成彥麗，王 曦，司衛(wèi)杰，朱騰飛，李火根

(南京林業(yè)大學(xué) 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心, 南京 210037)

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GSTs, EC 2.5.1.18)是一種普遍存在于生物體內(nèi)，具有不同功能的一組同工酶[1]。Booth等于1961年首次在動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，1970年Shimabukuro等在研究玉米時(shí)首次發(fā)現(xiàn)了植物中的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，隨著對(duì)GST基因研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)GST基因家族成員眾多、非常龐大，關(guān)于其分類(lèi)與功能研究也隨之展開(kāi)[2-4]。最新的分類(lèi)系統(tǒng)根據(jù)GST家族的基因結(jié)構(gòu)、蛋白序列的保守性、底物的特異性及免疫交叉反應(yīng)特性等，將其分為8個(gè)亞類(lèi)：phi、tau、theta、zeta、lambda、 DHA(dehydroascorbate reductase，谷胱甘肽依賴(lài)的抗壞血酸還原酶)、TCHQD(tetra chloro hydro quinine dehalogenase，四氯代氫醌脫鹵素酶)和微粒體的GSTs[5]。GST家族蛋白質(zhì)可清除細(xì)胞異源物質(zhì)，具有解毒作用；能夠跨膜運(yùn)輸定位，將植物中很多次級(jí)代謝物質(zhì)定位到合適的部位；保護(hù)細(xì)胞免受氧化損失；GSTs還可以作為配體蛋白，因此GST家族基因在植物響應(yīng)多種非生物脅迫過(guò)程中起到了重要作用[6]。

鵝掌楸(Liriodendronchinense Sarg.)和北美鵝掌楸(LiriodendrontulipiferaLinn.)是木蘭科(Magnoliaceae)鵝掌楸亞科(Subfam. Liriodendronideae)鵝掌楸屬(Liriodendron)現(xiàn)僅存的2個(gè)種[7-8]。該屬樹(shù)種樹(shù)干通直、生長(zhǎng)迅速、葉形奇特、花大而美、材性佳，對(duì)二氧化硫和氯氣抗性較強(qiáng)，是一類(lèi)良好的生態(tài)、園林綠化和用材樹(shù)種；同時(shí)該屬樹(shù)種還有藥用價(jià)值，亦可作為生物能源，用途廣泛，具有很高的價(jià)值[7-9]。盡管北美鵝掌楸與鵝掌楸是形態(tài)十分相似的姊妹樹(shù)種，但北美鵝掌楸作為極具優(yōu)勢(shì)的先鋒樹(shù)種，廣泛分布于美國(guó)東部及加拿大南部，并在阿拉巴契亞山區(qū)及賓夕法尼亞至佐治亞地區(qū)集中而連續(xù)分布[10-11]；鵝掌楸則星散分布于長(zhǎng)江流域以南，是中國(guó)稀有的第三紀(jì)孑遺樹(shù)種，由于種群規(guī)模小、天然群體種子萌發(fā)率低、不利環(huán)境、人為破壞等原因，已被列入中國(guó)珍惜瀕危物種名錄，并被IUCN紅色名錄列為瀕危物種，是國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物[7, 12-14]；進(jìn)一步的研究表明北美鵝掌楸多態(tài)性水平高、遺傳資源豐富、適應(yīng)能力強(qiáng)于鵝掌楸[7-8, 15-17]。

鵝掌楸屬是優(yōu)良的用材與觀賞樹(shù)種，開(kāi)展鵝掌楸抗逆性相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析，對(duì)于鵝掌楸抗逆基因的挖掘及應(yīng)用有理論與實(shí)踐價(jià)值。本研究從鵝掌楸屬數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出在植物抗逆過(guò)程中起重要作用的GST基因家族成員，克隆了4個(gè)GST基因的全長(zhǎng)序列，采用生物信息學(xué)軟件對(duì)其序列和編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行了分析，研究了該基因在北美鵝掌楸不同組織中的表達(dá)差異，期望為探索GST家族基因的功能和鵝掌楸屬適應(yīng)性的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 植物材料

