彭會(huì)， 劉杰， 陳慧蕓

(1.廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院，福建廈門361102；2.海洋生物制備技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，福建廈門361102)

抗生素作為抗菌藥物是目前人類使用最廣泛的預(yù)防和治療病原微生物感染的手段之一。然而由于抗生素長(zhǎng)期過(guò)量使用所引起的細(xì)菌耐藥性問(wèn)題已成為全球公共健康問(wèn)題[1－2]。尋找抗生素的有效替代品是國(guó)內(nèi)外農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一?？咕氖且活悘纳矬w中分離的、具有廣譜抗微生物活性的小分子多肽，已證實(shí)是生物體先天免疫系統(tǒng)的重要組成成分，被科學(xué)家譽(yù)為 “天然抗生素”[3－5]。 目前， 抗菌肽在細(xì)菌[6]、 植物[7]、 昆蟲(chóng)[8]和脊椎動(dòng)物[9]等多種生物體中均有發(fā)現(xiàn)，截至2013年，在真核生物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)報(bào)道了超過(guò)2000種抗菌肽[10]。

SCY2是從雄性擬穴青蟹Scylla paramamosain生殖腺中發(fā)現(xiàn)的一種陰離子抗菌肽，本課題組在對(duì)青蟹新型抗菌肽Scygonadin的研究過(guò)程中，在擬穴青蟹中克隆獲得了與Scygonadin具有65.08%同源性的 cDNA序列[11－12]，命名為 SCY2基因 (Gen-Bank登錄號(hào):EF555444)。與 Scygonadin基因組DNA相似，SCY2基因組DNA同樣由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子基因組成。運(yùn)用ProtParam工具分析結(jié)果顯示，SCY2成熟肽含有100個(gè)氨基酸殘基，平均相對(duì)分子量為10 925 400，等電點(diǎn)PI為4.84，為陰離子抗菌肽[12－13]。廈門大學(xué)海洋生物制備技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，SCY2是在擬穴青蟹雄性射精管顯著高表達(dá)的抗菌肽基因，交配后射精管中SCY2基因表達(dá)低于交配前，而在雌蟹陰道及納精囊中交配后SCY2基因表達(dá)量高于交配前，Western Blot與免疫熒光檢測(cè)結(jié)果證實(shí)SCY2蛋白從雄蟹體內(nèi)轉(zhuǎn)移到了雌蟹中，提示抗菌肽SCY2在交配過(guò)程中可能起到保護(hù)精子免受細(xì)菌感染的作用[13]。因此，擬穴青蟹抗菌肽SCY2可能在青蟹的生殖免疫中起著重要作用[13]。

本研究中構(gòu)建了真核表達(dá)載體pPIC9K－SCY2，在畢赤酵母Pichia pastoris GS115菌株中誘導(dǎo)表達(dá)獲得重組蛋白，對(duì)獲得的重組蛋白純化后進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜分析，同時(shí)用純化后得到的重組蛋白測(cè)定抗菌活性，以便闡明獲得的抗菌肽SCY2的抗菌活性和抗菌譜。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體和菌株 真核表達(dá)用菌株、質(zhì)粒和抗菌試驗(yàn)用菌株、畢赤酵母菌株GS115、表達(dá)載體pPIC9K均購(gòu)自Invitrogen公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞由廈門大學(xué)海洋生物制備技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室制備保存。

抗菌試驗(yàn)用菌株:大腸桿菌模式株Escherichia coli、施氏假單胞菌Pseudomonas stutzeri、熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens、弗氏志賀氏菌Shigella flexneri、金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus、藤黃微球菌Micrococcus luteus、溶壁微球菌Micrococcus lysodeikticus和谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心 (CGMCC)。

