蔡永生，鄭 凱，王 怡，賀宏偉，曲延英，倪志勇，陳全家

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052)

棉花提供了世界上絕大部分的天然纖維，而且是一種重要的可再生資源[1]。中國(guó)是世界上棉花生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，棉花在經(jīng)濟(jì)作物種植面積中占有舉足輕重的地位，棉纖維提供紡織工業(yè)的原材料[2]。如今，隨著植物發(fā)育生物學(xué)研究的迅猛發(fā)展，許多重要的發(fā)育機(jī)制在分子水平上得到闡明，但因?yàn)槊藁ㄊ撬谋扼w，基因組龐大、生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)、遺傳關(guān)系復(fù)雜等因素，所以棉花發(fā)育生物學(xué)研究進(jìn)展較為緩慢。

植物轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，不僅成為整個(gè)生命活動(dòng)的重要控制者，而且作為功能基因組學(xué)的重要組成部分。轉(zhuǎn)錄因子又稱反式作用因子，能夠與真核基因啟動(dòng)子區(qū)域DNA序列特異結(jié)合的一類蛋白質(zhì)分子，一般具有激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄的功能，直接或間接參與代謝過(guò)程[3]。在1999年，最早發(fā)現(xiàn)的幾個(gè)TCP家族成員分別為玉米teosintebranched1(TB1)、金魚(yú)草cycloidea(CYC)和水稻PCF1、PCF2基因，TCP家族名稱由這幾個(gè)基因首字母所命名[4]。通過(guò)對(duì)這4個(gè)基因序列比較發(fā)現(xiàn)，序列中均含有一個(gè)保守區(qū)域，也就是TCP結(jié)構(gòu)域(TCP domain)。TCP結(jié)構(gòu)域是由59個(gè)氨基酸組成的高度保守的區(qū)域，可以形成一個(gè)非典型的堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)(noncanonical basic-Helix-Loop-Helix(bHLH)structure)[5]。研究表明,bHLH中的堿性區(qū)提供與DNA相作用的表面，推測(cè)蛋白可能參與核定位信號(hào)、蛋白質(zhì)的二聚化和與 DNA 結(jié)合的功能，在TCP結(jié)構(gòu)域中包含與DNA識(shí)別區(qū)域，刪除該區(qū)域則導(dǎo)致DNA結(jié)合活性喪失[6]。除了bHLH結(jié)構(gòu)外，CYC和TB1還有一個(gè)保守的富含極性氨基酸的區(qū)域，大約有18個(gè)氨基酸組成，可以形成一個(gè)親水α螺旋的R結(jié)構(gòu)區(qū)[7]。根據(jù)TCP結(jié)構(gòu)域序列的特點(diǎn),TCP家族又被分成2個(gè)亞族ClassⅠ和ClassⅡ，主要差異在于NLS序列完整性差異和R結(jié)構(gòu)區(qū)的存在與否。

在擬南芥中已基本確定具有24個(gè)TCP轉(zhuǎn)錄因子[8]。研究表明，擬南芥AtTCP1基因參與調(diào)控植物莖的生長(zhǎng)[9]。擬南芥AtTCP11基因參與擬南芥維管束發(fā)育和木質(zhì)部導(dǎo)管分子的分化和形成[10]。擬南芥AtTCP16基因?qū)υ缙诨ǚ鄣陌l(fā)育有重要作用[11]。擬南芥AtTCP20融合EAR抑制子的異位表達(dá)引起很特殊的表型，表明TCP家族基因在細(xì)胞分裂、伸長(zhǎng)和分化調(diào)控中起到重要作用[12]。

