劉海洋,姚 舉,張仁福,王 偉,余 璇,王 琦

1 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 北京 100193 2 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 烏魯木齊 830091 3 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 烏魯木齊 830091

新疆是我國(guó)最大的棉花種植區(qū),棉花年產(chǎn)量占全國(guó)六成以上,棉花區(qū)位優(yōu)勢(shì)明顯。近年來隨著棉區(qū)重心向新疆轉(zhuǎn)移,棉種跨區(qū)調(diào)運(yùn)、病區(qū)棉秸稈還田加之長(zhǎng)年連作等問題突出,致使棉花黃萎病在新疆發(fā)生加重、復(fù)雜。調(diào)查表明,新疆棉花黃萎病發(fā)病田占比超過50.0%,病情指數(shù)達(dá)5.0以上的嚴(yán)重發(fā)病田占比25.0%以上[1],部分棉區(qū)該病危害十分較重,已成為制約新疆棉花生產(chǎn)的關(guān)鍵因素。

棉花黃萎病是系統(tǒng)性侵染的土傳病害,其病原菌為大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae),防治十分困難。生物防治被認(rèn)為是治理棉花黃萎病最具潛力的方法[2],但是,實(shí)踐應(yīng)用中發(fā)現(xiàn),在利用生防菌劑或生物有機(jī)肥等防治棉花黃萎病時(shí),存在防治效果不穩(wěn)定的問題。棉花根際土壤微生物、大麗輪枝菌、土壤之間通過復(fù)雜的相互作用形成的微生態(tài)系統(tǒng),是影響棉花黃萎病發(fā)生、制約生防菌劑防效的重要因素。

作物根部土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)及其組成變化能反映土壤生態(tài)現(xiàn)狀及變化趨勢(shì),對(duì)作物健康十分重要。研究認(rèn)為,不同棉花品種[3-9]、長(zhǎng)年連作[10-13]、秸稈還田[14]、作物套種[15]、水稻輪作[16]等都會(huì)造成棉田土壤中微生物多樣性水平、土壤酶活性、土壤微生物量等發(fā)生改變。但是,目前缺乏對(duì)不同黃萎病發(fā)生程度棉田中的土壤微生物多樣性差異的研究。本文以棉花黃萎病不同發(fā)生程度棉田土壤為研究對(duì)象,深入分析不同發(fā)病程度棉田土壤中微生物群落的多樣性以及土壤理化性質(zhì)差異,探究土壤中制約棉花黃萎病發(fā)生的關(guān)鍵因素,揭示棉花黃萎病發(fā)生與土壤微生物種群之間的相關(guān)性,為利用微生態(tài)調(diào)控手段進(jìn)行棉花黃萎病的綜合防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

大麗輪枝菌強(qiáng)致病力菌株V991及弱致病力菌株V250,由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所惠贈(zèng)；本實(shí)驗(yàn)室保存的細(xì)菌菌株AL7。

1.1.2 土壤樣品采集與處理

在阿克蘇市、庫(kù)爾勒市、石河子市三地分別選擇棉花黃萎病重病田和無病田(輕病田)各1塊。于4月20日、5月20日、6月20日、8月10日分別取棉花根圍10cm深耕層土樣,每塊棉田對(duì)角線3點(diǎn)取樣,每點(diǎn)間隔50m,每點(diǎn)取5份小樣,每份小樣500g土壤,混合成1份土樣。共采集72份土樣。

土樣經(jīng)2mm孔徑過篩后分3份保存：一份保存于-80℃,供提取土壤DNA進(jìn)行高通量測(cè)序分析；一份保存于4℃冰箱供土壤微生物數(shù)量分析；一份土樣風(fēng)干后保存,進(jìn)行土壤理化性質(zhì)分析。

1.1.3 取樣棉田背景

阿克蘇無病田為水稻輪作改良棉田(前茬為重病田)；重病田為相鄰長(zhǎng)年連作棉田。

庫(kù)爾勒取樣重病田為無病田內(nèi)隔離出,面積約3500m2,通過連續(xù)3a人工接種大麗輪枝菌使之成為重病田；輕病田為緊鄰的自然棉田,管理措施一致。

石河子輕病田和重病田均為自然棉田,未進(jìn)行人工干預(yù)。

1.1.4 培養(yǎng)基

馬丁氏培養(yǎng)基(鏈霉素200mg/L),高氏一號(hào)培養(yǎng)基(重鉻酸鉀50mg/L),改良微菌核選擇分離培養(yǎng)基(青霉素200mg/L)[17],肉湯培養(yǎng)基(Lysogeny broth medium,LB),胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(Tryptone soy agar medium,TSA),馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato dextrose agar medium,PDA)。