2016年春季,在南京林業(yè)大學(xué)下屬實(shí)習(xí)林場(chǎng)的鵝掌揪屬種源試驗(yàn)林內(nèi),分別選取鵝掌楸(廬山種源, LS)和北美鵝掌揪 (美國(guó)路易斯安那州種源, LYS)各1株，采集兩者的花瓣用于基因克隆。同時(shí)采集LYS種源植株的嫩葉、花瓣、花萼、雄蕊、雌蕊、花芽、葉芽和莖，用于基因組織特異性表達(dá)分析。將采集的植株樣品冷凍于液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室,于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹18]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1RNA提取和cDNA第一鏈的合成利用RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒提取鵝掌楸與北美鵝掌楸花瓣及北美鵝掌楸嫩葉、花瓣、花萼、雄蕊、雌蕊、花芽、葉芽、莖的RNA(天根生化科技有限公司) 。以鵝掌楸與北美鵝掌楸花瓣中的RNA為模板,利用RevertAid strand cDNA Synthesis Kit(賽默飛世爾科技有限公司)合成cDNA第一鏈；利用5′Full RACE Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程有限公司)合成5′-RACE的cDNA；利用3′-Full RACE Core Set with PrimeScript RTase和SMARTer?RACE 5′/3′ Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程有限公司)合成3′-RACE的 cDNA。以北美鵝掌楸花瓣、花萼、雄蕊、雌蕊、花芽、葉、葉芽、莖的RNA為模板，利用PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(寶生物工程有限公司)。

1.2.2GST基因家族EST序列的挖掘根據(jù)GST和glutathione-S-transferase 2個(gè)基因注釋, 在北美鵝掌楸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ancangio.uga.edu/)與鵝掌楸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找GST家族基因的EST片段[19]。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，利用Blastn工具，對(duì)搜索到的EST片段在Nucleotide collection(nr/nt)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)分析。按照其比對(duì)得分的信息，將EST序列歸類(lèi)于GST基因家族中的各亞類(lèi)下,然后利用clustalx、DNAMAN軟件進(jìn)一步比對(duì)確認(rèn)。

1.2.3GSTs基因全長(zhǎng)的擴(kuò)增及ORF的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證以轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜尋出的EST序列為基礎(chǔ)，利用Oligo7軟件設(shè)計(jì)中間片段引物。RACE引物在中間片段的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)。ORF引物則以拼接得到的全長(zhǎng)來(lái)設(shè)計(jì)，利用ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)預(yù)測(cè)GSTs基因的開(kāi)放閱讀框,并在非翻譯區(qū)(UTR)設(shè)計(jì)ORF引物。中間片段、RACE克隆、ORF驗(yàn)證所用的特異性引物序列及引物的退火溫度見(jiàn)表1。

中間片段、RACE和ORF序列均通過(guò)PCR擴(kuò)增得到，其中RACE采用巢式PCR。以北美鵝掌楸EST序列為基礎(chǔ)的基因克隆，用北美鵝掌楸的cDNA模板，以鵝掌楸EST序列為基礎(chǔ)的基因克隆，用鵝掌楸的cDNA模板。中間片段、RACE序列克隆中所用到的PCR反應(yīng)體系總量為50 μL，包括：10×LATaqPCR Buffer II(Mg2+Free)緩沖液5 μL, MgCl2(25 mmol/L) 5 μL, dNTP Mixture (2.5 mmol/L each) 8 μL, 上游/下游引物(2.5 mmol/L each) 各2 μL,LATaq酶(5 U/μL) 0.5 μL, cDNA 2 μL, ddH2O 25.5 μL；相應(yīng)的PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s, 退火溫度 30 s, 72 ℃ 1 min, 35次循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。ORF驗(yàn)證使用的為高保真酶，其PCR反應(yīng)體系總量是50 μL，具體為：2×TransStart FastPfu PCR SuperMix 25 μL、ORF上游/下游引物(2.5 mmol/L each) 各2 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 19 μL；PCR相應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 3 min；94 ℃ 20 s, 50 ℃ 20 s, 72 ℃ 1 min, 循環(huán)35次；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。將反應(yīng)得到的PCR產(chǎn)物混合適量的5×Loading Buffer,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。把目的條帶切膠回收，將回收產(chǎn)物連入pEASY-T1載體(ORF的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)入pEASY?-Blunt克隆載體),轉(zhuǎn)入感受態(tài),涂板,過(guò)夜培養(yǎng)(載體購(gòu)自北京全式金公司)。最后進(jìn)行陽(yáng)性克隆檢測(cè),將菌液送至南京金斯瑞公司測(cè)序。

