田 凱，王曉英

（1.唐山市豐潤(rùn)區(qū)行政審批局，河北 唐山 064000；2.唐山師范學(xué)院，河北 唐山 063000）

化感作用是指一種植物（包括微生物）通過(guò)向環(huán)境釋放化學(xué)物質(zhì)而對(duì)另一種植物（包括微生物）所產(chǎn)生的直接或間接的有利或有害作用[1]。植物主要是通過(guò)莖葉揮發(fā)、雨霧淋溶、根系分泌以及植物殘株的腐解等途徑向環(huán)境中釋放化感物質(zhì)，影響周圍植物的生長(zhǎng)和發(fā)育。

油松為常綠喬木，四季常青，抗寒性強(qiáng)，是我國(guó)北方城鄉(xiāng)綠地建設(shè)中廣泛應(yīng)用的常綠樹(shù)種。由于植物的化感作用，在園林綠化中，特別是我國(guó)北方寒冷地區(qū)，油松林下幾乎為裸地，景觀單一，生態(tài)功能較差[2]。前期研究結(jié)果表明油松鮮葉、落葉水提液、落葉腐解液對(duì)高羊茅均有化感作用[3]，但對(duì)油松鮮葉水提液、落葉水提液、落葉腐解液中化感物質(zhì)的鑒定尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)采用氣相色譜－質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)分析油松鮮葉、落葉水提液、落葉腐解液化學(xué)組分，探討可能起作用的化感物質(zhì)種類和含量，以期為進(jìn)一步研究油松的化感作用及其應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

油松鮮葉和落葉采集：2016年4月采取16 a生油松的2 a生葉及樹(shù)冠下的凋落葉。

將油松鮮葉和落葉分別置于烘干箱內(nèi)105 ℃下殺青30 min，70 ℃烘干至恒重，剪成段后放在粉碎機(jī)中粉碎備用。

土：收集園土，挑去其中的雜草、石塊等自然風(fēng)干，過(guò)0.25 mm篩備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 油松鮮葉和落葉水提液的制備 取烘干后的油松鮮葉和落葉粉末各120 g，分別加1 200 mL蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颍o置48 h，用八層紗布過(guò)濾2次后在4 000 r·min-1離心機(jī)中離心10 min，取上清液用普通濾紙抽濾2次，再用0.45 μm微孔濾膜抽濾4次，得到質(zhì)量濃度為0.100 g·mL-1的母液，在4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 油松落葉腐解液的制備 取烘干后的油松落葉粉末120 g，與600 g土壤混勻，加少許水，塑料薄膜封口（扎眼通氣），置于人工氣候箱內(nèi)25 ℃恒溫避光保存40 d，取出各腐解物烘干至恒重，加入蒸餾水1 200 mL攪拌均勻，靜置48 h。用八層紗布過(guò)濾2次后在4 000 r·min-1離心機(jī)中離心10 min，取上清液用普通濾紙抽濾2次，再用0.45 μm微孔濾膜抽濾4次，得到質(zhì)量濃度為0.100 g·mL-1的母液，在4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 油松鮮葉水提液、落葉水提液、落葉腐解液成分分析 分別取5 mL水提液、腐解液母液加入2 mL乙酸乙酯萃取，吸取1μL萃取液進(jìn)樣，用Shimadzu GCMS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行GC-MS分析。

GC（TraceTM2000，CE Instrument Company）條件：色譜柱：rxi-5ms；石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：初始溫度50 ℃，以15 ℃·min-1的速度升至180 ℃，保持15 min，再以10 ℃·min-1升到220 ℃，保持15 min；載氣：He（99.99%），柱流速度為0.8 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度250 ℃。

MS（Voyager，F(xiàn)innigan Thermo-QuestCompany）條件：電離方式：EI；電子能量70 eV；離子源溫度200 ℃；傳輸線溫度250 ℃；掃描質(zhì)量范圍39～450 amu。采用Xcalibur1.2版本軟件、NIST08.LIB和NIST08S.LIB譜圖庫(kù)兼顧色譜保留時(shí)間定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 油松鮮葉水提液成分分析

