王 堅，劉 煒

(寧夏農(nóng)林科學(xué)院 農(nóng)作物研究所,寧夏永寧 750105)

遺傳基礎(chǔ)不同的植物，其雜交后代所表現(xiàn)出的各種性狀均優(yōu)于雜交雙親，比如生活力、適應(yīng)性、生殖力、生長勢、抗逆性，以及產(chǎn)量、品質(zhì)等，這稱之為雜交優(yōu)勢[1]。雜種優(yōu)勢的大小與親本間的遺傳背景有很大的關(guān)系。水稻中秈稻和粳稻之間有較遠(yuǎn)的遺傳關(guān)系，在形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和分子遺傳學(xué)方面有很多差異[2]，雜交后代往往會產(chǎn)生大量遺傳重組和分離類型，產(chǎn)生很強(qiáng)的雜種優(yōu)勢, 在雜交稻育種實(shí)踐中具有潛在的巨大價值[3-4]。因此，明確親本間的遺傳背景和關(guān)系、調(diào)節(jié)搭配親本組合及其秈粳成分, 使北方雜交水稻能獲得高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)成為了現(xiàn)階段研究的重點(diǎn)[5]。

在粳型雜交稻中，育種家先后轉(zhuǎn)育成一大批BT型粳稻不育系[6]，但廣泛測恢均未能找到粳稻恢復(fù)系, 因此認(rèn)為粳稻中沒有恢復(fù)基因[7]。 楊振玉等[8]利用“秈粳架橋”制恢方法，從秈稻中找到可以利用的恢復(fù)基因，至此粳型雜交稻三系配套成功。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，其關(guān)鍵基因Rf-1被定位和克隆，Rf-1位點(diǎn)2個相關(guān)的育性恢復(fù)基因Rf1a和Rf1b基因，RF1A上位于RF1B。粳稻不育/保持系(rf1/rf1)與秈型或粳型恢復(fù)系的恢復(fù)基因(Rf1/Rf1)在Rf1a位點(diǎn)上存在1 bp和574 bp兩處缺失，在Rf1b位點(diǎn)上存在多處差異[9-10]。大量的研究也表明，水稻Rf-1 位點(diǎn)在秈粳分化地區(qū)具有較高的遺傳多樣性[11-13]，與水稻的秈粳分化緊密相關(guān)[14]，是秈粳分化重要區(qū)分性狀之一。

寧夏水稻最早來自秈粳稻交替地區(qū)陜西秦嶺、巴山等地區(qū)[15]。加上近些年，從不同地區(qū)引種雜交，秈型血緣的水稻不斷導(dǎo)入到寧夏水稻。為此我們對在寧夏種植過的主要品種(系)Rf-1位點(diǎn)進(jìn)行分析，明確Rf-1位點(diǎn)規(guī)律和特點(diǎn)。為不育系或恢復(fù)系的轉(zhuǎn)育，轉(zhuǎn)育過程中分子標(biāo)記選用，各品種的遺傳類型、種群的劃分、雜交組合配置和雜種優(yōu)勢的利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

選用的材料主要來自在寧夏種植或引進(jìn)的品種(系)共49個材料, 基本信息詳見表1。

1.2 引物設(shè)計及其擴(kuò)增效果驗(yàn)證

根據(jù)Rf1a基因位點(diǎn)保持系(rf1a/rf1a)比恢復(fù)系(Rf1a/Rf1a)缺少574 bp的片段[9-10]，在缺失區(qū)域上游設(shè)計引物Rfa-7F(GGACCGGGGGATTTTACCTG)，下游設(shè)計引物Rfa-7R(AACCCAACTGAGACCATGCC)[16]。根據(jù)Rf1b基因序列(GenBankDQ311054.1)，設(shè)計引物Rfb-1F/Rfb-1R(ttctcgtcgtctt-cttcccg/ctttaggcccctcttgacca)和 Rfb-2F/Rfb-2Rc-aatggacaaggccatggag/tgtaggccatttcaaacagga)對各品種(系)擴(kuò)增，由金唯智公司對擴(kuò)增片段進(jìn)行測序。

1.3 粳稻DNA的提取和PCR擴(kuò)增

將寧夏的主要品(系)種植于寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)作物研究所實(shí)驗(yàn)基地，2016年4月中旬大棚育秧，5月中旬單株插秧，在水稻3～4葉期取新鮮葉片，采用CTAB法提取DNA。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，其中10×Buffer(含Mg2+15 mmol/L) 2 μL，dNTP(各2.5 mmol/L)1 μL，100 μmol/L引物各0.1 μL，1 UTaq酶，DNA模板1 μL，加ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環(huán); 最后72 ℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，用Gold-View核酸染料染色后在紫外燈下觀察，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 寧夏主要水稻Rf1a基因位點(diǎn)檢測