1.2.4GSTs基因的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blastn和Blastp程序,對(duì)LtGSTparCb、LtGSTZ-like、LtGSTF13a和LcGSTT1這4個(gè)基因的同源序列和同源蛋白質(zhì)進(jìn)行搜索比對(duì)。選取與LtGSTparCb、LtGSTZ-like、LtGSTF13a、LcGSTT1相似性高的蛋白質(zhì)序列及擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.arabidopsis.org/)中GST家族的蛋白質(zhì)序列，利用MEGA6.0軟件，采用鄰接法(Neighborhood-Join, NJ)，將Bootstrap設(shè)為1 000次重復(fù)，構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),預(yù)測(cè)鵝掌楸屬GSTs蛋白質(zhì)與其他物種GSTs蛋白質(zhì)的親緣關(guān)系[20]。使用在線軟件Expasy ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)LtGSTparCb、LtGSTZ-like、LtGSTF13a和LcGSTT1這4個(gè)基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。通過(guò)在線工具TargetP (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)對(duì)LtGSTparCb、LtGSTZ-like、LtGSTF13a和LcGSTT1蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用SOPMA (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_autom,AT.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)LtGSTparCb、LtGSTZ-like、LtGSTF13a和LcGSTT1蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。通過(guò)NCBI中的CCD (Conserved Domains)程序分析這4個(gè)蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域。

1.2.5GSTs基因的組織特異性表達(dá)分析以Actin引物為內(nèi)參基因, 同時(shí)設(shè)計(jì)LtGSTparCb、LtGSTZ-like、LtGSTF13a和LcGSTT1 的實(shí)時(shí)熒光定量引物，對(duì)GST家族基因在北美鵝掌楸花瓣、花萼、雄蕊、雌蕊、花芽、葉、葉芽、莖8個(gè)不同組織中的表達(dá)量進(jìn)行分析(表1)[21]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系為20 μL，包括：SYBRPremix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(2×) 10 μL,上游/下游引物(10 μmol/L each)各0.4 μL, ROX Reference Dye(50×) 0.4 μL, DNA模板2 μL, ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s, 60 ℃ 13 s, 循環(huán)40次；95 ℃ 15 s；95 ℃ 1 min, 60 ℃ 15 s, 循環(huán)1次。定量實(shí)驗(yàn)在本實(shí)驗(yàn)室ABI SteponePlus儀器上進(jìn)行。

表1 GST家族基因克隆所用的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 鵝掌楸屬GST家族基因的篩選

根據(jù)GST、glutathione-S-transferase注釋?zhuān)诒泵砾Z掌楸和鵝掌楸轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中分別篩選出46條和14條GST基因家族的EST片段。利用Blastn比對(duì)，將所有GST的EST序列統(tǒng)一為5′到3′的順序，并根據(jù)NCBI同源序列比對(duì)結(jié)果的注釋?zhuān)瑢?0條EST序列進(jìn)行初步分類(lèi)。其中54條EST序列與GST基因家族序列相似度高，通過(guò)DNAMAN、 ClustalX、Mega6.0軟件進(jìn)行比對(duì)鑒定出19條GST家族基因的EST序列，分別來(lái)自于GST基因家族的Tau、Zeta、Theta及Phi 4個(gè)亞類(lèi)。其中，Tau類(lèi)搜索出8個(gè)基因；Zeta類(lèi)和Theta類(lèi)各鑒定出2個(gè)基因；Phi類(lèi)包括7個(gè)基因；各個(gè)基因包括的EST參考序列見(jiàn)表2。此外，還有6條EST序列長(zhǎng)度較短且與其它物種的GST家族基因序列相似度低，因而被排除。