TCP家族轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與不同植物的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育之中，目前，與棉花纖維發(fā)育相關(guān)的TCP轉(zhuǎn)錄因子研究處于興起階段。海島棉纖維品質(zhì)優(yōu)良，具有優(yōu)異的基因資源，已成為棉花品質(zhì)改良、抗性遺傳及雜種優(yōu)勢(shì)利用等研究重要的資源材料[13]。然而海島棉優(yōu)異纖維形成的分子機(jī)制尚未解析，使利用優(yōu)異基因變得十分困難。新疆海島棉育種歷經(jīng)多個(gè)階段，現(xiàn)已育成37個(gè)海島棉品種，‘新海21號(hào)’目前已成為南疆海島棉主要栽培品種之一，具有結(jié)鈴性強(qiáng)，豐產(chǎn)性好，適應(yīng)性強(qiáng)，產(chǎn)量高而穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[14]。本研究將從海島棉‘新海21號(hào)’棉纖維中克隆1個(gè)TCP轉(zhuǎn)錄因子，分析該基因的氨基酸序列和表達(dá)模式并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄激活驗(yàn)證，為后期研究提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試品種‘新海21號(hào)’種植于阿克蘇地區(qū)農(nóng)一師十六團(tuán)新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院試驗(yàn)基地。以開(kāi)花當(dāng)天記作0 DPA(開(kāi)花后0 d)，依次摘取0 DPA的胚珠和5 DPA、10 DPA、15 DPA、20 DPA、25 DPA、30 DPA、35 DPA的棉花纖維，以及0 DPA時(shí)期的花瓣、花萼和花托，置于液氮中速凍，保存于-80 ℃冰箱中備用。

于2016年10月20日收獲田間種子，室內(nèi)種植‘新海21號(hào)’種子擺放在紙床發(fā)芽盒中，28 ℃暗培養(yǎng)取下胚軸，部分移栽入土中繼續(xù)生長(zhǎng)，待第一片真葉展平時(shí)，取主根、須根、莖、葉，置于液氮中速凍，保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 方 法

1.2.1植物總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成采用RNAprep Pur多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(天根試劑公司)，參照說(shuō)明書(shū)，提取開(kāi)花當(dāng)天的胚珠、花瓣、花萼、花托及根、莖、葉、下胚軸的總RNA， 以及不同時(shí)期棉纖維等的總RNA。用RNase-Free DNasee 1(天根試劑公司)去除基因組DNA污染，用Thermo Scietific(NanoDrop 1000)分光光度計(jì)檢測(cè)RNA質(zhì)量濃度和質(zhì)量，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。將RNA保存在-80 ℃冰箱中備用。

將不同時(shí)期棉纖維(0 DPA為胚珠)和不同組織的總RNA，使用First strand cDNA Synthesis試劑盒(Thermo試劑公司)反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA，反應(yīng)體系參照說(shuō)明書(shū)。反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA保存在-80 ℃冰箱備用。

1.2.2海島棉GbTCP14基因的克隆以擬南芥AtTCP14基因(AT3G47620)的核苷酸序列作為參比序列，使用本地Blast在陸地棉基因組序列中進(jìn)行比對(duì)，獲得1條屬于TCP家族基因的陸地棉全長(zhǎng)cDNA序列。根據(jù)該序列最大開(kāi)放閱讀框(open reading frame)用Oligo7軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)引物，獲得GbTCP14-F和GbTCP14-R(表1)2條引物。

用引物GbTCP14-F和GbTCP14-R，以‘新海21號(hào)’5 DPA棉纖維合成的cDNA第一鏈作為模板，用高保真Taq聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，使用紫外凝膠成像儀觀察后切下目的片段。利用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 (天根試劑公司)按說(shuō)明書(shū)步驟，純化回收PCR產(chǎn)物，連接至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞(全式金公司)。采用菌液PCR的方法鑒定出陽(yáng)性克隆，送至深圳華大基因有限公司測(cè)序。

1.2.3生物信息學(xué)分析將測(cè)序結(jié)果采用GenBank和Blast的Blast程序進(jìn)行同源性分析，采用NCBI的ORF程序在線(http://w ww.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找基因的開(kāi)放閱讀框并得到氨基酸序列。利用ProtParam(http://expas y.org/tools/protparam.html)在線計(jì)算氨基酸理化性質(zhì)。利用PredictProtein(http://www.predictprotein.org/)在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)的障礙和靈活性。利用DNAMA軟件和SMARTBLAS(https://blast.Ncbi.nl m.ni h.gov/blast/smartblast/)在線進(jìn)行氨基酸多重序列比對(duì)和一致性分析。利用ClustalX和MEGA6.0軟件比對(duì)氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4GbTCP14基因酵母轉(zhuǎn)化以克隆出的GbTCP14基因作為模板，使用Oligo 7軟件設(shè)計(jì)1對(duì)包含酶切位點(diǎn)引物pGBKT7-GbTCP14-F和pGBKT7-GbTCP14-R(表1)。擴(kuò)增GbTCP14完整的ORF編碼區(qū)，純化回收。采用推薦最佳反應(yīng)體系用NcoⅠ和EcoRⅠ兩種限制性內(nèi)切酶，雙酶切PCR產(chǎn)物和空質(zhì)粒pGBKT7(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)重點(diǎn)研究室提供)。純化回收目的片段，用T4DNA連接酶連接載體與目的片段，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12 h后挑取單克隆，提取質(zhì)粒雙酶切篩選陽(yáng)性單克隆后送測(cè)序，驗(yàn)證載體構(gòu)建的正確性。按照Frozen-EZ Yeast Transformation II 試劑盒(ZYMO RESEARCH)說(shuō)明書(shū)操作步驟，將pGBKT7-GbTCP14和pGBKT7質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109，將轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞接種色氨酸缺陷平板(SD/-Trp)，30 ℃培養(yǎng)3 d，將轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性對(duì)照、pGBKT7-GbTCP14和pGBKT7質(zhì)粒的菌液分別鋪SD/-Trp和SD/-Leu/-Trp/-His培養(yǎng)基平板，30 ℃ 培養(yǎng)3～5 d后觀察菌落的生長(zhǎng)。

