田 凱，王曉英

（1.唐山市豐潤(rùn)區(qū)行政審批局，河北 唐山 064000；2.唐山師范學(xué)院，河北 唐山 063000）

化感作用是指一種植物（包括微生物）通過(guò)向環(huán)境釋放化學(xué)物質(zhì)而對(duì)另一種植物（包括微生物）所產(chǎn)生的直接或間接的有利或有害作用[1]。植物主要是通過(guò)莖葉揮發(fā)、雨霧淋溶、根系分泌以及植物殘株的腐解等途徑向環(huán)境中釋放化感物質(zhì)，影響周?chē)参锏纳L(zhǎng)和發(fā)育。

油松為常綠喬木，四季常青，抗寒性強(qiáng)，是我國(guó)北方城鄉(xiāng)綠地建設(shè)中廣泛應(yīng)用的常綠樹(shù)種。由于植物的化感作用，在園林綠化中，特別是我國(guó)北方寒冷地區(qū)，油松林下幾乎為裸地，景觀單一，生態(tài)功能較差[2]。前期研究結(jié)果表明油松鮮葉、落葉水提液、落葉腐解液對(duì)高羊茅均有化感作用[3]，但對(duì)油松鮮葉水提液、落葉水提液、落葉腐解液中化感物質(zhì)的鑒定尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)采用氣相色譜－質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)分析油松鮮葉、落葉水提液、落葉腐解液化學(xué)組分，探討可能起作用的化感物質(zhì)種類(lèi)和含量，以期為進(jìn)一步研究油松的化感作用及其應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

油松鮮葉和落葉采集：2016年4月采取16 a生油松的2 a生葉及樹(shù)冠下的凋落葉。

將油松鮮葉和落葉分別置于烘干箱內(nèi)105 ℃下殺青30 min，70 ℃烘干至恒重，剪成段后放在粉碎機(jī)中粉碎備用。

土：收集園土，挑去其中的雜草、石塊等自然風(fēng)干，過(guò)0.25 mm篩備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 油松鮮葉和落葉水提液的制備 取烘干后的油松鮮葉和落葉粉末各120 g，分別加1 200 mL蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?，靜置48 h，用八層紗布過(guò)濾2次后在4 000 r·min-1離心機(jī)中離心10 min，取上清液用普通濾紙抽濾2次，再用0.45 μm微孔濾膜抽濾4次，得到質(zhì)量濃度為0.100 g·mL-1的母液，在4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 油松落葉腐解液的制備 取烘干后的油松落葉粉末120 g，與600 g土壤混勻，加少許水，塑料薄膜封口（扎眼通氣），置于人工氣候箱內(nèi)25 ℃恒溫避光保存40 d，取出各腐解物烘干至恒重，加入蒸餾水1 200 mL攪拌均勻，靜置48 h。用八層紗布過(guò)濾2次后在4 000 r·min-1離心機(jī)中離心10 min，取上清液用普通濾紙抽濾2次，再用0.45 μm微孔濾膜抽濾4次，得到質(zhì)量濃度為0.100 g·mL-1的母液，在4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 油松鮮葉水提液、落葉水提液、落葉腐解液成分分析 分別取5 mL水提液、腐解液母液加入2 mL乙酸乙酯萃取，吸取1μL萃取液進(jìn)樣，用Shimadzu GCMS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行GC-MS分析。

GC（TraceTM2000，CE Instrument Company）條件：色譜柱：rxi-5ms；石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升溫程序：初始溫度50 ℃，以15 ℃·min-1的速度升至180 ℃，保持15 min，再以10 ℃·min-1升到220 ℃，保持15 min；載氣：He（99.99%），柱流速度為0.8 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度250 ℃。

MS（Voyager，F(xiàn)innigan Thermo-QuestCompany）條件：電離方式：EI；電子能量70 eV；離子源溫度200 ℃；傳輸線溫度250 ℃；掃描質(zhì)量范圍39～450 amu。采用Xcalibur1.2版本軟件、NIST08.LIB和NIST08S.LIB譜圖庫(kù)兼顧色譜保留時(shí)間定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 油松鮮葉水提液成分分析