2.2 GSTs基因的克隆

根據(jù)從Tau、Zeta、Theta和Phi類(lèi)中選出的4條EST序列(gnl|Liriodendron|b4_rep_c76383、gnl|Liriodendron|b4_rep_c83858、gnl|Liriodendron|b4_c37453、comp90152_c0)設(shè)計(jì)中間片段引物，克隆得到4條長(zhǎng)度分別為961、594、788和713bp的中間片段 (圖1，A、E、I和M)；通過(guò)3′-RACE克隆技術(shù)，擴(kuò)增出4條長(zhǎng)度分別為293、351、247和629 bp的3′端序列(圖1，B、F、J和N)，其中編碼為gnl|Liriodendron|b4_rep_c76383的EST序列，其3′端序列擴(kuò)增采用的是利用SMARTer?RACE 5′/3′Kit合成的cDNA，其余均采用3′-Full RACE Core Set with PrimeScript RTase反轉(zhuǎn)錄的cDNA；通過(guò)5′-RACE技術(shù)，擴(kuò)增出4條長(zhǎng)度分別為446、368、483和347 bp的5′端序列(圖1，C、G、K和O)。將這4條基因的中間片段、3′端序列、5′端序列分別進(jìn)行拼接，得到4條全長(zhǎng)分別為1 150、932、1 022和1 067 bp的cDNA。利用ORF finder預(yù)測(cè)這4條基因全長(zhǎng)的開(kāi)放閱讀框，發(fā)現(xiàn)其開(kāi)放閱讀框(open reading frame, ORF)長(zhǎng)度分別為663、675、651和750 bp，編碼氨基酸的個(gè)數(shù)分別是220、224、216和249 aa。進(jìn)一步設(shè)計(jì)ORF引物驗(yàn)證預(yù)測(cè)的ORF，測(cè)序結(jié)果與全長(zhǎng)序列比對(duì)后一致，表明該基因克隆正確(圖1，D、H、L和P)。

A～D、E～H、I～L、M～P分別為L(zhǎng)tGSTparCb、LtGSTZ-like、LtGSTF13a、 LcGSTT1基因的中間片段、3′端產(chǎn)物、5′端產(chǎn)物和ORF產(chǎn)物; M1. DL5000; M2. DL2000; M3. DL1500圖1 GST家族基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖A-D, E-H, I-L, M-P are intermediate fragments, 3′ RACE fragments, 5′ RACE fragments, ORF fragments of LtGSTparCb, LtGSTZ-like, LtGSTF13a，LcGSTT1 genes; M1. DL5000; M2. DL2000; M3. DL1500Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products about GST family genes

2.3 GSTs基因的同源分析

將這4條GSTs基因的全長(zhǎng)序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blastn、Blastp比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這些序列與其他物種中的GST家族基因高度同源。根據(jù)相似性高的比對(duì)結(jié)果，將這4個(gè)基因分別命名為L(zhǎng)tGSTparCb、LtGSTZ-like、LtGSTF13a和LcGSTT1。選取其他物種中與鵝掌楸屬這4條基因編碼蛋白質(zhì)相似度高的同源蛋白質(zhì)序列及擬南芥中GST家族的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)，并用MEGA6.0軟件，采用鄰接法及1 000次Bootstrap重復(fù)，構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)。分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，68條來(lái)自不同物種GST家族的蛋白質(zhì)序列被分為5類(lèi)，分別是Lambda、Phi、Tau、Theta和Zeta。LtGSTparCb屬于Tau類(lèi)；LtGSTZ-like與Zeta類(lèi)聚為一支；LtGSTF13a與Phi類(lèi)分為一類(lèi)；LcGSTT1屬于Theta類(lèi)。

2.4 GSTs蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析

根據(jù)氨基酸的理化性質(zhì)推測(cè)這4個(gè)基因編碼蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。分析表明, LtGSTparCb、LtGSTZ-like、LtGSTF13a、LcGSTT1蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量分別約為25.174 28、25.335 30、24.487 21和28.085 71 kD。LtGSTparCb、LtGSTZ-like、LtGSTF13a蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)分別為5.60、6.53、6.66, 屬于酸性蛋白；LcGSTT1的等電點(diǎn)是9.20，屬于堿性蛋白。LtGSTparCb、LtGSTZ-like、LtGSTF13a和LcGSTT1蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)分別是33.01、36.97、 43.19 和47.96,因此LtGSTparCb、LtGSTZ-like為穩(wěn)定蛋白, LtGSTF13a、LcGSTT1是不穩(wěn)定蛋白。LtGSTparCb、LtGSTZ-like、LtGSTF13a和LcGSTT1蛋白質(zhì)的親水性系數(shù)分別為89.95、101.56、86.25和98.35；平均親水性系數(shù)分別是-0.209、-0.065、-0.275和-0.133，這4種蛋白質(zhì)的平均親水性系數(shù)值均大于-0.5, 有一定的親水性。