1.1.2 主要試劑 HisTrapTMFF crude 5 mL購(gòu)自GE公司；凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自東盛公司；DNA Ligation Kit、限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司；FastPfu聚合酶購(gòu)自全式金公司；Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；胰蛋白胨、酵母粉均購(gòu)自O(shè)XOID公司；瓊脂糖為Promega公司產(chǎn)品；YNB(無(wú)氨基酵母氮源)、D－山梨醇均購(gòu)自索萊寶公司；其他蛋白表達(dá)與純化相關(guān)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 pPIC9K－SCY2表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)pPIC9K載體多克隆位點(diǎn)和真核表達(dá)載體pPIC9KSCY2的目的基因序列，設(shè)計(jì)上下游引物。上游引物為F1:GGGGAATTC GGCCTGGCACTCAACAGACTTATG；下游引物為R1:ATGCGGCCGCTCAATGGTGATGGTGATGATGGTAGGAAGCAAGCCAGTCCTCGAGGTC。其中，劃線部分分別為EcoRⅠ和NotⅠ的酶切位點(diǎn)，終止密碼子前引入組氨酸標(biāo)簽，斜體部分為6×His序列。

以本實(shí)驗(yàn)室前期已獲得的SCY2序列 (Gen-Bank登錄號(hào):EF555444)為模板，F(xiàn)1和R1為上、下游引物，用FastPfu聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增SCY2目的片段。對(duì)獲得的目的片段進(jìn)行凝膠回收后，利用EcoRⅠ和NotⅠ內(nèi)切酶對(duì)目的片段進(jìn)行酶切，同時(shí)對(duì)制備的pPIC9K真核表達(dá)載體同樣使用EcoRⅠ和NotⅠ內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。使用凝膠回收試劑盒將酶切后的SCY2目的片段和pPIC9K真核表達(dá)載體分別進(jìn)行回收后，將具有相同黏性末端的SCY2目的片段和pPIC9K真核表達(dá)載體以及T4 DNA連接酶在16℃下進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有Amp的LB瓊脂平板上，于37℃下培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單克隆PCR擴(kuò)增鑒定陽(yáng)性克隆，并送至英濰捷基貿(mào)易有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 pPIC9K－SCY2載體的轉(zhuǎn)化和鑒定 將測(cè)序正確的pPIC9K－SCY2表達(dá)載體用SacⅠ限制性內(nèi)切酶線性化，將線性化的表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于MD平板上，于28℃下培養(yǎng)2 d至產(chǎn)生單克隆，挑取單克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證目的基因片段是否插入酵母基因組中，選取陽(yáng)性克隆進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，保種于超低溫冰箱 (－80℃)中，以備后續(xù)表達(dá)使用。

1.2.3 抗菌肽SCY2的真核表達(dá)和純化 將保種于超低溫冰箱中的菌株GS115/pPIC9K－SCY2劃線于YPD平板，挑取單克隆接種于20 mL YPD培養(yǎng)基中，于30℃下以230 r/min振蕩培養(yǎng)約20 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入400 mL BMGY(pH 6.0)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，于30℃下以230 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，測(cè)定OD600nm達(dá)到2.0～6.0時(shí)，在室溫條件下以2000 g離心收集細(xì)胞。將離心后收集到的細(xì)胞重懸于等體積BMMY表達(dá)培養(yǎng)基中，于 28℃下以 230 r/min，用終濃度為0.5%的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)24 h，離心收集培養(yǎng)基上清液。取450 μL培養(yǎng)上清液，加入50 μL的100%三氯乙酸 (TCA)濃縮，采用SDS－PAGE電泳分析蛋白的表達(dá)量。將其余的上清液于4℃下在磷酸鹽緩沖液中透析2～3次，對(duì)透析后的上清液進(jìn)行離心，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后上柱純化。

用5～10個(gè)柱體積 Milli－Q水清洗預(yù)裝柱(HisTrapTMFF Crude 5 mL)，接著用5～10個(gè)柱體積平衡緩沖液 (20 mmol/L磷酸緩沖液＋50 mmol/L NaCl＋10 mmol/L咪唑，pH 8.0) 平衡HisTrap層析柱，將過(guò)濾后的上清液以2 mL/min全部上柱，同時(shí)收集流穿樣品；然后用3～5個(gè)柱體積的平衡緩沖液過(guò)柱，洗去未結(jié)合的蛋白；用洗脫緩沖液(20 mmol/L磷酸緩沖液＋150 mmol/L NaCl＋300 mmol/L咪唑，pH 8.0)過(guò)柱，洗脫目的蛋白收集洗脫峰，取少量進(jìn)行 SDS－PAGE電泳鑒定。經(jīng)SDS－PAGE電泳后，切膠回收相對(duì)分子質(zhì)量為11 000的目的蛋白條帶，用液相分離－基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 (LC－MALDI－TOFTOF)及數(shù)據(jù)庫(kù)搜索對(duì)目的蛋白進(jìn)行鑒定。