油松鮮葉水提液樣品經(jīng)乙酸乙酯萃取后進(jìn)行GC-MS分析（圖1），經(jīng) GC-MS聯(lián)用儀標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù) NIST08.LIB 和NIST08S.LIB的計(jì)算機(jī)檢索，鑒定出其主要含有29種化合物，并采用面積歸一化法確定了它們的相對(duì)百分含量（表1）。油松鮮葉水提液的主要成分是4-萜品醇（7.74%）、杜鵑醇（7.32%）、2,3-二氫苯并呋喃（6.72%），覆盆子酮（6.57%），4-((1E)-3-羥基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚（6.28%），4-羥基-3-甲基苯乙酮（4.84%），2,2,4,6,6-五甲基庚烷（4.27%）等，其中萜類（13.76%），酚類（11.92%），酮類（11.41%），有機(jī)酸及其衍生物（11.09%），雜環(huán)（9.53%），烷烴（5.88%），芳香烴及其衍生物（4.23%），胺（2.52%），酯（2.18%），環(huán)烴及其衍生物（1.62%），酰胺（1.44%）。

圖1 油松鮮葉水提液總離子流色譜圖

表1 油松鮮葉水提液成分分析

2.2 油松落葉水提液成分分析

油松落葉水提液樣品經(jīng)乙酸乙酯萃取后進(jìn)行GC-MS分析（圖2），經(jīng) GC-MS聯(lián)用儀標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù). NIST08.LIB 和NIST08S.LIB的計(jì)算機(jī)檢索，鑒定出其主要含有30個(gè)化合物，并采用面積歸一化法確定了它們的相對(duì)百分含量（表2）。油松落葉水提液的主要成分為苯甲酸（18.67%），芐醇（12.61%），苯丙醇（7.02%），鄰苯二酚（3.41%），其中有機(jī)酸（20.62%），芳香烴及其衍生物（15.95%），醇類（11.94%），雜環(huán)化合物（7.95%），酮類（7.69%），酚類（5.04%），烷烴（2.83%），酯類（1.04%）。

表2 油松落葉水提液成分分析

圖2 油松落葉水浸體液總離子流色譜圖

2.3 油松落葉腐解液的成分分析

油松落葉腐解物水提液樣品經(jīng)乙酸乙酯萃取后進(jìn)行GC-MS分析（圖3），經(jīng) GC-MS聯(lián)用儀標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù) NIST08.LIB 和NIST08S.LIB的計(jì)算機(jī)檢索，鑒定出其主要含有31個(gè)化合物，并采用面積歸一化法確定了它們的相對(duì)百分含量（表3）。油松落葉腐解物水提液的主要成分有異龍腦（9.67%），環(huán)己酮（9.42%），苯丙醇（4.84%），雙環(huán)[2.2.1]庚烷-2-酮（4.44%），桉油烯醇（4.39%），2-氧雜二環(huán)[2.2.2]辛-6-醇（4.17%），氧化石竹烯（2.58%），其中醇類（30.1%），酮（18.45%），雜環(huán)化合物（6.96%），芳香烴衍生物（4.84%），醛（2.18%），萜類（1.71%）。

表3 油松落葉腐解物水提液成分分析

續(xù)表3

圖3 油松落葉腐解液總離子流色譜圖

3 結(jié)論與討論

GC-MS法是檢測(cè)物質(zhì)化學(xué)成分的主要方法。近年來(lái)，在化感物質(zhì)的鑒定方面大量運(yùn)用該方法。程智慧等[4]采用GC-MS方法分析了百合根系分泌物中的主要物質(zhì)，楊先國(guó)等[5]對(duì)丹參根系分泌物的組成分分進(jìn)行了分析。本試驗(yàn)采用乙酸乙酯萃取、GC-MS法測(cè)定，從油松鮮葉水提液、落葉水提液以及落葉腐解物水提液中共鑒定出75種化學(xué)物質(zhì)。油松葉從鮮葉、落葉、落葉腐解物的變化過(guò)程中體內(nèi)化合物種類及含量都發(fā)生了變化。

