唐文龍，趙鵬飛，李永華，賀 丹，逯久幸

(河南農(nóng)業(yè)大學 林學院, 鄭州 450002)

高等植物的花由外至內(nèi)依次由花萼、花瓣、雄蕊及雌蕊組成[1]，不同花器官由不同類型基因所操控。在擬南芥中，控制植物花器官功能基因可被分為A、B、C等3類，稱為“ABC”模型[2]。隨著D類與E類功能基因先后發(fā)現(xiàn)[3]，以及四分體模型假說[4]與同源異形盒理論提出，“ABC”模型已被豐富為“ABCDE”模型。在“ABCDE”等5類功能基因中，E類基因所編碼的同源蛋白可作為分子橋梁，與其他類型轉錄因子形成蛋白復合物，并結合在相鄰兩段特定DNA區(qū)域即CArG盒從而調(diào)控下游靶基因表達，調(diào)控花器官形成[5]。

目前E類功能基因均來自于MADS_box基因家族中AGL6-like、SEP-like以及AP1/SQUA/FUL-like 3個亞家族。與其他2個E類基因不同，AGL6在被子植物與裸子植物中同時存在[6]。近年來已經(jīng)從買麻藤[7]、珊狀臂形草[8]、水稻[9]多種植物中克隆得到AGL6-like基因。買麻藤AGL6同源基因GGM9與GGM11同時在雄性以及雌性生殖器官中表達，但并未在葉片中表達[7]；珊狀臂形草BbrizAGL6基因同樣在生殖器官中表達[8]；水稻OsMADS6在分生組織及部分花器官中表達，并與其他花發(fā)育同源基因互作調(diào)控花器官分化及分生組織形成[9]。AGL6基因在植物花發(fā)育中發(fā)揮重要作用，但功能機制仍需深入研究。

牡丹為芍藥科芍藥屬牡丹組重要的園林觀賞植物。牡丹屬于多年生木本植物，實生苗成花期較長，花期較短且胚珠敗育率高等嚴重影響牡丹育種與生產(chǎn)工作。因此研究牡丹花發(fā)育相關基因，對深入了解牡丹花發(fā)育機制具有重要幫助。目前已經(jīng)從牡丹中先后克隆了AP1、AP2、SEPALATA、SOC1和FUL等花發(fā)育相關基因，并對其功能進行了分析[10]，但有關牡丹AGL6同源基因的研究還未見報道。本研究以牡丹品種‘洛陽紅’為材料，結合轉錄組分析，利用RT-PCR方法克隆AGL6基因cDNA序列；并結合qRT-PCR技術對牡丹各器官及不同花型牡丹品種的花瓣中AGL6基因表達模式進行分析，為深入研究AGL6同源基因在牡丹花器官形成中的功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為10年生牡丹‘洛陽紅’植株，種植于河南農(nóng)業(yè)大學實驗園區(qū)。2016年4月采集盛花期牡丹花萼、花瓣、雄蕊及雌蕊用于花器官組織特異性分析。同期于鄭州西流湖公園采集不同花型的牡丹品種‘白雪塔’(皇冠型)、 ‘王紅’(繡球型)、 ‘大金粉’(荷花型)與‘紫金盤’(薔薇型)花瓣， 并于當年6月初采集‘洛陽紅’根、莖、葉、果。所有樣品采集后用錫紙包裹，自封袋分裝并編號，迅速置于液氮中速凍，再放入-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2 RNA提取與AGL6基因克隆

用改良CTAB法提取牡丹‘洛陽紅’花瓣中總RNA。反轉錄采用PrimescriptTMⅡ 1st strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa,大連)反轉錄試劑盒，依照說明書操作。通過對牡丹轉錄組數(shù)據(jù)庫的檢索，獲得AGL6同源序列。利用Primer 5.0設計引物，PCR擴增獲得AGL6基因序列(表1)。DNA聚合酶采用TaKaRa ExTaq(TaKaRa， 大連)。PCR擴增反應體系如下：稀釋后cDNA 2 μL，DNA聚合酶(2.5 U/μL)0.4 μL，10 xTaq緩沖液5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 36.6 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，34個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根， 北京)純化，純化產(chǎn)物連接到pMD-18T載體(天根， 北京)將重組質(zhì)粒轉化到大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞(天根，北京)，涂于含有AMP+LB固體培養(yǎng)基中，篩選陽性克隆送至公司測序(上海英濰捷基)。