1.2.4 抗菌肽SCY2最小抑菌濃度的測(cè)定 最小抑菌濃度 (Minimal inhibitory concentration，MIC)的測(cè)定在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行[14－15]。取被測(cè)細(xì)菌，在營(yíng)養(yǎng)肉湯平板上劃線，培養(yǎng)過(guò)夜；挑取2～3個(gè)克隆接種于MH培養(yǎng)基的固體斜面，繼續(xù)培養(yǎng)12～16 h；用 10 mmol/L磷酸鈉鹽緩沖液 (pH 7.2)沖洗新鮮制備的MH細(xì)菌斜面培養(yǎng)物，調(diào)整OD600nm值為0.003。設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組、空白對(duì)照組和待測(cè)樣品試驗(yàn)組。其中，陽(yáng)性對(duì)照組為50 μL磷酸鈉鹽緩沖液和50 μL含MH培養(yǎng)液的菌懸液；空白對(duì)照組為50 μL待測(cè)蛋白樣品和50 μL磷酸鈉鹽緩沖液；樣品試驗(yàn)組為50 μL待測(cè)蛋白樣品和50 μL含MH培養(yǎng)液的菌懸液。

細(xì)菌在最適條件下培養(yǎng)24～48 h后，觀察MIC結(jié)果。以上試驗(yàn)重復(fù)3次，每次每種被測(cè)菌設(shè)2個(gè)平行樣。

1.2.5 抗菌肽SCY2與抗生素的協(xié)同抗菌作用試驗(yàn) 運(yùn)用棋盤法[16－17]測(cè)定抗菌肽與試驗(yàn)用抗生素之間的協(xié)同抗菌作用。連續(xù)2倍稀釋抗菌肽和抗生素的濃度為1/32MIC～1/2MIC，將稀釋后的抗菌肽和抗生素分別添加25 μL到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中與50 μL細(xì)菌混合均勻，每種被測(cè)菌設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組、空白對(duì)照組和待測(cè)樣品試驗(yàn)組。其中陽(yáng)性對(duì)照組加50 μL磷酸鈉鹽緩沖液和50 μL菌懸液；空白對(duì)照組 (抗菌肽)加50 μL待測(cè)抗菌肽樣品和50 μL磷酸鈉鹽緩沖液；空白對(duì)照組 (抗生素)加50 μL待測(cè)抗生素樣品和50 μL磷酸鈉鹽緩沖液；樣品試驗(yàn)組分別向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中順序加入25 μL 1/32×MIC～1×MIC 待測(cè)抗菌肽樣品和 25 μL 待測(cè)抗生素樣品，以及50 μL菌懸液。

在細(xì)菌最適條件下共孵24～48 h后，觀察MIC結(jié)果。以上試驗(yàn)重復(fù)3次，每次每種被測(cè)菌設(shè)2個(gè)平行樣。

抗菌肽與抗生素之間的抗菌作用可用分級(jí)抑制濃度指數(shù) (Fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI)來(lái)定量檢測(cè)，F(xiàn)ICI的計(jì)算公式為[16－17]

通過(guò)FICI可以得到A和B兩種試劑之間的相互關(guān)系[16－17]:當(dāng)FICI≤0.5時(shí)，A試劑和B試劑間存在協(xié)同作用；當(dāng)0.5＜FICI≤1時(shí)，A試劑和B試劑間存在增強(qiáng)作用；當(dāng)1＜FICI＜4時(shí)，A試劑和B試劑間不存在相互作用；當(dāng)FICI≥4時(shí)，A試劑和B試劑間存在拮抗作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