1.2.5GbTCP14基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR根據(jù)已獲得的目的基因序列，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)引物GbTCP14-qF和GbTCP14-qR(表1)，以棉花的Ubiquitin7(UBQ7, GenBank 登錄號(hào)為DQ116441)基因序列設(shè)計(jì)內(nèi)參引物，引物序列為UBQ7-F和UBQ7-F(表1)。熒光定量PCR儀器為Applied Biosystems 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。將‘新海21號(hào)’不同時(shí)期的棉纖維和不同組織的cDNA用ddH2O稀釋10倍后作為模板，檢測(cè)GbTCP14基因在不同時(shí)期棉纖維和不同組織中的表達(dá)情況，用內(nèi)參基因檢測(cè)擴(kuò)增效率一致性。RT-PCR擴(kuò)增體系參照說(shuō)明書(shū)。試驗(yàn)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，采用2-ΔCt法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)分析采用Excel和DPS 10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和作圖。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 海島棉GbTCP14基因的克隆與生物信息學(xué)分析

測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行同源性分析表明，所得的片段(圖1)為GbTCP14，該基因編碼區(qū)序列長(zhǎng)1 221 bp。利用Prot Param分析得出(圖2)，表明該基因可編碼一個(gè)由406個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子式C1892H2950N572O620S16，預(yù)測(cè)分子量為44.134 6 kD，等電點(diǎn)為6.88，脂肪系數(shù)55.49，總平均親水性是-0.708，不穩(wěn)定系數(shù)56.58。利用SMART軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的保守功能域(http://smart.embl-heidelberg.de/)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果(圖2)發(fā)現(xiàn)，GbTCP14蛋白序列不包含非常保守的R-domain，但位于第89位到261位氨基酸之間有一個(gè)TCP家族特有保守結(jié)構(gòu)域，且結(jié)構(gòu)域符合ClassⅠ型TCP家族基因所特有。推測(cè)該基因?qū)儆诿藁═CP轉(zhuǎn)錄因子中ClassⅠ類轉(zhuǎn)錄因子，蛋白親水性差，脂溶性強(qiáng)，為不穩(wěn)定蛋白。

利用PredictProtein(http://www.predictprotein.org/)在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3。圖3的上方所表示為氨基酸序列，下方所表示為其所對(duì)應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中e代表延伸鏈(extended strand)，t代表β-轉(zhuǎn)角(beta turn)，c代表無(wú)規(guī)則卷曲(random coil)，h代表α-螺旋(alpha helix)。分析結(jié)果為，GbTCP14蛋白由406個(gè)氨基酸組成，其中59個(gè)氨基酸可能成型α-螺旋，主要位于第139位至146位氨基酸、第215位至264位氨基酸以及第359位至364位氨基酸之間。33個(gè)氨基酸可能形成β-折疊和78個(gè)氨基酸可能形成延伸鏈，分別散布在整個(gè)蛋白質(zhì)之中。236個(gè)氨基酸可能無(wú)規(guī)則卷曲，作為蛋白質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)大量存在于蛋白質(zhì)中。GbTCP14蛋白的α-螺旋主要是TCP保守結(jié)構(gòu)域形成，無(wú)規(guī)則卷曲分散于整個(gè)蛋白中，共同形成一個(gè)非典型的堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)，與bHLH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)相符合，推測(cè)可能是TCP的大量結(jié)構(gòu)元件，以bHLH結(jié)構(gòu)類似的方式與DNA結(jié)合參與植物的DNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程。

