孔德華，曾薇，朱金峰，單莉△

食管癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，位居全球腫瘤引發(fā)死亡的第6位［1］。我國(guó)更是食管癌大國(guó)，且以鱗癌為主［2］。隨著外科技術(shù)的提高以及新輔助放化療、靶向治療的運(yùn)用，食管癌患者的預(yù)后有了一定程度的改善，但患者的5年總體生存率仍較低，為15%～25%。究其原因，與術(shù)后腫瘤的侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)［3-5］。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是指癌細(xì)胞從原發(fā)部位轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處部位并在遠(yuǎn)處部位形成腫瘤的過程［6-7］。侵襲與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最本質(zhì)的特征之一［1，8］，腫瘤只有具備侵襲轉(zhuǎn)移的能力，才能脫離原發(fā)灶，向臨近組織及其他適宜生長(zhǎng)的環(huán)境侵襲。研究發(fā)現(xiàn)沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移調(diào)控中發(fā)揮著重要作用［9-10］。SIRT1屬于煙酰胺（NAD+）依賴的Ⅲ類組蛋白去乙?；竤irtuin家族成員，其主要作用不僅能去乙酰化及甲基化修飾組蛋白，還能與多種非組蛋白相互作用，參與多種病理生理過程。研究發(fā)現(xiàn)SIRT1在腫瘤中的作用具有雙面性，既可抑制腫瘤，也可促進(jìn)腫瘤發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移［11］。目前有關(guān)SIRT1與食管鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移及其對(duì)預(yù)后的研究較少。本研究采用免疫組化方法檢測(cè)食管鱗癌組織及正常食管組織中SIRT1的表達(dá)情況，分析其與臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性，探討SIRT1與食管鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2009年1月—12月于新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院行根治性手術(shù)的食管鱗癌患者104例，其中男79例，女25例；年齡36～80歲，中位年齡61歲；胸上段食管癌21例、胸中段食管癌71例、胸下段食管癌12例；腫瘤組織學(xué)分級(jí)、術(shù)后TNM分期均采用第7版美國(guó)癌癥聯(lián)盟（AJCC）標(biāo)準(zhǔn)［12］：高分化17例、中分化69例和低分化18例；Ⅰ～Ⅱ期66例，Ⅲ～Ⅳ期38例。所有患者均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為食管鱗狀細(xì)胞癌，且術(shù)前未接受放化療、靶向、生物治療等與腫瘤相關(guān)治療。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 免疫組化法檢測(cè)食管鱗癌組織及正常組織中SIRT1的表達(dá) 取患者石蠟組織標(biāo)本，包含癌組織和距腫瘤組織5 cm以外的癌旁正常組織。所有病理石蠟塊標(biāo)本采用全自動(dòng)石蠟切片機(jī)切片，制成4μm厚的病理切片。采用免疫組化EnVision法對(duì)SIRT1染色。兔抗人SIRT1多克隆IgG抗體（13161-1-AP）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔二步法試劑盒（pv-6001）、DAB二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。免疫組化染色嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

免疫組化結(jié)果判讀：切片染色后均由我院病理科兩名副主任醫(yī)師各自獨(dú)立閱片，SIRT1蛋白主要位于胞質(zhì)與胞核中，當(dāng)出現(xiàn)淺黃色至深黃色顆粒樣物質(zhì)為陽性細(xì)胞。采用陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)與染色強(qiáng)度相結(jié)合的二級(jí)計(jì)分法進(jìn)行評(píng)分［13］。著色強(qiáng)度為0級(jí)（無著色/-）計(jì)0分，1級(jí)（黃色/+）計(jì)1分，2級(jí)（棕黃色/++）計(jì)2分，3級(jí)（棕褐色/+++）計(jì)3分。陽性細(xì)胞百分比≤5%計(jì)0分，6%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分?？偡钟申栃约?xì)胞百分比及著色強(qiáng)度兩項(xiàng)計(jì)分相乘所得，總分＜4分為陰性，總分≥4分為陽性。