利用特異性引物F1和R1擴(kuò)增SCY2成熟肽基因，用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，PCR擴(kuò)增出一條約300 bp的條帶 (圖1－A)，與預(yù)期目的條帶大小相符。將PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ做雙酶切，用凝膠回收試劑盒回收酶切后的目的基因片段。表達(dá)載體pPIC9K同樣經(jīng)過(guò)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后，用8 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效率 (圖1－B)，酶切前的pPIC9K質(zhì)粒為環(huán)狀，酶切后的pPIC9K為清晰且單一的條帶，長(zhǎng)度約9 000 bp，與實(shí)際大小相符。將 PCR擴(kuò)增的SCY2目的基因用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切的載體pPIC9K連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，重組表達(dá)載體 pPIC9K－SCY2經(jīng)轉(zhuǎn)化、涂板、菌液PCR鑒定，得到的陽(yáng)性克隆片段長(zhǎng)度約300 bp(圖1－C)，與預(yù)期大小相符。

圖1 重組載體pPIC9K－SCY2的構(gòu)建與鑒定Fig.1 Construction and identification of recombinant vector plasmid pPIC9K－SCY2

選擇陽(yáng)性克隆送至英濰捷基貿(mào)易有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNAssist軟件進(jìn)行分析，分析結(jié)果表明，目的基因同載體的連接正確，其核苷酸的開(kāi)放閱讀框 (ORF)編碼連續(xù)，與預(yù)期要表達(dá)的抗菌肽SCY2成熟肽的氨基酸序列相符合。真核重組表達(dá)載體pPIC9K－SCY2采用AOX1啟動(dòng)子，酵母信號(hào)肽α－factor因子引導(dǎo)目的基因的分泌表達(dá)，在C－末端設(shè)計(jì)帶有6×His－Tag，便于對(duì)表達(dá)所得到抗菌肽進(jìn)行親和層析純化。重組質(zhì)粒載體pPIC9K－SCY2的構(gòu)建如圖2所示。

圖2 pPIC9K－SCY2重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建示意圖Fig.2 Schematicrepresentation ofthevectorof pPIC9K－SCY2

2.2 SCY2在畢赤酵母中的分泌表達(dá)

將pPIC9K－SCY2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115后，挑取單克隆菌株在10 mL YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，取2 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入40 mL BMGY培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至OD600nm達(dá)到2.0～6.0時(shí)，離心收集菌體，轉(zhuǎn)入等體積的表達(dá)培養(yǎng)基(BMMY培養(yǎng)基)中用0.5%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)96 h，結(jié)果如圖3所示。甲醇誘導(dǎo)后在相對(duì)分子質(zhì)量約11 000的位置出現(xiàn)1條蛋白相對(duì)分子質(zhì)量條帶，與預(yù)測(cè)目的蛋白SCY2分子量相當(dāng)，且在誘導(dǎo)表達(dá)12 h時(shí)即可檢測(cè)到目的蛋白SCY2的表達(dá)，在24 h已獲得高表達(dá)，之后目的蛋白表達(dá)量穩(wěn)定，且無(wú)明顯變化。

圖3 SCY2在畢赤酵母GS115中的分泌表達(dá)Fig.3 SDS－PAGE analysis of SCY2 expression in yeast Pichia pastoris GS115

2.3 重組蛋白SCY2的純化

重組畢赤酵母菌株GS115/pPIC9K－SCY2誘導(dǎo)表達(dá)24 h后，離心去沉淀，收集胞外上清液。鎳離子螯合親和層析柱親和純化，用低濃度咪唑(10 mmol/L)洗脫雜蛋白，用高濃度咪唑 (300 mmol/L)洗脫螯合的目的蛋白SCY2，將誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物、純化的流出組分和洗脫組分進(jìn)行SDS－PAGE電泳 (圖4)，結(jié)果顯示，相對(duì)分子量約11 000的SCY2重組蛋白能夠特異性地與鎳離子螯合親和層析柱結(jié)合，在較高濃度的咪唑溶液競(jìng)爭(zhēng)洗滌后，目的蛋白SCY2被洗脫。