M. Marker; 1. GbTCP14圖1 棉花GbTCP14 基因PCR產(chǎn)物電泳分析Fig.1 Electrophoresis of PCR product of cotton GbTCP14 genes

A. GbTCP14蛋白的氨基酸序列；B. 蛋白結(jié)構(gòu)示意圖，方框部分代表TCP結(jié)構(gòu)域圖2 GbTCP14蛋白的氨基酸序列以及蛋白結(jié)構(gòu)示意圖A. Amino acid sequence of GbTCP14； B. Schematic diagram of GbTCP14, Box part represents TCP domain structureFig.2 GbTCP14 protein amino acid sequence and protein structure diagram

e.延伸鏈;c.無(wú)規(guī)則卷曲;t.β-轉(zhuǎn)角; h.α-螺旋圖3 GbTCP14蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)e.Extended strand;c.Random coil;t.Beta turn;h.Alpha helixFig.3 Secondary structure prediction of GbTCP14 protein

GaTCP14.亞洲棉(XP_017636574.1)；GhTCP14.陸地棉(XP_016736368.1)；GrTCP14.雷蒙德氏棉(XP_012438750.1)；AtTCP14.擬南芥(NP_190346.2)；NtTCP14.煙草(XP_016472329.1)；OsTCP14.水稻(XP_015624016.1)；ZmTCP14.玉米(XP_008646257.1)；GmTCP14.大豆(XP_003549670.1)；TcTCP14.可可(XP_007037311.2)；CarTCP14.鷹嘴豆(XP_007037311.2)；GbTCP14.海島棉圖4 GbTCP14與其他TCP14氨基酸序列比對(duì)分析GaTCP14. Gossypium arboreum(XP_017636574.1)；GhTCP14. Gossypium hirsutum(XP_016736368.1)；GrTCP14. Gossypium raimondii(XP_012438750.1)；AtTCP14. Arabidopsis thaliana(NP_190346.2)；NtTCP14.Nicotiana tabacum(XP_016472329.1)；OsTCP14. Oryza sativa Japonica Group(XP_015624016.1)；ZmTCP14. Zea mays(XP_008646257.1)；GmTCP14. Glycine max(XP_003549670.1)；TcTCP14. Theobroma cacao(XP_007037311.2)；CarTCP14. Cicer arietinum(XP_007037311.2)；GbTCP14. Gossypium barbadenseFig.4 Comparison of GbTCP14 with other TCP14 amino acid sequences

借助DNAMAN軟件將海島棉GbTCP14與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的木本棉(Gossypiumarboreum)、陸地棉(Gossypiumhirsutum)、雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、煙草(Nicotianatabacum)、水稻(OryzasativaJaponica Group)、玉米(Zeamays)、大豆(Glycinemax)、可可(Theobromacacao)、鷹嘴豆(Cicerarietinum) TCP14蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比較，結(jié)果(圖4)表明，與海島棉GbTCP14相似程度最高的是木本棉(98.28%)，其次為雷蒙德氏棉(95.32%)、陸地棉(95.57%)、可可(84.88%)、煙草(63.01%)、大豆(59.27%)、鷹嘴豆(60.09%)，較低的為擬南芥(38.65%)、玉米(42.19%)、水稻(40.97%)。表明這些TCP蛋白的氨基酸序列中都包含1個(gè)高度保守的TCP domain，其他區(qū)域的相似性較低。

2.2 海島棉GbTCP14系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA 6.0軟件對(duì)上述物種的TCP氨基酸進(jìn)行同源性比較并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖5)表明，GaTCP14和GhTCP14聚集在同一分支上，表明在生物進(jìn)化過(guò)程中，GbTCP14基因與木本棉的同類基因親緣關(guān)系較近。