油松鮮葉水提液樣品經(jīng)乙酸乙酯萃取后進(jìn)行GC-MS分析（圖1），經(jīng) GC-MS聯(lián)用儀標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù) NIST08.LIB 和NIST08S.LIB的計(jì)算機(jī)檢索，鑒定出其主要含有29種化合物，并采用面積歸一化法確定了它們的相對(duì)百分含量（表1）。油松鮮葉水提液的主要成分是4-萜品醇（7.74%）、杜鵑醇（7.32%）、2,3-二氫苯并呋喃（6.72%），覆盆子酮（6.57%），4-((1E)-3-羥基-1-丙烯基)-2-甲氧基苯酚（6.28%），4-羥基-3-甲基苯乙酮（4.84%），2,2,4,6,6-五甲基庚烷（4.27%）等，其中萜類(lèi)（13.76%），酚類(lèi)（11.92%），酮類(lèi)（11.41%），有機(jī)酸及其衍生物（11.09%），雜環(huán)（9.53%），烷烴（5.88%），芳香烴及其衍生物（4.23%），胺（2.52%），酯（2.18%），環(huán)烴及其衍生物（1.62%），酰胺（1.44%）。

圖1 油松鮮葉水提液總離子流色譜圖

表1 油松鮮葉水提液成分分析

2.2 油松落葉水提液成分分析

油松落葉水提液樣品經(jīng)乙酸乙酯萃取后進(jìn)行GC-MS分析（圖2），經(jīng) GC-MS聯(lián)用儀標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù). NIST08.LIB 和NIST08S.LIB的計(jì)算機(jī)檢索，鑒定出其主要含有30個(gè)化合物，并采用面積歸一化法確定了它們的相對(duì)百分含量（表2）。油松落葉水提液的主要成分為苯甲酸（18.67%），芐醇（12.61%），苯丙醇（7.02%），鄰苯二酚（3.41%），其中有機(jī)酸（20.62%），芳香烴及其衍生物（15.95%），醇類(lèi)（11.94%），雜環(huán)化合物（7.95%），酮類(lèi)（7.69%），酚類(lèi)（5.04%），烷烴（2.83%），酯類(lèi)（1.04%）。

表2 油松落葉水提液成分分析

圖2 油松落葉水浸體液總離子流色譜圖

2.3 油松落葉腐解液的成分分析

油松落葉腐解物水提液樣品經(jīng)乙酸乙酯萃取后進(jìn)行GC-MS分析（圖3），經(jīng) GC-MS聯(lián)用儀標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù) NIST08.LIB 和NIST08S.LIB的計(jì)算機(jī)檢索，鑒定出其主要含有31個(gè)化合物，并采用面積歸一化法確定了它們的相對(duì)百分含量（表3）。油松落葉腐解物水提液的主要成分有異龍腦（9.67%），環(huán)己酮（9.42%），苯丙醇（4.84%），雙環(huán)[2.2.1]庚烷-2-酮（4.44%），桉油烯醇（4.39%），2-氧雜二環(huán)[2.2.2]辛-6-醇（4.17%），氧化石竹烯（2.58%），其中醇類(lèi)（30.1%），酮（18.45%），雜環(huán)化合物（6.96%），芳香烴衍生物（4.84%），醛（2.18%），萜類(lèi)（1.71%）。

表3 油松落葉腐解物水提液成分分析

續(xù)表3

圖3 油松落葉腐解液總離子流色譜圖

3 結(jié)論與討論

GC-MS法是檢測(cè)物質(zhì)化學(xué)成分的主要方法。近年來(lái)，在化感物質(zhì)的鑒定方面大量運(yùn)用該方法。程智慧等[4]采用GC-MS方法分析了百合根系分泌物中的主要物質(zhì)，楊先國(guó)等[5]對(duì)丹參根系分泌物的組成分分進(jìn)行了分析。本試驗(yàn)采用乙酸乙酯萃取、GC-MS法測(cè)定，從油松鮮葉水提液、落葉水提液以及落葉腐解物水提液中共鑒定出75種化學(xué)物質(zhì)。油松葉從鮮葉、落葉、落葉腐解物的變化過(guò)程中體內(nèi)化合物種類(lèi)及含量都發(fā)生了變化。

