廖德杰，童金茍，曹善茂，周穎、3，俞小牧，付北德，劉陽，王瀟

(1.大連海洋大學遼寧省貝類良種繁育工程技術研究中心，遼寧大連116023；2.中國科學院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室，湖北武漢430072；3.中國科學院大學，北京100049)

扇貝是中國海水貝類養(yǎng)殖的主要品種之一，因其具有味道鮮美、營養(yǎng)豐富等特點，深受人們的喜愛。目前，國內廣泛養(yǎng)殖的扇貝品種主要有中國土著的櫛孔扇貝Chlamys farreri、從美國引進的海灣扇貝Argopecten irradians[1]和從日本引進的蝦夷扇貝Patinopecten yessoensis[2]。然而，伴隨著扇貝養(yǎng)殖產業(yè)的迅猛發(fā)展，縱觀整個產業(yè)鏈條從苗種生產到成貝養(yǎng)殖均存在諸多問題，如種質衰退嚴重、疾病災害頻發(fā)、死亡率升高、品質下降等[3]。因此，新品種的引進將成為解決上述問題的有效途徑之一。自2000年以來，先后由大連碧龍海產有限公司于2005年將海扇貝Placopecten magellanicus引入中國并繁育成功[4]和青島農業(yè)大學王春德教授于2008年從秘魯引進紫扇貝Argopecten purpuratus并繁育成功[5]。但目前這兩種扇貝在國內均未被廣泛推廣養(yǎng)殖，具體原因尚不清楚。巖扇貝Crassadoma gigantea隸屬于軟體動物門Mollusca、雙殼綱Bivalvia、扇貝目 Pectinida、扇貝科 Pectinidae，原產于北美太平洋沿岸，因其具有個體大、生長速度快、抗逆性強、肉質鮮美等優(yōu)點，在國際市場備受青睞。大連海洋大學曹善茂等于2012年從加拿大溫哥華引進美洲巖扇貝，于2015年完成了全人工室內育苗試驗并獲得成功[6]。目前，國內外有關巖扇貝的研究主要集中在生理生態(tài)、生產養(yǎng)殖等方面[7－13]，對其遺傳學背景的研究在國內外卻鮮見報道。作為外來引進物種，查明其遺傳學及種質資源資料將有益于其養(yǎng)殖生產和育種推廣。

線粒體DNA(mtDNA)作為核外遺傳物質，具有結構簡單、分子量小、易于分離、進化速度快等特點，適用于種群遺傳分析[14－15]。在mtDNA中，相比rRNA基因和非編碼區(qū)，蛋白質的編碼基因更易發(fā)生重排，其進化速度適中，且在試驗過程中容易擴增[16]。已有的研究表明，細胞色素b(Cytochrome b，Cyt b)在mtDNA眾多蛋白質的編碼基因中是最為可靠的分子標記之一，目前，對其結構和功能的研究較為深入[17－18]，普遍被認為是研究群體遺傳多樣性和系統(tǒng)進化的理想工具[16，19－20]。為此，本研究中擬測定巖扇貝及3種國內主要養(yǎng)殖扇貝 (櫛孔扇貝、海灣扇貝和蝦夷扇貝)的mtDNA Cyt b基因序列，分析其遺傳變異，計算4種扇貝的基因差異和遺傳距離，結合GenBank中扇貝科其他物種的相應基因序列進行系統(tǒng)進化分析，從分子水平上了解巖扇貝的遺傳背景及其與3種主要經濟扇貝的親緣關系，以期為巖扇貝的引種與推廣養(yǎng)殖，以及今后的遺傳育種研究工作提供參考信息。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用巖扇貝為從加拿大溫哥華引進種貝的F1代個體，為1齡貝，養(yǎng)殖于大連龍王塘海域 (簡記為Y)；蝦夷扇貝 (簡記為X)和櫛孔扇貝 (簡記為Z)均購自于大連新長興海產品市場，均為2齡貝；海灣扇貝 (簡記為H)采自山東萊州某養(yǎng)殖場，為1齡貝。采樣時間均為2017年5月，每種扇貝隨機取10個樣本，經形態(tài)學鑒定后取閉殼肌保存于無水乙醇中備用。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 取約50 mg扇貝閉殼肌組織，參考Sambrook等[21]的酚/氯仿抽提法并略做修改進行基因組DNA的提取。將沉淀后的基因組DNA溶解于200 μL的TE溶液中保存，取溶解后的2 μL基因組DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測基因組DNA的完整性，并取1 μL，在 NanoDrop 2000微量分光光度計上測定濃度，最后稀釋成約50 ng/μL的工作液于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設計與合成 試驗用引物使用Primer 5軟件[22]進行設計，最后由生工生物工程 (上海)股份有限公司合成。其中蝦夷扇貝、櫛孔扇貝和海灣扇貝的Cyt b基因序列擴增引物，分別根據Gen-Bank數據庫公布的該物種線粒體基因組全序列進行設計，而巖扇貝的Cyt b基因序列則根據本實驗室測得的巖扇貝線粒體基因組序列設計 (表1)。