2.3 GbTCP14轉(zhuǎn)錄激活活性分析

將pGBKT7-GbTCP14 和pGBKT7轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109后，涂布單缺SD/-Trp 營(yíng)養(yǎng)型缺陷培養(yǎng)基，以pGBKT7-GbTCP5作為陽(yáng)性對(duì)照，pGBKT7作為陰性對(duì)照，觀察酵母菌落的生長(zhǎng)情況。圖6顯示，轉(zhuǎn)化pGBKT7-GbTCP5、GbTCP14-pGBKT7 和pGBKT7的酵母菌落都能正常生長(zhǎng)，說(shuō)明上述3個(gè)質(zhì)粒均已轉(zhuǎn)化到酵母中。而在含有X-gal的三缺SD/-Trp/-His/-Ade 營(yíng)養(yǎng)型缺陷培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)化GbTCP14-pGBKT7的酵母菌落和陰性對(duì)照pGBKT7的酵母菌落均不能正常生長(zhǎng)，陽(yáng)性對(duì)照酵母正常生長(zhǎng)，菌落呈現(xiàn)藍(lán)色。說(shuō)明GbTCP14轉(zhuǎn)錄因子不具有轉(zhuǎn)錄激活活性，推測(cè)GbTCP14可能是一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制子。

2.4 GbTCP14表達(dá)模式分析

為了進(jìn)一步分析GbTCP14基因在棉花不同纖維時(shí)期的表達(dá)模式，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析GbTCP14基因表達(dá)情況。由圖7，A可知，GbTCP14基因在開(kāi)花后棉纖維發(fā)育中均有表達(dá)。其中第15天時(shí)相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高，其次相對(duì)表達(dá)量由高到低分別為第10、5、20天以及開(kāi)花當(dāng)天，而在開(kāi)花后第25天后相對(duì)表達(dá)量較低。圖7，B顯示，GbTCP14基因在棉花組織中均具有表達(dá)量，但不同棉花組織間相對(duì)表達(dá)量差異明顯，在花瓣和花萼中相對(duì)表達(dá)量比其他組織高，其次相對(duì)表達(dá)量高低分別為莖、主根、須根、下胚軸、花托和葉。其中在花瓣中表達(dá)量最高，葉中表達(dá)量最低。一般認(rèn)為棉花開(kāi)花后大約第5～20天為棉纖維伸長(zhǎng)分化的關(guān)鍵時(shí)期，在棉纖維代謝最旺盛時(shí)期GbTCP14基因較高表達(dá)，暗示該基因可能參與調(diào)控控制棉纖維生長(zhǎng)發(fā)育的重要階段。在棉花的花器官中高表達(dá)，可能參與花的生長(zhǎng)分化過(guò)程。

圖5 GbTCP14蛋白與其他植物相關(guān)蛋白序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic analysis of GbTCP14 protein with other related proteins in different plants

圖6 GbTCP14轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活實(shí)驗(yàn)Fig.6 Transcriptional activation ability assay of the GbTCP14 transcription factor

3 討 論

棉花纖維是棉花種子的種皮毛，是由胚珠外珠被上的表皮細(xì)胞發(fā)育而成的單細(xì)胞毛狀體。生長(zhǎng)發(fā)育和持續(xù)的時(shí)間受棉花的基因型和環(huán)境控制而呈現(xiàn)不一致。自1992年第一個(gè)纖維特異表達(dá)基因E6基因克隆以來(lái)，至今已經(jīng)獲得了大批棉花纖維發(fā)育相關(guān)的基因和表達(dá)序列標(biāo)簽[15]。然而這些基因在棉纖維中的功能還有待于進(jìn)一步研究，絕大部分基因在纖維細(xì)胞中所起的功能尚不明確，至今纖維細(xì)胞的發(fā)育科學(xué)界仍然沒(méi)有很好地揭示控制棉纖維細(xì)胞伸長(zhǎng)的真正機(jī)制。

圖7 GbTCP14基因在不同時(shí)期棉纖維和不同組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.7 The relative expression of GbTCP14 genes in different periods of cotton fiber and different tissues