1.3 序列分析

利用DNAMEN5.0軟件翻譯PsAGL6開放閱讀框獲得氨基酸序列。在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進行蛋白保守結構域預測。通過在線工具ProtParam(http://expasy.org/tools/protparam.html)對該蛋白基本理化性質(zhì)進行分析； SOMPA(http://expasy.cn/tools)在線工具用來分析該蛋白二級結構；結合Smart-BLAST在線(http://smart.emblheidelberg.de)搜索與PsAGL6相似度較高其他蛋白序列信息。結合ClustalX 2.0軟件進行多序列比對，通過MEGA 5.0軟件采用Neighbor-joining計算方法構建同源進化樹，設置Bootstrap參數(shù)為1 000。

1.4 qRT-PCR分析

根據(jù)測序獲得的PsAGL6基因序列通過primer3軟件設計特異性引物(表1)，以Ubiquitin為內(nèi)參基因進行qRT-PCR反應。反應在Applied Biosystems 7500 Fast Real-time PCR System進行，總反應體系為20 μL。反應程序如下：預變性95 ℃ 30 s；預變性95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)；60 ℃后延伸30 s。每個樣品重復3次，反應結束通過2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量。并使用SPSS軟件t檢驗對結果進行差異顯著性分析。

表1 引物序列

2 結果與分析

2.1 牡丹PsAGL6 cDNA全長克隆與序列分析

通過檢索牡丹轉錄組數(shù)據(jù)庫，獲得牡丹AGL6同源基因序列。以牡丹‘洛陽紅’盛花期花瓣cDNA為模版，經(jīng)PCR擴增并測序得到一個732 bp含有完整開放閱讀框的CDS序列(圖1)，編碼244個氨基酸(圖2)。結合Smart-Blast蛋白序列分析，該基因具有完整MADS-box結構域及K box結構域，確定該序列為MADS-box基因家族基因。該基因序列與可可(Theobromacacao)AGL6氨基酸序列，陸地棉(Gossypiumhirsutum)AGL6氨基酸序列具有較高相似度，應屬于牡丹中AGL6同源基因，命名為PsAGL6，GeneBank登錄號為MF563611。

2.2 PsAGL6基因同源性與系統(tǒng)進化分析

將PsAGL6基因提交至在線Blast中，選擇11個一致性較高氨基酸序列，并結合Clustal2.0軟件對12條氨基酸序列進行多重序列比對分析(圖3)，PsAGL6與葡萄(Vitisvinifera)、可可(Theobromacacao)、陸地棉(Gossypiumhirsutum)等氨基酸序列一致性較高，分別為79%、75%和74%。結構域分析顯示PsAGL6基因包含有MADS MEF Domain、K-box Domain以及典型AGL6 Motif Ⅰ 與AGL6 Motif Ⅱ，從而進一步確定該序列為AGL6同源基因。前人研究顯示，MADS-box蛋白中高度保守MADS domain可通過特異識別并結合于轉錄因子靶基因中特異DNA序列(即CArG盒)，調(diào)控基因的時空表達[11]。相對保守K-box Domain主要功能為調(diào)控蛋白間互作。而高度不保守C末端中存在特異保守基序。這些基序功能可能與蛋白復合物形成及轉錄活性有關[12]。PsAGL6蛋白具有AGL6 Motif Ⅰ和Ⅱ保守基序，該基序功能可能也與此類似。

為驗證PsAGL6基因親緣關系，從NCBI數(shù)據(jù)庫篩選到10個物種11個氨基酸序列，與牡丹PsAGL6蛋白序列一同提交至MEGA5.0軟件，利用Neighbor-joining 方法構建系統(tǒng)進化樹(圖4)，牡丹PsAGL6與野茶樹CsMADS聚類為一支，序列相似度86%，說明牡丹與野茶樹親緣關系最為接近。