1.2 大麗輪枝菌發(fā)酵液對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)量影響測(cè)定

利用PDA培養(yǎng)液培養(yǎng)菌株V991和菌株V250,27℃下在120r/min搖床上振蕩培養(yǎng)14d,之后8000r/min離心15min,收集上清液,利用0.22μm細(xì)菌過濾器過濾除菌,-4℃保存?zhèn)溆谩？瞻譖DA培養(yǎng)液作為對(duì)照。

試驗(yàn)設(shè)5個(gè)處理,分別接種培養(yǎng)24h的AL7菌液5μL：①20mL LB培養(yǎng)液；②16mL LB培養(yǎng)液+4mL大麗輪枝菌發(fā)酵上清液；③10mL LB培養(yǎng)液+10mL大麗輪枝菌發(fā)酵上清液；④4mL LB培養(yǎng)液+16mL大麗輪枝菌發(fā)酵上清液；⑤20mL大麗輪枝菌發(fā)酵上清液。每處理以相同比例的LB培養(yǎng)液+PDA空白培養(yǎng)液作為對(duì)照。30℃,200r/min培養(yǎng)10h,每隔2h利用分光光度計(jì)測(cè)量每處理OD600值,3次重復(fù)。培養(yǎng)10h后,取5次測(cè)量值的平均值作為衡量每處理中細(xì)菌AL7生長(zhǎng)量的值。

1.3 土壤理化性質(zhì)分析

分析4月20日與8月10日采集的2批土樣的理化性質(zhì)。每塊棉田3點(diǎn)土樣混合成1份土樣。將處理好的土壤樣品送交新疆土肥水農(nóng)業(yè)科技工程中心進(jìn)行統(tǒng)一化驗(yàn)。分析指標(biāo)包括pH值、總鹽、有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀、微生物氮。

1.4 土壤中可培養(yǎng)微生物數(shù)量檢測(cè)

對(duì)阿克蘇市、石河子市、庫(kù)爾勒市采樣田4個(gè)時(shí)期采集的72份土樣,利用馬丁式培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基通過平板稀釋分離法檢測(cè)土壤中可培養(yǎng)真菌、放線菌、細(xì)菌的數(shù)量。

1.5 土壤中大麗輪枝菌微菌核分離

取1.1.2中8月份采集的棉田土樣,水篩法處理后在改良微菌核選擇分離培養(yǎng)基上利用平板稀釋法分離土壤中大麗輪枝菌微菌核；取石河子重病田4個(gè)時(shí)期采集的土樣,按照上述方法進(jìn)行大麗輪枝菌微菌核分離。

1.6 高通量測(cè)序

1.6.1 土壤樣品總DNA提取及檢測(cè)

選擇4月和8月份采集的36份土壤樣品,每份土樣稱取0.5g,利用BioTeke DP4001試劑盒提取土壤總DNA。送交北京百邁客生物科技有限公司構(gòu)建DNA文庫(kù),采用Illumina Hiseq 2500 PE250模式進(jìn)行測(cè)序。擴(kuò)增用引物及預(yù)擴(kuò)增程序：細(xì)菌 16S rRNA (V3+V4)區(qū)域引物：5′-CTCCTACGGGAGGCAGCA- 3′,5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′；樣品檢測(cè)PCR 預(yù)實(shí)驗(yàn)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30s,50℃退火30s、72℃延伸40s,25cycles；72℃延伸7min。

1.6.2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接(FLASH[18],version),將拼接得到的序列進(jìn)行質(zhì)量過濾(Trimmomatic[19],version),并去除嵌合體(UCHIME[20],version),得到高質(zhì)量的Tags序列。

1.6.3 OTU 分析

在相似性 97%的水平上對(duì)序列進(jìn)行聚類(UCLUST[21],version 1.2.22),以測(cè)序所有序列數(shù)的0.005%作為閾值過濾OTU[22]。

1.6.4 物種注釋及分類學(xué)分析

細(xì)菌16S數(shù)據(jù)庫(kù)：Silva[23]；物種注釋RDP Classifier[24]：置信度閾值為0.8；多重比對(duì)：PyNAST[25]；建樹方法：鄰接法(Neighbor-Joining)；分類學(xué)樹狀圖分析：MEGAN5[26]；alpha多樣性指數(shù)分析：Mothur[27]version v.1.30；Beta 多樣性分析(n≥3)：基于binary jaccard、bray curtis、(un)weighted unifrac(限細(xì)菌)多種算法呈現(xiàn)物種多樣性矩陣。