棉花纖維細(xì)胞的分化與發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜有序的過(guò)程,分化發(fā)育過(guò)程分為4個(gè)階段，即纖維原細(xì)胞分化突起、纖維伸長(zhǎng)、次生壁增厚和脫水成熟，各個(gè)時(shí)期具有不同特點(diǎn)但又相互重疊[16]。從轉(zhuǎn)錄水平分析，TCP家族轉(zhuǎn)錄因子在棉花中表達(dá)模式不同。葛宗鶴研究組從海島棉纖維的cDNA文庫(kù)中分離出編碼344個(gè)氨基酸的I類TCP轉(zhuǎn)錄因子(指定為GbTCP)，GbTCP優(yōu)勢(shì)在開(kāi)花后5～15 d在延長(zhǎng)的棉纖維中表達(dá)[17]。海島棉GbTCP15基因在棉花的莖部和第15天纖維中表達(dá)量較高[18]。GhTCP14主要在棉纖維細(xì)胞中表達(dá)，特別是在纖維細(xì)胞的起始和延長(zhǎng)期[19]。GbTCP14基因在棉花發(fā)育過(guò)程中表達(dá)模式與現(xiàn)有研究比較具有異同點(diǎn)，在棉纖維發(fā)育中表達(dá)時(shí)間更長(zhǎng)，組織中表達(dá)部位更多。棉纖維發(fā)育前三階段作為生長(zhǎng)分化的關(guān)鍵時(shí)期，發(fā)育的狀況直接關(guān)系到棉纖維成熟后，棉纖維的產(chǎn)量與品質(zhì)，暗示可能在棉纖維生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起到一定的作用。TCP基因中CYC類主要控制花的對(duì)稱性，與花青素的合成有關(guān)，屬于TCP家族轉(zhuǎn)錄因子中ClassⅡ類。GbTCP14基因在棉花的花器官中具有顯著的相對(duì)表達(dá)量。已有研究證明TCP基因之間具有相互催化或抑制的作用，在參與花的發(fā)育中，該基因是直接調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄還是與其他蛋白互作間接參與代謝活動(dòng)，有待于進(jìn)一步研究蛋白的生物學(xué)性質(zhì)，初步推測(cè)可能參與棉花花的分化與形成。

基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是復(fù)雜的過(guò)程，轉(zhuǎn)錄因子作為植物中重要的調(diào)控因子，以不同方式參與調(diào)控植物表皮毛、根毛和生殖器官的發(fā)育以及光形態(tài)建成，調(diào)節(jié)次生代謝物等。本研究從‘新海21號(hào)’克隆出的TCP家族轉(zhuǎn)錄因子基因即GbTCP14，屬于TCP轉(zhuǎn)錄因子家族的ClassⅠ類。一般認(rèn)為該類具有促進(jìn)植物的生長(zhǎng)和分芽生殖。在最早發(fā)現(xiàn)的4個(gè)基因中，水稻PCF1和PCF2基因?qū)儆贑lassⅠ類能夠促進(jìn)分生組織中PCNA基因的啟動(dòng)子組織特異性表達(dá)，主要使細(xì)胞核蛋白基因的啟動(dòng)子在G1期到S期被激活[20]。在擬南芥中，AtTCP14基因能促進(jìn)細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)的有絲分裂因子CyclinB1的轉(zhuǎn)錄活性，調(diào)節(jié)擬南芥花和葉對(duì)細(xì)胞分裂素的敏感程度[21]。在棉花中，夏桂先研究組從陸地棉中克隆了1個(gè)GhTCP14轉(zhuǎn)錄因子，在纖維早期發(fā)育階段生長(zhǎng)素上調(diào)GhTCP14的表達(dá)，在擬南芥中異源表達(dá)GhTCP14影響擬南芥生長(zhǎng)素水平和分配，從而影響根和表皮的細(xì)胞的起始和伸長(zhǎng)[19]。關(guān)于GbTCP14基因編碼的蛋白生物學(xué)功能。酵母系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄激活分析表明，該基因不具有自身轉(zhuǎn)錄激活活性，推測(cè)可能是一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制子或與其他蛋白互作時(shí)才具有轉(zhuǎn)錄激活活性。GbTCP14是否與同類家族基因具有類似或新功能還有待于進(jìn)一步探究。

參考文獻(xiàn):

[1] 張 杰, 王 力, 趙新民. 我國(guó)棉花產(chǎn)業(yè)的困境與出路[J]. 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)問(wèn)題, 2014,35(9): 28-34.

ZHANG J, WANG L, ZHAO X M. The predicament and the way out of China’s cotton industry[J].IssuseinAgriculturalEconomy, 2014,35(9): 28-34.

[2] 喻樹(shù)迅. 我國(guó)棉花生產(chǎn)現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)[J]. 中國(guó)工程科學(xué), 2013,15(4): 9-13.

YU S X. Present situation and development trend of cotton production in China[J].EngineeringScience, 2013,15(4): 9-13.

[3] LEMON B, TJIAN R. Orchestrated response: a symphony of transcription factors for gene control[J].Genes&Development, 2000,14(20): 2 551.