1.3 SIRT1表達(dá)與食管癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系 分析不同臨床病理特征食管癌患者SIRT1的表達(dá)差異。將臨床資料及SIRT1表達(dá)情況進(jìn)行分組納入生存分析，以確定影響食管癌患者預(yù)后的影響因素?？偵鏁r(shí)間（OS）定義為研究對(duì)象起始事件與終點(diǎn)事件的時(shí)間間隔。中位生存時(shí)間定義為生存率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的生存時(shí)間。起始事件定義為患者手術(shù)標(biāo)本經(jīng)病理證實(shí)為食管鱗癌。定義終點(diǎn)事件為患者死亡。

1.4 隨訪 主要采用定期住院復(fù)查、門診及電話隨訪。住院復(fù)查及門診隨訪術(shù)后第1年內(nèi)每3個(gè)月1次，以后每6個(gè)月1次，如出現(xiàn)不適隨時(shí)就診。隨訪截止時(shí)間為2015年12月31日，隨訪時(shí)間3～80個(gè)月，中位隨訪時(shí)間30.5個(gè)月，失訪12例，隨訪完成率88.46%。失訪者隨訪時(shí)間按截尾數(shù)據(jù)處理。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。SIRT1與各項(xiàng)臨床病理學(xué)特征間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)。應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并應(yīng)用Log-rank檢驗(yàn)各亞組中的生存率差異。采用Cox回歸模型進(jìn)行多因素預(yù)后分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SIRT1在食管鱗癌與癌旁組織中的表達(dá)情況 SIRT1蛋白在食管鱗癌組織中主要定位于胞核與胞質(zhì)中，其在正常組織主要位于胞核、部分胞質(zhì)中。免疫組化染色的陽性信號(hào)呈淺黃色至深黃色顆粒樣物質(zhì)，見圖1。SIRT1在食管鱗癌組織與癌旁組織中的陽性表達(dá)率分別為61.54%（64/104）、29.81%（31/104），癌組織中的陽性表達(dá)率顯著高于癌旁組織，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=21.100，P＜0.05）。

2.2 SIRT1的表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系 104例食管癌組織中，SIRT1的表達(dá)與脈管浸潤(rùn)（VI）、浸潤(rùn)深度（pT）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（pN）、腫瘤臨床分期（pTNM）密切相關(guān)（均P＜0.05），與患者的年齡、性別、腫瘤位置、組織類型、神經(jīng)侵犯無相關(guān)性，見表1。

Fig.1 Expression of SIRT1 in esophageal squamous cell carcinoma and paracancerous tissues(IHC,×200)圖1 食管鱗癌及癌旁組織SIRT1的表達(dá)（IHC，×200）

Tab.1 Relationship between expression of SIRT1 and clinicopathological features表1 SIRT1的表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系 例（%）

2.3 SIRT1表達(dá)與食管癌患者預(yù)后的關(guān)系 104例食管癌患者的5年生存率為40.30%，中位生存時(shí)間為35個(gè)月，見圖2A。SIRT1陽性表達(dá)者和陰性表達(dá)者的5年生存率分別為28.70%和59.10%，SIRT1陽性表達(dá)者的總體生存率較陰性表達(dá)者低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-rankχ2=10.065，P＜0.05），見圖2B。單因素分析結(jié)果顯示，與食管鱗癌預(yù)后可能有關(guān)的因素包括脈管浸潤(rùn)、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤臨床分期以及SIRT1表達(dá)情況，見表2。以脈管浸潤(rùn)（無=0，有=1）、浸潤(rùn)深度（T1～T2=0，T3～T4=1）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（陰性=0，陽性=1）、臨床分期（Ⅰ～Ⅱ=0，Ⅲ～Ⅳ=1）、SIRT1 表達(dá)（陰性=0，陽性=1）為自變量，以預(yù)后（生存=0，死亡=1）為因變量，進(jìn)行Cox多因素回歸分析。結(jié)果顯示，浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤臨床分期以及SIRT1表達(dá)是食管鱗癌預(yù)后的獨(dú)立影響因素，見表3。