1.7 數(shù)據(jù)分析

常規(guī)數(shù)據(jù)利用Excel、SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總、計(jì)算和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大麗輪枝菌發(fā)酵液對(duì)細(xì)菌AL7生長(zhǎng)量的影響

圖1 細(xì)菌AL7在大麗輪枝菌發(fā)酵液中的生長(zhǎng)趨勢(shì) Fig.1 The growth tendency of bacteria strain AL7 in supernatant of V. dahliaeA：肉湯培養(yǎng)液,Lysogeny broth；B：8比2的肉湯培養(yǎng)液與大麗輪枝菌發(fā)酵液混合液,8 compares 2 mixture of lysogeny broth with potato dextrose agar fluid medium；C：1比1的肉湯培養(yǎng)液與大麗輪枝菌發(fā)酵液混合液,1 compares 1 mixture of lysogeny broth with potato dextrose agar fluid medium；D：2比8的肉湯培養(yǎng)液與大麗輪枝菌發(fā)酵液混合液,2 compares 8 mixture of lysogeny broth with potato dextrose agar fluid medium；E：大麗輪枝菌發(fā)酵液,Potato dextrose agar fluid medium

隨著大麗輪枝菌發(fā)酵上清液比例增加,培養(yǎng)10h后,不同處理中細(xì)菌AL7的生長(zhǎng)量呈逐漸降低的趨勢(shì),而對(duì)照處理中細(xì)菌AL7的生長(zhǎng)沒有受到PDA培養(yǎng)液的抑制(圖1)。結(jié)果表明,大麗輪枝菌菌株V991、V250的發(fā)酵上清液均能對(duì)細(xì)菌AL7的生長(zhǎng)起到明顯的抑制作用。

強(qiáng)致病力菌株V991發(fā)酵上清液對(duì)細(xì)菌AL7生長(zhǎng)的抑制作用超過弱致病力菌株V250,說明致病力強(qiáng)菌株產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物或營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)能力相比弱致病力菌株對(duì)細(xì)菌AL7的生長(zhǎng)影響更大。

2.2 不同發(fā)病程度棉田土壤的理化性質(zhì)分析

經(jīng)化驗(yàn)分析(表1),阿克蘇市、石河子市、庫(kù)爾勒市3個(gè)地區(qū)6塊取樣棉田土壤樣品的pH值在7.97—8.46之間,均為偏堿性土壤。庫(kù)爾勒采樣棉田鹽份含量顯著高于阿克蘇市和石河子市采樣棉田,是阿克蘇市和石河子市采用棉田的6至10倍左右,阿克蘇市經(jīng)水稻輪作改良的無病棉田鹽份含量顯著低于相鄰的常年連作重病田,體現(xiàn)了水旱輪作防病、降鹽的特點(diǎn)。

從土壤肥力水平來看,石河子市采樣棉田有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷含量均為3個(gè)采樣地區(qū)中的最高值,其中石河子市采樣重病田中有機(jī)質(zhì)、全氮含量分別達(dá)到了38.66g/kg土和2.025g/kg土,約為石河子對(duì)照輕病田的2倍,土壤肥力水平高；庫(kù)爾勒采樣重病田土壤中有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀含量均與輕病田無明顯差異；阿克蘇市水稻改良后的無病棉田土壤中有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、生物氮量均略高于相鄰重病田。

表1 不同地區(qū)棉田土壤理化性質(zhì)/(g/kg)

2.3 不同發(fā)病程度棉田土壤中可培養(yǎng)微生物數(shù)量分析

2.3.1 不同發(fā)病程度棉田土壤中的細(xì)菌數(shù)量

分析結(jié)果表明(表2),阿克蘇市采樣重病田中細(xì)菌數(shù)量除5月份低于對(duì)照田外,4月、6月、8月份3個(gè)時(shí)期土壤中細(xì)菌數(shù)量均顯著高于輕病田；庫(kù)爾勒市重病田土壤中4月份與8月份細(xì)菌數(shù)量高于對(duì)照田,5月份和6月份則低于對(duì)照田,重病田和對(duì)照輕病田中細(xì)菌數(shù)量趨勢(shì)呈交替變化,均無顯著差異；石河子市重病田4個(gè)時(shí)期土壤中細(xì)菌數(shù)量均高于輕病田,除8月份外,重病田土壤中的細(xì)菌數(shù)量均顯著高于輕病對(duì)照田。