[4] LUO D, CARPENTER R, VINCENT C,etal. Origin of floral asymmetry in Antirrhinum[J].Nature, 1996,383(6 603): 794-799.

[5] PILAR CUBAS ?, LAUTER N, DOEBLEY J,etal. The TCP domain: a motif found in proteins regulating plant growth and development[J].PlantJournal, 1999,18(2): 215-222.

[6] AGGARWAL P, GUPTA M D, JOSEPH A P,etal. Identification of specific DNA binding residues in the TCP family of transcription factors in Arabidopsis[J].PlantCell, 2010,22(4): 1 174.

[7] KOYAMA T, FURUTANI M, TASAKA M,etal. TCP transcription factors control the morphology of shoot lateral organs via negative regulation of the expression of boundary-specific genes inArabidopsis[J].PlantCell, 2007,19(2): 473.

[8] GIRAUD E, NG S, CARRIE C,etal. TCP transcription factors link the regulation of genes encoding mitochondrial proteins with the circadian clock inArabidopsisthaliana[J].PlantCell, 2010,22(12):3 921.

[9] HELLENS R P, EDWARDS E A, LEYLAND N R,etal. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation[J].PlantMolecularBiology, 2000,42(6): 819-832.

[10] 安家興. 擬南芥TCP11調(diào)控維管束的發(fā)育[D]. 蘭州：蘭州大學(xué), 2012.

[11] TAKEDA T, AMANO K, OHTO M A,etal. RNA interference of theArabidopsisputative transcription factorTCP16 gene results in abortion of early pollen development[J].PlantMolecularBiology, 2006,61(1-2): 165-177.

[12] HERVé C, DABOS P, BARDET C,etal. In vivo interference withAtTCP20 function induces severe plant growth alterations and deregulates the expression of many genes important for development[J].PlantPhysiology, 2009,149(3): 1 462.

[13] 朱東生, 張 昊, 陳新虎. 德佳特優(yōu)級(jí)長(zhǎng)絨棉品系的性狀與競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)分析[J]. 棉花科學(xué), 2015, (3): 22-26.

ZHU D S, ZHANG H, CHEN X H. Analysis on the characters and competitive advantage of the long staple cotton lines of dejiat excellent grade[J].CottonScience, 2015, (3): 22-26.

[14] 李爾文, 邰紅忠, 周永蓮,等. 早熟、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)長(zhǎng)絨棉新品種新海21號(hào)[J]. 中國(guó)棉花, 2004,31(1): 31-31.

LI E W,SHAO H Z,ZHOU Y L,etal. Early maturity, high yield, high quality cotton new variety Xinhai 21[J].CottonChina, 2004,31(1): 31-31.

[15] JOHN M E, CROW L J. Gene Expression in Cotton (GossypiumhirsutumL.) Fiber: Cloning of the mRNAs[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica, 1992,89(13): 5 769-5 773.

[16] QIN Y M, ZHU Y X. How cotton fibers elongate: a tale of linear cell-growth mode[J].CurrentOpinioninPlantBiology, 2011,14(1): 106.

[17] 葛宗鶴. 棉花纖維伸長(zhǎng)相關(guān)基因GbTCP的功能驗(yàn)證[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2016.

[18] 鄭 凱, 倪志勇, 曲延英,等. 海島棉GbTCP15基因的克隆與表達(dá)分析[J]. 西北植物學(xué)報(bào), 2016,36(10): 1 925-1 932.

ZHENG K, NI Z Y, QU Y Y,etal. Cloning and expression analysis ofGbTCP15 gene in island cotton[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica, 2016,36(10): 1 925-1 932.

[19] WANG M Y, XIA G X. The cotton transcription factorTCP14 functions in auxin-mediated epidermal cell differentiation and elongation[J].PlantPhysiology, 2013,162(3): 1 669-1 680.

[20] KOSUGI S, OHASHI Y.PCF1 andPCF2 specifically bind to cis elements in the rice proliferating cell nuclear antigen gene[J].PlantCell, 1997,9(9): 1 607.

[21] STEINER E, WEISS D. TheArabidopsisO-linked N-acetylglucosamine transferase SPINDLY interacts with class I TCPs to facilitate cytokinin responses in leaves and flowers[J].PlantCell, 2012,24(1): 96-108.