油松鮮葉水提液和落葉水提液共有苯乙醇和覆盆子酮2種物質(zhì)，說(shuō)明油松新鮮葉和落葉的物質(zhì)成分差異大。酚類(lèi)和萜類(lèi)是常見(jiàn)的化感物質(zhì)，油松鮮葉水提液中萜類(lèi)含量占13.76%、酚類(lèi)含量占11.92%，其中鄰苯二酚[6]、2,4-二叔丁基苯酚[7]等均已被證實(shí)為化感物質(zhì)；油松鮮葉水提液中4-萜品醇、芳樟醇、α-松油醇、α-畢橙茄醇等萜類(lèi)物質(zhì)也是潛在的化感物質(zhì)，具有較強(qiáng)的化感活性，往往在較低濃度時(shí)就表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑制作用[8]。油松落葉水提液酚類(lèi)、萜類(lèi)物質(zhì)含量較鮮葉有較大幅度降低，油松葉在枯落前將部分化感物質(zhì)轉(zhuǎn)移到植株其它生活部位，導(dǎo)致落葉化感物質(zhì)含量及種類(lèi)減少；這就從化感物質(zhì)種類(lèi)及含量角度解釋了油松鮮葉水提液的化感作用大于落葉水提液[3]。

油松落葉水提液和落葉腐解物水提液共有化學(xué)物質(zhì)7種，分別為苯乙醇、6,6-二甲基二環(huán)[3.1.1]庚-2-烯-2-甲醇、3-（4-羥甲基）-2-甲基環(huán)己酮、雙環(huán)[2.2.1]庚烷-2-酮、環(huán)己醇、覆盆子酮、苯丙醇，各自獨(dú)有的物質(zhì)種類(lèi)分別有23種和24種，說(shuō)明落葉腐解后物質(zhì)成分發(fā)生了較大變化。油松落葉水提液的主要成分有酚類(lèi)（5.04%），有機(jī)酸（20.62%），醇類(lèi)（11.94%），芳香烴及其衍生物（15.95%），雜環(huán)化合物（7.95%），酮類(lèi)（7.69%），酯類(lèi)（1.04%）。油松落葉腐解后，酚類(lèi)物質(zhì)未見(jiàn)，醇類(lèi)、酮類(lèi)含量增加，達(dá)30.10%和18.45%，出現(xiàn)萜類(lèi)物質(zhì)，但含量較低，從化感物質(zhì)的種類(lèi)和含量方面解釋了油松落葉腐解后化感作用較落葉水提液減弱[3]。

化感物質(zhì)成分的鑒定是化感作用研究的重要內(nèi)容，也是解釋化感作用現(xiàn)象的有力依據(jù)。本試驗(yàn)僅從油松葉不同生命形態(tài)角度分析化感物質(zhì)，從物質(zhì)大類(lèi)上分析化感作用強(qiáng)弱，未能確定化感物質(zhì)的具體種類(lèi)與含量，應(yīng)采用柱層析法和GC-MS相結(jié)合的方法[9]，應(yīng)用柱層析法篩選出最佳流分，并對(duì)其進(jìn)行GC-MS鑒定，進(jìn)一步研究化感作用的物質(zhì)種類(lèi)。

[1]張琴，李艷賓，岳靜，等.不同腐解方式下棉桿腐解液對(duì)棉花種子萌發(fā)的化感效應(yīng)[J].種子，2014，4（30）：17-20.

[2]鄭義，路雪梅，崔欣，等.油松浸提液對(duì)植物種子發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)的影響[J].北京農(nóng)業(yè)，2015，11月中旬刊：82.

[3]王曉英.油松葉水提液對(duì)高羊茅的化感效應(yīng)研究[J].草原與草坪，2016，32（6）：14-20.

[4]程智慧，徐鵬.百合根系分泌物的GC-MS鑒定[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，40（9）：202-208.

[5]楊先國(guó)，劉塔斯，陳斌，等.丹參根際土壤浸提物的GC-MS分析[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，29（10）：173-177.

[6]吳珊，李孝紅，楊龍.鄰苯二酚和鄰苯三酚對(duì)藻類(lèi)化感作用的試驗(yàn)[J].水資源保護(hù)，2011，27（3）：69-71，74.

[7]張新惠，張恩和，柴強(qiáng)，等.2，4-二叔丁基苯酚對(duì)啤酒花幼苗光和特性的影響[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，41（50）：50-54.

[8] 張秋菊，朱詩(shī)禹，張連學(xué).細(xì)辛根系浸提液和腐解液對(duì)小麥和黃瓜的化感效應(yīng)[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，40（3）：272.

[9]陳磊，云興福.西芹鮮根及根際區(qū)物化感物質(zhì)成分鑒定[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2012，27（2）：157-164.