Fig.2 Expression of SIRT1 in esophageal squamous cell carcinoma and survival prognosis of patients圖2 食管鱗癌組織中SIRT1的表達(dá)與患者的生存預(yù)后

3 討論

腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移在腫瘤的進(jìn)展中扮演著極為重要的角色，一旦腫瘤出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，則提示患者預(yù)后較差，因此對(duì)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移途徑的干預(yù)，有利于控制腫瘤進(jìn)展，使患者獲得更好的預(yù)后。SIRT1是sirtuin家族中研究最多的成員之一，其在腫瘤發(fā)生與發(fā)展過程中存在兩面性，其原因可能與組織不同有關(guān)。有研究顯示，SIRT1可抑制腫瘤生長(zhǎng)，其機(jī)制之一是通過去乙?；毖跽T導(dǎo)因子-1α（HIF-1α），并使其失活，抑制乏氧腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成與能量代謝及降低腫瘤組織淋巴管轉(zhuǎn)移，以此達(dá)到抗腫瘤目的［14-15］。但是 Zhu 等［16］的研究表明，SIRT1與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，當(dāng)采用SIRT1抑制劑使其沉默后，可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡增多，細(xì)胞侵襲能力受到抑制。本研究結(jié)果顯示，在食管鱗癌組織中SIRT1蛋白的表達(dá)顯著高于正常食管組織，這與 He 等［17］對(duì)食管癌、齊曉瑩等［18］對(duì)直腸癌以及張靜等［19］對(duì)胃癌的研究結(jié)果一致，提示SIRT1可促進(jìn)多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外，本研究結(jié)果顯示，SIRT1在食管鱗癌組織中高表達(dá)與腫瘤的脈管浸潤(rùn)、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤臨床分期密切相關(guān)，與劉麗英等［20］的研究結(jié)果基本一致，提示SIRT1蛋白在食管鱗癌中可促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，靶向抑制SIRT1的表達(dá)可能抑制食管癌細(xì)胞的增殖。但與He等［17］的研究結(jié)論卻存在差異，可能原因?yàn)镠e等的研究樣本量較少，浸潤(rùn)深度組內(nèi)樣本分布不均所致。Lin等［21］在肺癌腦轉(zhuǎn)移的研究中發(fā)現(xiàn)SIRT1在合并腦轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中較無腦轉(zhuǎn)移的NSCLC中表達(dá)升高，進(jìn)一步提示SIRT1可導(dǎo)致腫瘤向遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移，其也可能是腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在標(biāo)志物之一。需要指出的是，上述研究均未提及SIRT1與腫瘤脈管浸潤(rùn)間的關(guān)系，本研究雖提示脈管浸潤(rùn)與SIRT1的表達(dá)存在關(guān)聯(lián)，但因本研究樣本量有限，結(jié)論有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

Tab.2 Univariate analysis of prognosis factors in 104 patients with esophageal squamous cell carcinoma表2 104例食管癌患者生存資料的單因素分析

Tab.3 Multivariate analysis of prognosis factors in 104 patients with esophageal squamous cell carcinoma表3 104例食管癌患者生存資料的多因素分析

另外，SIRT1 在乳腺癌［22］、胃癌［23］、結(jié)直腸癌［24］、前列腺癌［25］、肺癌［26］中均呈過表達(dá)狀態(tài)，該類腫瘤患者的臨床預(yù)后較差，且SIRT1的表達(dá)水平與預(yù)后呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，SIRT1在食管鱗癌中高表達(dá)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。SIRT1的表達(dá)、VI、pT、pN與pTNM是食管鱗癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素，且腫瘤浸潤(rùn)深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性、臨床分期晚、SIRT1高表達(dá)的患者預(yù)后更差，這與Chen等［27］的研究結(jié)果基本一致。但與Chen等［27］的研究結(jié)果不同的是，本研究中腫瘤的組織學(xué)類型不是食管鱗癌預(yù)后的影響因素，可能原因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)樣本量較少，組織學(xué)類型中各組病例數(shù)分布不均衡（高分化組與低分化組的例數(shù)較少）等因素造成的，有待后續(xù)研究驗(yàn)證。

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