圖4 SCY2蛋白的純化Fig.4 SDS－PAGE analysis of the SCY2 purification

2.4 肽指紋圖譜的分析

將獲得的SCY2目的條帶切膠后用胰酶酶解，用液相分離－基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 (LC－MALDI－TOF－TOF) 鑒定后，在數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索比對(duì)序列并進(jìn)行分析 (表1)。從表1可見(jiàn):檢測(cè)到6段質(zhì)子分子量分別為1607.809 3 MH＋、2021.081 1 MH＋、 2053.961 2 MH＋、 2069.943 8 MH＋、 2246.056 9 MH＋和3027.559 3 MH＋， 其對(duì)應(yīng)于美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)中SCY2前體肽 (GenBank登錄號(hào):ABU40184.1)的位置分別為82～96、 82～100、 64～81、 64～81、 106～124和35～63。在SCY2前體肽序列中，SCY2成熟肽的對(duì)應(yīng)位置為25～124，如上質(zhì)譜檢測(cè)到的6段肽段共85個(gè)氨基酸與編碼的SCY2成熟肽序列完全相同，占SCY2成熟肽序列的85%。結(jié)果表明，獲得的目的蛋白即為擬穴青蟹抗菌肽SCY2。

2.5 重組SCY2的抗菌活性

將重組SCY2蛋白溶液分別倍比稀釋至1.6～50.0 μmol/L，與等體積的菌懸液共同孵育24 h或48 h后觀察最小抑菌濃度 (MIC)[14－15]。對(duì)8種細(xì)菌測(cè)定的MIC結(jié)果顯示 (表2)，真核表達(dá)的抗菌肽SCY2能抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)，對(duì)被測(cè)的革蘭氏陰性菌無(wú)抑殺活性。其中SCY2對(duì)被測(cè)的革蘭氏陽(yáng)性菌如金黃色葡萄球菌和溶壁微球菌具有較好抗菌活性 (MIC為12.5～25.0 μmol/L)，對(duì)藤黃微球菌、谷氨酸棒桿菌具有一定的抗菌活性 (MIC為25～50 μmol/L)；對(duì)被測(cè)的革蘭氏陰性菌無(wú)抑殺活性 (＞50 μmol/L)。

表1 SCY2酶解指紋MALDI－TOF－MS圖譜與從cDNA推導(dǎo)的SCY2前體肽序列 (GenBank登錄號(hào):ABU40184.1)的匹配情況Tab.1 Matching of SCY2 MALDI－TOF－MS fingerprint to amino acid sequence deduced from SCY2(GenBank No.:ABU40184.1)

表2 SCY2真核重組表達(dá)產(chǎn)物的抗菌活性Tab.2 Antimicrobial activities of SCY2 expressed product in GS115

2.6 抗菌肽SCY2與抗生素的協(xié)同抗菌作用

采用液體倍比稀釋法分別對(duì)抗生素和抗菌肽進(jìn)行稀釋，得到濃度分別為1/32×MIC、1/16×MIC、1/8×MIC、 1/4×MIC、 1/2×MIC、 1×MIC 的抗生素及抗菌肽，將抗生素、抗菌肽和待測(cè)菌株分別加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，測(cè)定了抗菌肽SCY2與青霉素、鏈霉素和四環(huán)素對(duì)大腸桿菌模式菌株、熒光假單胞菌、弗氏志賀氏菌和施氏假單胞菌的協(xié)同抗菌結(jié)果 (表3)。結(jié)果顯示，抗菌肽SCY2與四環(huán)素對(duì)熒光假單胞菌有協(xié)同抑菌作用 (FICI＝0.266)，SCY2與青霉素對(duì)施氏假單胞菌的抑殺有增強(qiáng)作用 (FICI＝0.508)。

表3 抗菌肽SCY2和抗生素對(duì)被測(cè)細(xì)菌的協(xié)同抗菌試驗(yàn)Tab.3 Minimal inhibitory concentration(MIC)and fractional inhibitory concentration index(FICI)of SCY2 and antibiotics synergistic against the test bacterial strains

3 討論

抗生素為人類的健康生存和發(fā)展做出了巨大貢獻(xiàn)，然而抗生素的耐藥性正在以驚人的速度發(fā)展[18－20]，數(shù)月到數(shù)年的時(shí)間內(nèi)，抗生素便會(huì)在臨床上表現(xiàn)出顯著地耐藥性[21]。細(xì)菌可以通過(guò)主動(dòng)外排、產(chǎn)生水解酶或鈍化酶破壞抗生素的功能結(jié)構(gòu)域、改變目標(biāo)靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)等方式產(chǎn)生對(duì)抗生素的耐藥性[22－25]。而抗菌肽來(lái)源于生物體本身，其抗菌機(jī)理獨(dú)特，不易產(chǎn)生耐藥性，抗菌活性強(qiáng)?？咕目芍苯右鹚拗飨忍煨悦庖邞?yīng)答，并能對(duì)廣泛的病原菌做出高效而迅速的反應(yīng)，甚至對(duì)成團(tuán)細(xì)菌也起作用，因而將作其為一種新型的生物藥物替代現(xiàn)有的化學(xué)類抗生素， 具有廣闊的應(yīng)用前景[4－5，26－28]。 但直接從生物體內(nèi)提取抗菌肽過(guò)程復(fù)雜且成本高，不適于未來(lái)產(chǎn)業(yè)化的要求，目前，公認(rèn)的最有效方法是利用基因工程表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行體外表達(dá)。