LtGSTparCb、LtGSTZ-like、LtGSTF13a、LcGSTT1用▲標(biāo)出；分支上的數(shù)值為鄰接法1 000次Bootstrap檢驗(yàn)的自引導(dǎo)值圖2 LtGSTparCb、LtGSTZ-like、LtGSTF13a、LcGSTT1蛋白質(zhì)與其他植物中同源蛋白質(zhì)序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)LtGSTparCb, LtGSTZ-like, LtGSTF13a, LcGSTT1 were labeled with ▲; The numbers above the branches are the Bootstrap values using Neighbor-joining method of 1 000 times bootstrappingFig.2 Phylogenetic tree of LtGSTparCb, LtGSTZ-like, LtGSTF13a, LcGSTT1 proteins with homologous GST proteins from other species

名稱(chēng)Name長(zhǎng)度Length/aa葉綠體導(dǎo)肽cTP線粒體導(dǎo)肽mTP信號(hào)肽SP其他類(lèi)型Other位置Location可靠性級(jí)別RCLtGSTparCb2200.0510.2410.2470.641_4LtGSTZ-like2240.1140.2580.0580.307_5LtGSTZ-like2160.0230.1210.3550.739_4LcGSTT12490.0080.2650.1030.845_3

表4 GSTs蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

2.5 GSTs蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

使用TargetP對(duì)LtGSTparCb、LtGSTZ-like、LtGSTF13a、LcGSTT1蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)(表3)。預(yù)測(cè)結(jié)果表明LtGSTparCb、LtGSTZ-like、LtGSTF13a、LcGSTT1蛋白質(zhì)極有可能是除葉綠體導(dǎo)肽、線粒體導(dǎo)肽、信號(hào)肽之外的其他類(lèi)型蛋白質(zhì)(other)。LtGSTparCb、LtGSTZ-like、LtGSTF13a、LcGSTT1是其他類(lèi)型蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)值分別為0.641、0307、0.739、0.845,均高于這4種蛋白質(zhì)是葉綠體導(dǎo)肽、線粒體導(dǎo)肽、信號(hào)肽的預(yù)測(cè)值?！癓oc”是基于蛋白質(zhì)類(lèi)型的分值預(yù)測(cè)出該蛋白質(zhì)的位置, _指該蛋白質(zhì)可能位于除葉綠體、線粒體、分泌通路的其他位置,這與上述分析一致。該預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性級(jí)別RC (reliablity class)為1級(jí),即diff>0.800,可靠性很高。

2.6 GSTs蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過(guò)SOPMA對(duì)LtGSTparCb、LtGSTZ-like、LtGSTF13a、LcGSTT1這4個(gè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)這4個(gè)蛋白質(zhì)中α螺旋(alpha helix)的含量均為最高,其次是無(wú)規(guī)則卷曲(random coil),延伸鏈(extended strand)和β轉(zhuǎn)角(beta turn)的含量最低(表4)。分析表明α螺旋是這4個(gè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要成分。

2.7 GSTs蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析

使用CCD預(yù)測(cè)LtGSTparCb、LtGSTZ-like、LtGSTF13a、LcGSTT1蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域。預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)LtGSTparCb在5～80 bp和90～215 bp之間分別有一個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)功能域GST_N_Tau (cd03058)和 GST_C_Tau (cd03185)。LtGSTZ-like和LtGSTF13a分別在第15～215 bp和1～210 bp之間有一個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)功能域GstA super family(cl25459)。LcGSTT1在1～80和90～230 bp之間分別有一個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)功能域GST_N_Theta(cd03050)和GST_C_Theta(cd03183)。