1.2.3 PCR擴增及序列測定 PCR反應總體系為25 μL， 包括模板 DNA(50 ng/μL)1.0 μL， 10×reaction buffer 2.5 μL， dNTP MIX(2.5 mmol/L)1.0 μL，上下游混合引物 (各 10 μmol/L)1.0 μL，1 U Taq DNA聚合酶0.2 μL，用ddH2O補足至25 μL。PCR反應條件為:94℃下預變性5 min；94℃下變性35 s，50℃下退火40 s，72℃下延伸40 s，共進行38個循環(huán)；最后在72℃下充分延伸10 min。PCR產物用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，經BioSpin Gel Extraction Kit純化回收后，連接到pMD18－T載體上，再轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α中。挑選陽性克隆送天一輝遠 (武漢)生物科技有限公司進行雙向測序。

表1 試驗用引物序列及其退火溫度Tab.1 Sequences and annealing temperatures of the primers uesd in the expriment

1.3 數據分析

首先，根據測序峰結果進行人工校對；使用NCBI的BLAST工具搜索其他貝類的同源序列，下載扇貝科8種扇貝和貽貝科兩種貽貝的Cyt b基因的同源序列 (圖1)；使用ClustalX 1.83程序[23]對不同物種DNA序列進行多重比對和人工校準；使用GeneMarkS 4.6b[24]對巖扇貝的測序結果進行Cyt b基因的預測；使用DNAsp 5[25]分析核酸基本參數；使用MEGA 5.1[26]計算堿基組成和Kimura雙參數遺傳距離，并利用獲得的4種扇貝Cyt b基因序列 (所有單倍型序列)，結合GenBank數據庫中扇貝科其他扇貝的相應序列，基于鄰接法 (Neighbor－Joining，NJ) 和最大簡約法 (Maximum－Parsimory，MP)分別構建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用重抽樣法(Bootstrap)1000檢驗系統(tǒng)樹分支的置信度，選取貽貝科的兩個種作為外源群。

2 結果與分析

2.1 Cyt b基因的序列組成

經PCR擴增及測序，獲得了4種扇貝的Cyt b基因全序列 (已提交至GenBank數據庫)，其中櫛孔扇貝、海灣扇貝和蝦夷扇貝的Cyt b基因序列與GenBank數據庫中相應序列的一致性達98%以上。從表2可見:4種扇貝的Cyt b基因序列長度為1146～1173 bp，巖扇貝序列長度最長，其次為櫛孔扇貝，海灣扇貝序列長度最短；4種扇貝的A、T、G、C含量分別為19.65%～22.39%、35.23%～37.80%、25.94%～29.41% 和12.71%～17.29%，A＋T含量為57.12%～59.64%，櫛孔扇貝A＋T含量最高，巖扇貝最低，但均高于G＋C含量。此外，櫛孔扇貝、海灣扇貝、巖扇貝的啟動密碼子均為ATG，蝦夷扇貝為ATT；蝦夷扇貝、海灣扇貝、巖扇貝的終止密碼子均為TAG，櫛孔扇貝為TAA。