2.3 PsAGL6理化性質(zhì)和蛋白結構分析

對PsAGL6基因進行理化性質(zhì)預測分析，該蛋白總分子量為28.3 kD，等電點8.75，偏堿性，平均疏水系數(shù)為-0.779，定性為親水性蛋白。蛋白不穩(wěn)定指數(shù)46.57，推測為不穩(wěn)定蛋白。結合在線SOPMA程序?qū)Φ鞍锥壗Y構分析，該蛋白由α螺旋、β轉角、無規(guī)則卷曲以及擴展鏈結構構成(圖5)。其中4種結構占百分比依次為α螺旋(54.51%)>無規(guī)則卷曲(22.54%)>擴展鏈結構(15.57%)>β轉角(7.38%)。α螺旋在該蛋白結構域中承擔重要作用，主要位于MADS-box蛋白結構域K-box domain，少部分位于MADS domain(圖3和圖5)。有研究證實MADS-box蛋白結構域K-domain由3個連續(xù)兩性α螺旋所構成(即K1、K2和K3)。該結構域中K1與K2參與蛋白二聚體互作，K3涉及高階復合物形成。而MADS domain中α螺旋與該結構域中的部分蛋白一同結合于CArG盒，調(diào)控靶基因表達[11]。

1. DL1000; 2. PsAGL6擴增產(chǎn)物圖1 牡丹PsAGL6基因PCR擴增產(chǎn)物1.DL1000; 2. PCR products of PsAGL6 geneFig.1 PCR products of PsAGL6 gene in Paeonia suffruticosa ‘Luoyanghong’

圖2 PsAGL6基因ORF序列及推導的氨基酸序列Fig.2 The ORF sequence and deduced amino acid sequence of PsAGL6

TcAGL6. 可可(EOX96140.1); VvMADS3.葡萄(NP_001268111.1); GhAGL6. 陸地棉(NP_001314584.1); HuAGL6.哥倫比亞錦葵(XP_021280322.1); JcAGL6. 麻瘋樹(XP_012083518.1); CsMADS. 野茶樹(AMQ10447.1)圖3 PsAGL6基因編碼氨基酸與相近AGL6組蛋白比較TcAGL6. Theobroma cacao (EOX96140.1); VvMADS3. Vitis vinifera (NP_001268111.1); GhAGL6. Gossypium hirsutum (NP_001314584.1); HuAGL6. Herrania umbratica (XP_021280322.1); JcAGL6. Jatropha curcas (XP_012083518.1); CsMADS.Camellia sinensis (AMQ10447.1)Fig.3 Comparisons of PsAGL6 amino acid and AGL6 group proteins

2.4 PsAGL6在不同組織和不同花型中的表達分析

對牡丹‘洛陽紅’根、莖、葉、果實和種子5個器官和花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊4個花器官進行了組織特異性分析。結果(圖6，A)顯示，PsAGL6在所有組織中均有表達，但是表達量存在顯著差異(P<0.05)。在根、莖和葉中表達量相比果實、種子和花器官中的表達量較低，尤其在葉子中，PsAGL6的表達量達到最低，幾乎為0。這表明PsAGL6基因主要與植物的生殖器官發(fā)育相關。在4個花器官中，PsAGL6在萼片、花瓣和雌蕊顯著表達，相對表達量分別為13.4、9.0和5.0 。

TcAGL6.可可(EOX96140.1)；HuAGL6.哥倫比亞錦葵(XP_021280322.1)； GhAGL6. 陸地棉(NP_001314584.1)； HcMADS. 大麻槿(ADZ98838.1)；GhAGL6-2. 陸地棉(NP_001314565.1)； PpMADS.梨(BAK18784.2)；MdAGL6.蘋果(NP_001280892.1)；JcAGL6.麻瘋樹(XP_012083518.1)； MeMADS6.木薯(XP_021613881.1)；VvMADS3.葡萄(NP_001268111.1);CsMADS.野茶樹(AMQ10447.1)圖4 PsAGL6及其他物種AGL6氨基酸序列的同源進化分析TcAGL6. Theobroma cacao(EOX96140.1)；HuAGL6. Herrania umbratica(XP_021280322.1)；GhAGL6. Gossypium hirsutum(NP_001314584.1)；HcMADS. Hibiscus cannabinus(ADZ98838.1)；GhAGL6-2. Gossypium hirsutum(NP_001314565.1)； PpMADS. Pyrus pyrifolia var. Culta(BAK18784.2)；MdAGL6. Malus domestica(NP_001280892.1)； JcAGL6. Jatropha curcas(XP_012083518.1)；MeMADS6. Manihot esculenta(XP_021613881.1)；VvMADS3. Vitis vinifera(NP_001268111.1)；CsMADS. Camellia sinensis(AMQ10447.1)Fig.4 Phylogenetic tree of the amino acid sequences of PsAGL6 and other plants

