(yǎng)殖大菱鲆的主要病原菌之一。

表2 遲緩愛德華氏菌分離株人工感染試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of challenge tests by Edwardsiella tarda isolates

圖3 遲緩愛德華氏菌分離株的ERIC－PCR指紋圖Fig.3 ERIC－PCR fingerprint of Edwardsiella tarda isolates

圖4 遲緩愛德華氏菌分離株指紋圖譜聚類分析圖Fig.4 Fingerprint clustering analysis diagram of Edwardsiella tarda isolates

大菱鲆對(duì)遲緩愛德華氏菌的易感性較高，不同月齡大菱鲆均能感染遲緩愛德華氏菌，無(wú)明顯季節(jié)性，且感染率和致死率均較高[9－11]。此外，大菱鲆感染遲緩愛德華氏菌臨床癥狀表現(xiàn)復(fù)雜化，它可引起體表出血、肝腎潰瘍、腹部鼓脹且有腹水，肛門直腸脫出體外，急性感染時(shí)無(wú)明顯癥狀等[12－13]。王波等[3]研究發(fā)現(xiàn)，大菱鲆感染遲緩愛德華氏菌主要表現(xiàn)為腹腔積水、充血，部分病魚底板發(fā)紅，同時(shí)腹部?jī)蓚?cè)發(fā)生潰瘍且潰瘍邊緣出血，剖檢肝臟出現(xiàn)蒼白、囊腫等臨床癥狀，這些癥狀與此次調(diào)查結(jié)果一致。

通過(guò)對(duì)22株遲緩愛德華氏菌分離株毒力基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增，結(jié)果顯示，22株分離株均含有esaV、katB、fimA和gadB基因?，F(xiàn)已報(bào)道遲緩愛德華氏菌存在14種毒力基因，其中，esaV和katB為遲緩愛德華氏菌主要毒力基因，esaV編碼遲緩愛德華氏菌的Ⅲ型分泌系統(tǒng)裝置蛋白，katB幫助遲緩愛德華氏菌抵御巨噬細(xì)胞的氧呼吸爆發(fā)，并在細(xì)胞中大量生殖導(dǎo)致巨噬細(xì)胞生成NO和腫瘤壞死因子[14－18]。江云等[19]通過(guò)檢測(cè)4株遲緩愛德華氏菌發(fā)現(xiàn)，fimA和gadB僅能在致病性遲緩愛德華氏菌菌株中檢測(cè)到。fimA擁有黏附、侵染機(jī)體細(xì)胞的能力[20]；gadB賦予遲緩愛德華氏菌在細(xì)胞內(nèi)生存的能力，并突破機(jī)體的免疫保護(hù)屏障[21－22]。人工感染試驗(yàn)結(jié)果表明，分離到的22株遲緩愛德華氏菌均具有較強(qiáng)的致病性，均可引起養(yǎng)殖大菱鲆死亡，這與上述毒力基因在致病株的檢測(cè)報(bào)道結(jié)果吻合。

ERIC－PCR結(jié)果顯示，從葫蘆島市分離到的22株遲緩愛德華氏菌能擴(kuò)增出6～17條帶，均為一種基因型，說(shuō)明該地區(qū)遲緩愛德華氏菌菌株有聚類趨勢(shì)，Acharya等[23]對(duì)整個(gè)養(yǎng)殖池塘中分離到的27株遲緩愛德華氏菌進(jìn)行ERIC－PCR基因分析，結(jié)果顯示有5個(gè)基因型，這可能由于遲緩愛德華氏菌在不同環(huán)境如水體、底泥，以及不同水生動(dòng)物體表與體內(nèi)生長(zhǎng)繁殖的差異導(dǎo)致。Abayneh等[24]通過(guò)MLSA方法對(duì)采集于歐洲、亞洲的分離菌株及標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行種內(nèi)分析發(fā)現(xiàn)，遲緩愛德華氏菌存在明顯的地域特征。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)分離到的22株遲緩愛德華氏菌僅存在一種ERIC－PCR基因型，可見該基因型的遲緩愛德華氏菌是葫蘆島市養(yǎng)殖大菱鲆的主要致病菌株，這也為將來(lái)研制針對(duì)該病的疫苗提供了理論基礎(chǔ)。

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