表2 4種扇貝Cyt b基因的序列特征及堿基組成Tab.2 Sequence characteristics and base composition of Cyt b gene in four scallop species

2.2 Cyt b基因序列的遺傳變異

從表3可見:從巖扇貝、櫛孔扇貝、蝦夷扇貝和海灣扇貝中分別檢測到3、3、4、4種單倍型，多態(tài)性位點數依次為2、4、5、14，4種扇貝的單倍型多樣性指數 (Hd)、核苷酸多樣性指數 (π)和平均核苷酸差異 (k)分別為 0.545～0.800、0.001 00～0.005 72和0.788～6.545； Hd值為蝦夷扇貝最高，櫛孔扇貝最低，而π值和k值均為海灣扇貝最高，巖扇貝最低。

表4為4種扇貝Cyt b基因序列多態(tài)性核苷酸位點及單倍型分布情況。從表4可見:海灣扇貝的單倍型H4僅為某一個體所獨有；除櫛孔扇貝單倍型Z3含有兩2個插入/缺變異位點外，且同樣為某一個體所獨有，較為特殊；4種扇貝的其余變異位點均由轉換和顛換引起。

表3 4種扇貝Cyt b基因序列的遺傳變異參數Tab.3 Parameters of genetic variation in the sequences of Cyt b gene in four scallop species

2.3 種間遺傳距離及系統(tǒng)發(fā)育樹

4種扇貝基于Cyt b基因序列的種間遺傳距離如表5所示。4種扇貝間的遺傳距離為0.255～0.429，巖扇貝與蝦夷扇貝的遺傳距離最近，與海灣扇貝的遺傳距離最遠。

基于Cyt b基因序列的NJ樹與MP樹如圖1、圖2所示。用兩種方法獲得的系統(tǒng)發(fā)育樹拓撲結構幾近一致，且大分支節(jié)點的支持率均較高。扇貝科的12種扇貝明顯分為兩個單系群。其中，Mimachlamys屬的兩個種單獨聚為一個單系群；而另外一個單系群則包括Argopecten、Pecten、Placopecten、 Chlamys、 Patinopecten和Crassadoma 6個屬的10種扇貝，該單系群又分為兩個主要的分支，具體為P.yessoensis的4種單倍型與C.gigantea的3種單倍型先聚為一支，再與C.farreri的3種單倍型聚類為一大支，而A.irradians的4種單倍型先與Argopecten系的3個種聚為一支，再與Pecten屬的2個種進行聚類，最后與Patinopecten屬聚為另一個大支。

3 討論

3.1 4種扇貝Cyt b基因的序列組成分析

4種扇貝Cyt b基因序列的種間同源性較低，變異較大，但未表現出明顯的種間長度多態(tài)，該現象同樣存在于扇貝科的其他物種，因此，筆者認為，序列的長度多態(tài)無法作為物種鑒定的依據。此外，4種扇貝Cyt b基因序列的堿基組成均表現為T含量最高，其次為G含量，C含量最低，并且A＋T含量均明顯高于G＋C含量，其符合動物細胞色素b的堿基組成特征[27]，與其他貝類及魚類的堿基組成偏向性相似[28－29]。胡麗萍等[15]推測認為，mtDNA具有較高的A＋T含量在無脊椎動物中是一種普遍現象。

表4 4種扇貝Cyt b基因序列多態(tài)性核苷酸位點及各單倍型分布情況Tab.4 Distribution of variable nucleotides and haplotypes in Cyt b gene fragments of four scallop species