油松鮮葉水提液和落葉水提液共有苯乙醇和覆盆子酮2種物質(zhì)，說(shuō)明油松新鮮葉和落葉的物質(zhì)成分差異大。酚類和萜類是常見(jiàn)的化感物質(zhì)，油松鮮葉水提液中萜類含量占13.76%、酚類含量占11.92%，其中鄰苯二酚[6]、2,4-二叔丁基苯酚[7]等均已被證實(shí)為化感物質(zhì)；油松鮮葉水提液中4-萜品醇、芳樟醇、α-松油醇、α-畢橙茄醇等萜類物質(zhì)也是潛在的化感物質(zhì)，具有較強(qiáng)的化感活性，往往在較低濃度時(shí)就表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑制作用[8]。油松落葉水提液酚類、萜類物質(zhì)含量較鮮葉有較大幅度降低，油松葉在枯落前將部分化感物質(zhì)轉(zhuǎn)移到植株其它生活部位，導(dǎo)致落葉化感物質(zhì)含量及種類減少；這就從化感物質(zhì)種類及含量角度解釋了油松鮮葉水提液的化感作用大于落葉水提液[3]。

油松落葉水提液和落葉腐解物水提液共有化學(xué)物質(zhì)7種，分別為苯乙醇、6,6-二甲基二環(huán)[3.1.1]庚-2-烯-2-甲醇、3-（4-羥甲基）-2-甲基環(huán)己酮、雙環(huán)[2.2.1]庚烷-2-酮、環(huán)己醇、覆盆子酮、苯丙醇，各自獨(dú)有的物質(zhì)種類分別有23種和24種，說(shuō)明落葉腐解后物質(zhì)成分發(fā)生了較大變化。油松落葉水提液的主要成分有酚類（5.04%），有機(jī)酸（20.62%），醇類（11.94%），芳香烴及其衍生物（15.95%），雜環(huán)化合物（7.95%），酮類（7.69%），酯類（1.04%）。油松落葉腐解后，酚類物質(zhì)未見(jiàn)，醇類、酮類含量增加，達(dá)30.10%和18.45%，出現(xiàn)萜類物質(zhì)，但含量較低，從化感物質(zhì)的種類和含量方面解釋了油松落葉腐解后化感作用較落葉水提液減弱[3]。

化感物質(zhì)成分的鑒定是化感作用研究的重要內(nèi)容，也是解釋化感作用現(xiàn)象的有力依據(jù)。本試驗(yàn)僅從油松葉不同生命形態(tài)角度分析化感物質(zhì)，從物質(zhì)大類上分析化感作用強(qiáng)弱，未能確定化感物質(zhì)的具體種類與含量，應(yīng)采用柱層析法和GC-MS相結(jié)合的方法[9]，應(yīng)用柱層析法篩選出最佳流分，并對(duì)其進(jìn)行GC-MS鑒定，進(jìn)一步研究化感作用的物質(zhì)種類。

[1]張琴，李艷賓，岳靜，等.不同腐解方式下棉桿腐解液對(duì)棉花種子萌發(fā)的化感效應(yīng)[J].種子，2014，4（30）：17-20.

[2]鄭義，路雪梅，崔欣，等.油松浸提液對(duì)植物種子發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)的影響[J].北京農(nóng)業(yè)，2015，11月中旬刊：82.

[3]王曉英.油松葉水提液對(duì)高羊茅的化感效應(yīng)研究[J].草原與草坪，2016，32（6）：14-20.

[4]程智慧，徐鵬.百合根系分泌物的GC-MS鑒定[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，40（9）：202-208.

[5]楊先國(guó)，劉塔斯，陳斌，等.丹參根際土壤浸提物的GC-MS分析[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，29（10）：173-177.

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[8] 張秋菊，朱詩(shī)禹，張連學(xué).細(xì)辛根系浸提液和腐解液對(duì)小麥和黃瓜的化感效應(yīng)[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，40（3）：272.

[9]陳磊，云興福.西芹鮮根及根際區(qū)物化感物質(zhì)成分鑒定[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2012，27（2）：157-164.