圖5 PsAGL6蛋白二級結構預測Fig.5 The structure prediction of PsAGL6 protein

A. S1～S8分別為‘洛陽紅’果、葉、莖、根、萼片、 花瓣、雄蕊與雌蕊; B. P1～P4 分別為大金粉、白雪塔、王紅、紫金盤; 不同小寫字母表示差異顯著P<0.05圖6 牡丹PsAGL6基因在不同組織(A)和不同花型花瓣(B)中的表達量A. S1-S8. Fruit, leaf, stem, root, sepal, petal, stamen and carpel, respectively; B. P1-P4. The flower type of Lotus, Crown, Hydrangea and Rose; Different letters mean significant difference at 0.05 levelFig.6 Relative expression level of peony tree PsAGL6 gene in various tissues (A) and different double petals (B)

前人研究顯示AGL6基因參與花瓣變異，過量表達AGL6基因的植株花瓣數(shù)量增多[13-14]，為探究PsAGL6在牡丹中是否也與花瓣數(shù)量變化相關。本研究根據(jù)花瓣數(shù)量的不同選擇了荷花型品種‘大金粉’、薔薇型品種‘紫金盤’、皇冠型品種‘白雪塔’和繡球型品種‘王紅’。結果(圖6，B)顯示，與‘大金粉’、‘王紅’和‘白雪塔’相比，PsAGL6基因在薔薇型品種‘紫金盤’中的相對表達量最高(16.2)，與其他品種差異達到極顯著水平。而在荷花型品種‘大金粉’、皇冠型品種‘白雪塔’和繡球型品種‘王紅’中，PsAGL6的相對表達量差異不顯著。

3 討 論

AGL6基因是MADS-box基因家族重要成員，隸屬于該家族的AGL6亞家族，AGL6亞家族與SEP亞家族互為姊妹關系，共同歸類為“E”類功能基因。水稻等多種高等植物中證明AGL6具備與“E”類功能基因相近的調(diào)控方式，與花器官形成、種子與胚珠發(fā)育、生殖器官及配子體發(fā)育等作用相關[15]。本研究以牡丹“洛陽紅”為材料，從牡丹花瓣中克隆AGL6-like基因，從序列一致性比對及系統(tǒng)進化分析來看，PsAGL6氨基酸序列分別與葡萄VvAGL6以及野茶樹CsMADS親緣關系接近。保守結構域分析發(fā)現(xiàn)，該基因包含有完整的MADS-MEF2、K-box、典型AGL6 Motif Ⅰ與AGL6 Motif Ⅱ，屬于MADS-box家族中AGL6同源基因。說明本研究克隆得到的PsAGL6基因應該是牡丹中AGL6基因，所以可能在牡丹中行使相似的功能。

AGL6基因在組織中的表達因物種不同存在很大差異。玉米中AGL6同源基因ZAG3僅在花分生組織中表達，而外稃與雄蕊中不表達[16]。番茄AGL6同源基因SlAGL6在花萼與花瓣中表達，在其他花組織中表達較少。與正常植株相比，沉默AGL6基因的番茄突變體表現(xiàn)出萼片融合，且花瓣呈綠色表型特征，推測可能由于AGL6基因沉默影響到了A類與B類花發(fā)育基因表達，進而造成萼片和花瓣的變異[14]。在蘭花中，文心蘭OMADS6在花萼、花瓣、唇瓣、雌蕊中均有表達，但雄蕊中并無表達，這個結果與我們不同組織特異分析得到的結果一致。在春蘭的研究中，AGL6正常瓣與突變碟形瓣中表達量呈現(xiàn)顯著差異，推測AGL6基因可能涉及到瓣形變異[13]。本研究中，PsAGL6在根、莖和葉中表達量相比果實、種子和花器官中的較低。這表明PsAGL6基因主要與植物的生殖器官發(fā)育相關。在4個花器官中，PsAGL6在萼片、花瓣和雌蕊顯著表達。這說明PsAGL6可能主要參與牡丹萼片、花瓣和雌蕊的發(fā)育，與雄蕊的發(fā)育關聯(lián)較小。