表5 4種扇貝種間Kimura雙參數遺傳距離Tab.5 Kimura 2－parameter genetic distance among four scallop species

3.2 4種扇貝的種內遺傳變異分析

遺傳多樣性是物種適應環(huán)境變化、維持生存與進化的必要條件，遺傳多樣性越高，遺傳變異越豐富，對環(huán)境適應能力就越強，可適宜生存的環(huán)境就越廣泛[16，29－30]。 通常來說， 核苷酸多樣性指數(π)和單倍型多樣性指數 (Hd)是評估種群遺傳多樣性的兩個重要指標，但由于單個堿基的變異就能生成一種新的單倍型，Hd值可在短時間內積累變異而快速提高，而π值的提高需要長時間的積累，因此，在評估種群遺傳多樣性和遺傳變異時，π 值比 Hd值更具代表性[17，31－32]。 本研究中， 4種扇貝的π值在0.001 00～0.005 72之間，均表現出較低的遺傳多樣性水平。蝦夷扇貝、櫛孔扇貝和海灣扇貝表現出較低的多樣性水平，可能與試驗樣本均為養(yǎng)殖群體有關；而引進種巖扇貝可能是由于試驗樣本為F1代個體，僅由少數幾個引進親本繁育而來，其遺傳背景相對單一，導致較低的遺傳變異水平。胡麗萍等[15]曾在其他引進種扇貝中也報道了類似現象。

3.3 親緣關系及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

本研究中的種間遺傳距離結果表明，引進的巖扇貝與蝦夷扇貝的親緣關系較近，而與海灣扇貝間的親緣關系較遠。其余3種扇貝間則是蝦夷扇貝與櫛孔扇貝之間的親緣關系較近，該研究結果與秦艷杰等[4]應用AFLP技術對3種扇貝親緣關系的研究結果一致。

圖1 應用鄰接法 (NJ)構建基于Cyt b基因序列的扇貝科系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Neighbor－joining(NJ)phylogenetic tree constructed based on the sequences of Cyt b gene in Pectinidae

圖2 應用最大簡約法 (MP)構建基于Cyt b基因序列的扇貝科系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Maximum－parsimory(MP)phylogenetic tree constructed based on the sequences of Cyt b gene in Pectinidae

本研究中，基于兩種方法 (NJ和MP)構建的系統(tǒng)進化樹的拓撲結構幾近一致，表明了結果的準確性和可靠性。系統(tǒng)進化樹顯示，扇貝科中同屬的物種先單獨聚為一個分支，再與其他屬物種進行聚類，表明了mtDNA Cyt b基因作為一種分子標記在種屬間系統(tǒng)發(fā)生關系研究中的適用性[33]。基于mtDNA基因片段序列探討扇貝科物種系統(tǒng)進化關系有較多的研究和報道，如Barucca等[34]通過對16S rDNA和12S rDNA部分序列的比較分析，分別構建了23種扇貝的系統(tǒng)進化樹；Saavedra等[35]利用mtDNA 16S rDNA和12S rDNA部分序列對扇貝科27種扇貝進行了系統(tǒng)進化研究；而Puslednik等[36]同時利用兩個線粒體基因 (16S和12S)及一個核基因 (H3組蛋白)的部分序列構建了46種扇貝的系統(tǒng)進化樹，其結果表明，C.gigantea與P.yessoensis的親緣關系較近，而 C.gigantea與A.irradians的親緣關系較遠，該部分結果與本研究結果一致。但上述研究中均未對 C.gigantea、A.irradians、P.yessoensis和C.farreri 4種扇貝的系統(tǒng)進化及分子遺傳學分析進行闡述，并且構建系統(tǒng)進化樹所用序列均為相應基因的部分序列，在分析上存在一定局限性。本研究中則通過Cyt b基因全序列，闡明了引進種巖扇貝與國內3種主要經濟扇貝間的親緣關系，將為巖扇貝今后的遺傳育種研究工作提供基礎信息。

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