3.1 表達(dá)系統(tǒng)與表達(dá)載體的選擇

為了獲得高表達(dá)量的目的蛋白，通常需要建立基因的體外高效表達(dá)系統(tǒng)。常用的體外表達(dá)系統(tǒng)有原核表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。作為真核表達(dá)系統(tǒng)，酵母表達(dá)系統(tǒng)兼有原核和高等真核系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，其繁殖快，可進(jìn)行規(guī)?；呙芏劝l(fā)酵，表達(dá)量高，操作簡(jiǎn)單，成本低廉，且蛋白翻譯后能進(jìn)行正確加工和修飾，合理的空間折疊，從而使表達(dá)出的蛋白具有生物活性。為確定SCY2的抗菌功能，本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)SCY2成熟肽編碼序列，構(gòu)建了pTrc－CKS/SCY2融合基因的原核表達(dá)載體，將表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，通過(guò)變性復(fù)性和金屬鰲合層析純化獲得融合蛋白CKS－SCY2，用3C蛋白酶酶切后，純化獲得重組蛋白SCY2[12]。用該方法獲得的SCY2原核融合表達(dá)雖然表達(dá)量較高，但多以包涵體形式存在，需要進(jìn)行變性復(fù)性以及二次酶切，步驟較繁瑣，難以直接獲得大量具有天然活性的抗菌肽。因此，本研究中設(shè)計(jì)構(gòu)建了抗菌肽SCY2的真核表達(dá)載體pPIC9K－SCY2，轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中，用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，易于在體外表達(dá)并獲得了大量具有天然活性的抗菌肽SCY2。

3.2 抗菌肽SCY2的抗菌活性

重組表達(dá)的SCY2的抗菌試驗(yàn)結(jié)果表明，抗菌肽SCY2對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌，如溶壁微球菌具有較強(qiáng)的抗菌活性 (MIC＝12.5～25.0 μmol/L)， 對(duì)藤黃微球菌、谷氨酸棒桿菌具有一定的抗菌活性(MIC＝25～50 μmol/L)，對(duì)革蘭氏陰性菌無(wú)抗菌活性 (MIC＞50 μmol/L)。

SCY2雖然具有一定的抗菌效果，但并非對(duì)所有細(xì)菌都具有較好的抑殺效果。本研究中，進(jìn)一步將抗菌肽SCY2與青霉素、鏈霉素和四環(huán)素3種常用的抗生素進(jìn)行協(xié)同抗菌試驗(yàn)，抗菌試驗(yàn)的菌株為大腸桿菌模式菌株、熒光假單胞菌、弗氏志賀氏菌和施氏假單胞菌4種革蘭氏陰性菌，以探究抗菌肽SCY2與被測(cè)的3種抗生素的協(xié)同抗菌作用，為抗菌肽替代或部分替代抗生素的使用奠定理論基礎(chǔ)?？咕囼?yàn)結(jié)果表明，抗菌肽SCY2與四環(huán)素對(duì)熒光假單胞菌的抑殺具有協(xié)同作用，抗菌肽SCY2與青霉素對(duì)施氏假單胞菌的抑殺具有增強(qiáng)作用?？梢?jiàn)，抗菌肽SCY2與抗生素協(xié)同使用時(shí)，在一定程度上可以減少使用抗生素的種類或降低抗生素的用量。較低濃度的抗生素與抗菌肽協(xié)同使用比單獨(dú)使用高濃度的抗生素抗菌效果更好，可有效地減少抗生素的使用，降低食品中抗生素的殘留風(fēng)險(xiǎn)。

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