用Rfa-7F/Rfa-7R引物對寧夏這些主要品種(系)的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果(圖1)表明，其中‘寧香稻1號’、‘寧粳29號’和‘寧粳30號’等11個品種(系)擴(kuò)增出957 bp片段，(Rf1a/Rf1a)基因型占了22%，其余的擴(kuò)增出383 bp的片段，(rf1a/rf1a)基因型占了78%。

2.2 寧夏主要水稻Rf1b基因位點(diǎn)檢測

各突變位點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)品種中出現(xiàn)的頻次見表2，其中2459、2283、2059、1694、2205、1784、2315位點(diǎn)在各品種中突變的頻率較高，各突變出現(xiàn)的次數(shù)在39～48次。1927、1117(1118)、1530(1546)位點(diǎn)出現(xiàn)的位點(diǎn)頻率相對少一些，各突變出現(xiàn)的次數(shù)在11～21次。1576、1881、1970(1985)位點(diǎn)發(fā)生突變極少，各突變只出現(xiàn)1次，其共同特點(diǎn)是在該位點(diǎn)后插入1個堿基。

表1 寧夏49份主要水稻品種(系)的基本信息

WB01～WB49. 同表1；M.DL2000圖1 寧夏49份主要水稻品種(系)Rf1a基因位點(diǎn)功能標(biāo)記分析WB01-WB49 are shown in Table 1; M：DL2000Fig.1 Functional mark analysis of main rice varieties (lines) in 49 rice samples at Rf1a gene locus

突變位置Mutationposition數(shù)量Quantity突變位置Mutationposition數(shù)量Quantity1117(1118)191927211233111970(1985)11530(1546)142059471576122054616944722834717844623153918811245948

通過引物Rfb-1F/Rfb-1R和Rfb-2F/Rfb-2R對這些品種(系)DNA進(jìn)行擴(kuò)增并測序，結(jié)果與Rf1b基因序列對比，有17個點(diǎn)的堿基發(fā)生突變(表3)，分別在1117位點(diǎn)G變?yōu)門,1118位點(diǎn)C變?yōu)門，1233位點(diǎn)C變?yōu)門，1530位點(diǎn)C變?yōu)門,1546位點(diǎn)G變?yōu)锳，1576位點(diǎn)A變?yōu)锳C，1694位點(diǎn)C變?yōu)門，1784位點(diǎn)C變?yōu)門，1881位點(diǎn)T變?yōu)門C，1927位點(diǎn)C變?yōu)锳，1970位點(diǎn)A變?yōu)锳G,1985位點(diǎn)A變?yōu)锳G，2059位點(diǎn)T變?yōu)镚，2205位點(diǎn)T變?yōu)镃，2283位點(diǎn)C變?yōu)镚，2315位點(diǎn)A變?yōu)镚，2459位點(diǎn)G變?yōu)镃。其中1117和1118位點(diǎn)，1530和1546位點(diǎn)，1970和1985位點(diǎn)表現(xiàn)為同時突變，在統(tǒng)計分析過程中將其歸為同一點(diǎn)。

各品種突變位點(diǎn)數(shù)詳見表4。由表4可知，只有1個品種有10個突變位點(diǎn)，22個品種有9個突變位點(diǎn)，其余的品種都小于9個突變位點(diǎn)，13個品種有8個突變位點(diǎn)，6個品種有7個突變位點(diǎn)，4個品種有6個突變位點(diǎn)，2個品種有5個突變位點(diǎn)，由此可以看到隨著突變位點(diǎn)的減少品種數(shù)也呈指數(shù)下降，少于5個的突變位點(diǎn)則沒有?！畬幘?2號’一個品種的序列與Rf1b基因完全一樣。