2.8 GSTs基因的組織特異性表達(dá)分析

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析這4個(gè)基因在北美鵝掌楸花瓣、花萼、雄蕊、雌蕊、花芽、葉、葉芽和莖8個(gè)不同組織中的表達(dá)量。 圖3表明,LtGSTparCb、LtGSTZ-like、LtGSTF13a和LcGSTT1在8個(gè)組織中均有表達(dá)。但LtGSTparCb和LtGSTF13a在葉中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組織中的表達(dá)量。LtGSTZ-like在花器官中的表達(dá)量高于其他組織，在葉中的表達(dá)量最低，在其他組織中的表達(dá)量居于兩者之間。LcGSTT1在葉中表達(dá)量最高, 花部器官其次,在莖和葉芽中的表達(dá)量偏低。

圖3 GSTs基因在北美鵝掌楸8個(gè)不同組織中的表達(dá)Fig.3 Expression of GST genes among eight different tissues in L. tulipifera

3 討 論

在鵝掌楸屬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定出的4個(gè)GST基因家族的亞類(lèi)中，Tau、Phi亞類(lèi)的成員較多，分別為8個(gè)和7個(gè)成員，Zeta、Theta亞類(lèi)的成員較少，均只包含2個(gè)成員。這與其他植物中GST基因家族成員數(shù)量分布類(lèi)似，Tau和Phi作為植物特有的GST類(lèi)型，在植物中通常具有較多的成員數(shù)目[22]。GST是一個(gè)較大的基因家族：大豆中有25個(gè)成員，玉米中有42個(gè)，擬南芥中有48個(gè)家族成員[23]，本研究在鵝掌楸屬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中共鑒定出19個(gè)成員。鑒于RNA的表達(dá)具有時(shí)空性，轉(zhuǎn)錄組是特定組織或細(xì)胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有RNA的集合[24]，因此本研究挖掘的GST基因家族成員雖然可能仍有遺漏，但對(duì)于了解鵝掌楸屬GST基因家族成員有較大的參考意義。

LtGSTparCb、LtGSTZ-like、LtGSTF13a和LcGSTT1 4個(gè)基因分別屬于GST基因家族的Tau、Zeta、Phi及Theta 4個(gè)亞類(lèi)。Phi類(lèi)GST基因在植物的抗逆反應(yīng)、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和植物抗病等方面發(fā)揮著重要作用[25-26]。Tau類(lèi)GST基因可以響應(yīng)并減輕由病原體攻擊、物理傷害、重金屬中毒、氧化脅迫和溫度脅迫等一系列內(nèi)源或外源的壓力引起的傷害[27-28]。盡管Phi類(lèi)和Tau類(lèi)蛋白質(zhì)都可以在除草劑解毒過(guò)程中起到關(guān)鍵作用，但Phi類(lèi)GST蛋白質(zhì)可以高效作用于對(duì)氯乙酰苯胺和硫代氨基甲酸酯類(lèi)除草劑，而Tau類(lèi)蛋白質(zhì)則作用于二苯醚和芳氧基丙酸類(lèi)除草劑[29]。Theta類(lèi)GSTs與谷胱甘肽過(guò)氧化物酶類(lèi)似，它能減少氧化脅迫產(chǎn)生的過(guò)氧化物[22, 30]。Zeta類(lèi)蛋白質(zhì)參與酪氨酸降解，催化依賴(lài)GSH的馬來(lái)酰乙醜乙酸轉(zhuǎn)化為延胡索酰乙酰乙酸鹽，因此是依賴(lài)GSH的異構(gòu)酶[22]。