PsAGL6基因在薔薇型品種‘紫金盤’中的相對表達量最高(16.2)，與其他品種差異達到極顯著水平。而在荷花型品種‘大金粉’、皇冠型品種‘白雪塔’和繡球型品種‘王紅’中，PsAGL6的相對表達量差異不顯著。PsAGL6基因在花瓣數(shù)量較多的薔薇型品種中超表達，部分地說明PsAGL6基因可能與牡丹花瓣數(shù)量增多的變化相關。然而，花瓣數(shù)量的增加是個極其復雜的調(diào)控過程，有可能是多個基因共同控制的復雜機制，是否存在其他基因的掣肘導致在花瓣數(shù)量同樣較多的皇冠型品種和繡球型品種的低表達，需要進一步的研究。后期研究應結合花發(fā)育相關的其他基因，如SEP等，分析是否存在多個基因共同調(diào)控牡丹花器官的發(fā)育過程，通過明確基因之間的聯(lián)系才能更深入揭示AGL6基因在植物花器官分化、形成和發(fā)育中的作用機制。

參考文獻:

[1] BOWMAN J L. Evolutionary conservation of angiosperm flower development at the molecular and genetic levels[J].JournalofBiosciences, 1997,22(4): 515-527.

[2] COEN E S, MEYEROWITZ E M. The war of the whorls: genetic interactions controlling flower development[J].Nature, 1991,353(6 339): 31-37.

[3] THEISSEN G. Development of floral organ identity: stories from the MADS house[J].CurrentOpinioninPlantBiology, 2001,4(1): 75-85.

[4] ROBLES P, PELAZ S. Flower and fruit development inArabidopsisthaliana[J].InternationalJournalofDevelopmentalBiology, 2005,49(5-6): 633-643.

[5] RAINER M, WIM V, GüNTER T. The class E floral homeotic protein SEPALLATA3 is sufficient to loop DNA in ‘floral quartet’-like complexesinvitro[J].NucleicAcidsResearch, 2009,37(1): 144-157.

[6] RIJPKEMA A S, ZETHOF J,etal. The petuniaAGL6 gene has a SEPALLATA-like function in floral patterning[J].PlantJournalforCell&MolecularBiology, 2009,60(1): 1-9.

[7] BECKER A, SAEDLER H, THEISSEN G. Distinct MADS-box gene expression patterns in the reproductive cones of the gymnosperm Gnetum gnemon[J].DevelopmentGenes&Evolution, 2003,213(11): 567-572.

[9] OHMORI S, KIMIZU M, SUGITA M,etal. MOSAIC FLORAL ORGANS1, an AGL6-like MADS box gene, regulates floral organ identity and meristem fate in rice[J].PlantCell, 2009,21(10): 3 008-3 025.

[10] 位偉強, 劉 偉, 段亞賓,等. 牡丹開花調(diào)控轉錄因子基因PsFUL1的克隆與表達分析[J]. 植物生理學報，2017，53(4): 536-544.

WEI W Q, LIU W, DUAN Y B,etal. Molecular cloning and expression analysis of flowering-regulating transcription factor genePsFUL1 in tree peony (Paeoniasuffruticosa)[J].PlantPhysiologyJournal, 2017,53(4): 536-544.

[11] KAUFMANN K, MELZER R,etal. MIKC-type MADS-domain proteins: structural modularity, protein interactions and network evolution in land plants[J].Gene, 2005,347(2): 183-198.

[12] LAMB R S, IRISH V F. Functional divergence within the APETALA3/PISTILLATA floral, homeotic gene lineages[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica, 2003,100(11): 6 558-6 563.

[13] 胡月苗, 孫崇波, 向 林,等. 春蘭AGL6-3基因的克隆及實時定量表達分析[J]. 西北植物學報, 2016,36(2)：225-230.

HU Y M, SUN C B, XIANG L,etal. Cloning and real -time expression ofAGL6-3 gene fromCymbidiumgoeringii[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica，2016，36(2)：225-230.

[14] YU X, CHEN G, GUO X,etal. SilencingSlAGL6, a tomato AGAMOUS-LIKE6, lineage gene, generates fused sepal and green petal[J].PlantCellReports, 2017,36(6)：1-11.

[15] DRENI L, ZHANG D. Flower development: the evolutionary history and functions of theAGL6 subfamily MADS-box genes[J].JournalofExperimentalBotany, 2016,67(6)：1 625-1 638.

[16] MENA M, MANDEL M A, LERNER D R,etal. A characterization of the MADS-box gene family in maize[J].PlantJournal, 1995,8(6)：845-854.

[17] 秦魁杰, 李嘉玨. 牡丹芍藥品種花型分類研究[J].北京林業(yè)大學學報,1990，12(1): 18-26.

QIN K J, LI J J. Studies on the flower type classification of tree peony and peony cultivars[J].JournalofBeijingForestryUniversity, 1990，12(1): 18-26.