2.3 寧夏主要水稻Rf1基因位點(diǎn)聚類分析

利用DPS軟件，根據(jù)計算出來的群體內(nèi)種質(zhì)間的Nei和Li遺傳相似系數(shù)，采用可變類平均法對49份水稻材料進(jìn)行聚類分析，并繪制樹狀聚類圖，結(jié)果如圖2所示。以遺傳距離1.25進(jìn)行劃分，可以劃分為三類，第一類有‘寧粳43號’、‘寧粳24號’和‘寧粳 12號’等共13個品種。都是在1117(1118)、1694、1784、1927、2059、2205、2283、2315、2459位點(diǎn)發(fā)生突變，在1233、1530(1546)、1576、1881、1970(1985)位點(diǎn)無突變，突變位點(diǎn)多樣性單一。第二類有‘楚粳28號’、‘農(nóng)科843’和‘寧粳27號’等共11個品種。在1233、1694、1784、2059、2205、2283、2315、2459位點(diǎn)全部品種(系)發(fā)生突變，在1117(1118)、1576、1927、1970(1985)位點(diǎn)所有品種(系)無突變，1530(1546)位點(diǎn)多數(shù)品種(系)發(fā)生突變，1881位點(diǎn)只有少數(shù)品種(系)發(fā)生突變。品種間的差異主要在1881和1530(1546)位置變化。第三類有‘吉粳105’、‘寧粳44號’和‘稻京29’等共25個品種。只有1233和1881無品種發(fā)生無突變，其他位置的都有突變，而且品種間的差異非常大。

表4 寧夏49份主要水稻品種(系)各品種突變位點(diǎn)數(shù)

材料編號No.突變位點(diǎn)數(shù)Numberofmutationlocus材料編號No.突變位點(diǎn)數(shù)Numberofmutationlocus材料編號No.突變位點(diǎn)數(shù)Numberofmutationlocus材料編號No.突變位點(diǎn)數(shù)NumberofmutationlocusWB018WB149WB2710WB399WB029WB159WB280WB406WB039WB169WB299WB418WB049WB179WB307WB428WB057WB189WB318WB435WB069WB198WB328WB447WB079WB209WB337WB458WB089WB219WB348WB468WB099WB228WB356WB479WB109WB238WB368WB486WB115WB249WB377WB498WB129WB257WB389WB139WB266

WB01～WB49同表1圖2 寧夏49份主要水稻的Rf-1基因位點(diǎn)聚類分析樹狀圖WB1-WB49 are shown in Table 1Fig.2 Tree diagram for Rf-1 gene locus cluster analysis of 49 rice varieties in Ningxia

3 討 論

突變基因組為進(jìn)化的主要動力[17-18]，發(fā)生突變的栽培稻，為適應(yīng)不同的生態(tài)環(huán)境，在自然和人工的共同選擇產(chǎn)生秈稻-粳稻分化[19-21]，因此秈、粳稻在分子生物學(xué)方面出現(xiàn)非常大的差異[22-24]。通過對寧夏的主要品系Rf1b基因序列對比，結(jié)果有多處的位點(diǎn)發(fā)生突變，每個突變位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率不同。突變的類型主要是堿基的替換，而且變化位點(diǎn)多，品種間的變化大。插入突變位點(diǎn)相對少，只有少數(shù)品種(系)發(fā)生插入突變，這可能是由于堿基的替換高于插入突變[25]。

根據(jù)Rf-1基因不同突變位點(diǎn)，可以將寧夏主要的品種劃分3個類群，第一類群多數(shù)屬于早期育成的品種(系)，第二類群多數(shù)屬于較晚育成的品種(系)，第二類群比第一類的多樣性增加，突變點(diǎn)的數(shù)量減少。第三類群的品種多數(shù)屬于較近時期的品種(系)，突變位點(diǎn)多樣性增加，但突變點(diǎn)數(shù)量減少更多。 總體看第一類群體到第三類群體，品種間突變位點(diǎn)的差異增加，多樣性更豐富，突變點(diǎn)的數(shù)量有下降趨勢。這些發(fā)展趨勢可能與不同時期的目標(biāo)和使用親本材料更加豐富有關(guān)。早期育種目標(biāo)主要就是高產(chǎn)，育種過程中選用的親本單一。隨著人們生活水平不斷的提高，品種不僅要高產(chǎn)還要品質(zhì)好，近些年對品種的要求更高，在高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗性好和廣適應(yīng)等多方面都提出了更高的要求。秈粳稻雜交其后代瘋狂分離、變異幅度大、雜種優(yōu)勢強(qiáng)，蘊(yùn)藏巨大的遺傳潛力[26-27]，已經(jīng)成為國內(nèi)外水稻重要的育種策略和方法[28]。通過“秈粳架橋”使秈粳稻之間的基因交流更容易，利用秈粳稻雜交創(chuàng)造新株型和強(qiáng)優(yōu)勢，選育理想株型與優(yōu)勢利用相結(jié)合的超級稻等育種理論與技術(shù)路線確立[29-30]，不同地區(qū)的品種相互交流更多，秈粳血緣相互滲透更加廣泛， 在這種大的育種背景下，寧夏的品種背景也變得更復(fù)雜，增加更多的秈型血緣。這些可能導(dǎo)致Rf-1基因在不同突變位點(diǎn)的差異增加和突變點(diǎn)的數(shù)量下降趨勢。

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