LtGSTparCb、LtGSTZ-like、LtGSTF13a、LcGSTT1蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量分別是25.17、25.34、24.49和28.09 kD，這和Frova于2003總結(jié)的GSTs蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的結(jié)論類(lèi)似，即大多數(shù)可溶性GSTs以同源或異源二聚體的形式發(fā)揮催化活性，單體大小在23～30 kD左右[31]。LcGSTT1的等電點(diǎn)較LtGSTparCb、LtGSTZ-like、LtGSTF13a高出很多，被劃分為堿性蛋白，這與擬南芥的Theta類(lèi)蛋白質(zhì)類(lèi)似，擬南芥中Theta類(lèi)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)均很高，pH在8.9～9.5之間[22]。TargetP亞細(xì)胞預(yù)測(cè)結(jié)果表明，LtGSTparCb、LtGSTZ-like、LtGSTF13a、LcGSTT1這4個(gè)蛋白質(zhì)可能位于除葉綠體、線粒體、分泌通路的其他位置，結(jié)合生化和免疫學(xué)方面的研究結(jié)果，即植物體內(nèi)可溶性GSTs可能大都定位到細(xì)胞質(zhì)中，預(yù)測(cè)LtGSTparCb、LtGSTZ-like、LtGSTF13a、LcGSTT1蛋白質(zhì)極有可能位于細(xì)胞質(zhì)之內(nèi)，對(duì)于此結(jié)論尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[32]。LtGSTparCb、LcGSTT1蛋白質(zhì)N端和C端的保守結(jié)構(gòu)域?qū)τ谄湫惺构δ芫哂兄匾饔?，GSH 可以結(jié)合到GST蛋白質(zhì)N端的氧化還原結(jié)構(gòu)域GST_N_Tau(cd03058) 和GST_N_Theta(cd03050)上，疏水性物質(zhì)則結(jié)合到C端的GST_C_Tau(cd03185)和GST_C_Theta(cd03183)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的α螺旋中[5, 31-33]。LtGSTZ-like和LtGSTF13a均擁有GstA super family(cl25459)結(jié)構(gòu)域，關(guān)于該結(jié)構(gòu)的功能描述較少，需要進(jìn)一步研究。

LtGSTparCb、LtGSTZ-like、LtGSTF13a和LcGSTT1 4個(gè)基因在北美鵝掌楸各個(gè)組織中均有表達(dá)，說(shuō)明這4個(gè)基因均為組成型表達(dá)。海南龍血樹(shù)(Dracaenacambodiana)的DcGSTU5基因與本研究中的LtGSTparCb相似度高，其在海南龍血樹(shù)中的表達(dá)與類(lèi)黃酮的生物合成基因相關(guān)，并與龍血的積累量一致[34]；DcGSTU5基因在海南龍血樹(shù)葉中的表達(dá)量最高，其次是根和果實(shí)，在花和莖中的表達(dá)量極低，這與LtGSTparCb在北美鵝掌楸嫩葉中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組織的趨勢(shì)類(lèi)似,可為該基因在北美鵝掌楸中的功能研究提供方向[34]。劉迪秋等于2012年克隆得到火把梨(Pyruspyrifolia)中的PpGST基因，該基因?qū)儆趜eta類(lèi)GST，與本研究中的LtGSTZ-like基因相似度極高，該基因在火把梨光照的果皮和沒(méi)有光照的果皮中大量表達(dá)，而在幼嫩葉片中表達(dá)量很低，幾乎檢測(cè)不到，他們推測(cè)PpGST基因在果皮中表達(dá)量較高與維持火把梨果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的氧化還原平衡及應(yīng)答逆境脅迫有關(guān)[30]；LtGSTZ-like在北美鵝掌楸嫩葉中的表達(dá)量最低，這與劉迪秋等的研究結(jié)果類(lèi)似，但對(duì)于其在花器官中具有較高表達(dá)量的原因需要進(jìn)一步分析。從荔枝(LitchichinensisSonn.)中克隆的LcGST4基因與本研究中的LtGSTF13a序列很相似，其在荔枝成熟的紅色果皮中表達(dá)量最高，其次是嫩葉，在成熟葉、假種皮、成熟葉中不表達(dá)，這與荔枝中花青素積累所在的組織一致，即推測(cè)LcGST4基因的表達(dá)可能與花青素的合成有關(guān)[35]；LtGSTF13a在北美鵝掌楸花器官中表達(dá)量較低，有研究表明北美鵝掌楸的花被片不含花青素，據(jù)此推測(cè)LtGSTF13a基因在北美鵝掌楸的表達(dá)極有可能與花青素的合成有關(guān)[36]。本研究中LcGSTT1基因在葉中表達(dá)量最高，其次是花部器官，在莖和葉芽中的表達(dá)量偏低，與之序列相似的基因與植物的抗逆性有關(guān)，對(duì)于該基因確切的功能尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[1]。

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