2.3.2 不同發(fā)病程度棉田土壤中的真菌數(shù)量

阿克蘇市采樣重病田中真菌數(shù)量除4月份低于無病對(duì)照田以外,5月份、6月份與8月份重病田土壤中真菌數(shù)量均高于無病對(duì)照田,其中6月份達(dá)到顯著性差異；庫(kù)爾勒市采樣重病田土壤中真菌數(shù)量除6月份以外,均略低于輕病對(duì)照田,但4個(gè)時(shí)期均未達(dá)顯著性差異；石河子市重病田其全生育期土壤中真菌數(shù)量均高于輕病田,且在4月份、5月份、6月份均達(dá)到顯著差異(表3)。

表2 不同時(shí)期土壤中細(xì)菌數(shù)量/(×5×106)

a,b 代表顯著性差異分析,相同字母代表無顯著性差異,不同字母代表有顯著性差異

表3 不同時(shí)期土壤中真菌數(shù)量/(×5×105)

a,b 代表顯著性差異分析,相同字母代表無顯著性差異,不同字母代表有顯著性差異

2.3.3 不同發(fā)病程度棉田土壤中放線菌數(shù)量

石河子市采樣棉田中放線菌數(shù)量基數(shù)很大,每克土中最高可達(dá)1×108個(gè)。阿克蘇市采樣無病田土壤肥力指標(biāo)均高于重病田(表1),無病對(duì)照田4個(gè)時(shí)期土壤中放線菌含量均高于重病田,且在5月份和8月份達(dá)到顯著差異；庫(kù)爾勒市重病田由人工接菌造成,輕病對(duì)照田為緊鄰棉田,兩地土壤肥力差異很小(表1),放線菌數(shù)量表現(xiàn)出呈交替變化的趨勢(shì),僅在8月份出現(xiàn)了顯著差異；石河子市重病田土壤中有機(jī)質(zhì)、全氮含量均顯著高于輕病對(duì)照田,重病田4個(gè)時(shí)期土壤中放線菌的含量同樣顯著高于輕病田(表4)。

表4 不同時(shí)期土壤中放線菌數(shù)量/(×5×105)

a,b 代表顯著性差異分析,相同字母代表無顯著性差異,不同字母代表有顯著性差異

2.3.4 不同發(fā)病程度棉田土壤中大麗輪枝菌微菌核數(shù)量

經(jīng)分析(表5),阿克蘇市、石河子市、庫(kù)爾勒市每個(gè)地區(qū)重病田和輕病田土壤中大麗輪枝菌微菌核數(shù)量均達(dá)到顯著性差異。

阿克蘇市采樣重病田8月10日棉花黃萎病病情指數(shù)為58.7,每克土中分離出的大麗輪枝菌微菌核數(shù)量為40個(gè),而前期為重病田,經(jīng)水稻輪作改良后的對(duì)照棉田黃萎病病情指數(shù)為0,其耕層土中未分離到大麗輪枝菌微菌核；石河子市采樣重病田同時(shí)期棉花黃萎病病情指數(shù)為94.5,每克土中平均分離出的大麗輪枝菌微菌核數(shù)量為193個(gè),對(duì)照輕病田每克耕層土中大麗輪枝菌微菌核數(shù)量為6個(gè),病情指數(shù)為24.5；庫(kù)爾勒市人工接菌重病田同期棉花黃萎病病情指數(shù)為80.8,每克土中大麗輪枝菌微菌核數(shù)量為73個(gè),對(duì)照輕病田每克土中棉花黃萎病微菌核數(shù)量為17個(gè),病情指數(shù)為2.5。

為探明新疆棉田土壤中大麗輪枝菌微菌核含量的消長(zhǎng)動(dòng)態(tài),對(duì)石河子重病田4個(gè)時(shí)期采集的土壤中微菌核的含量進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示,4月份石河子重病田每克土中大麗輪枝菌微菌核數(shù)量為119個(gè)；5月份采集土壤中大麗輪枝菌微菌核數(shù)量最高,每克土中微菌核數(shù)量達(dá)196個(gè),至6月份略有降低,為155個(gè)/g土,8月份土壤中微菌核的數(shù)量為132個(gè)/g土,低于6月份,略高于4月份(圖2)。土壤中大麗輪枝菌微菌核的含量全年出現(xiàn)1個(gè)高峰,呈現(xiàn)先增高后逐漸降低的趨勢(shì)。

表5棉田黃萎病發(fā)生程度及10cm耕層土壤中大麗輪枝菌微菌核數(shù)量

Table5Microsclerotiumquantityofcottonfieldin10centimetersdeepanddiseaseindexofVerticilliumwilt

取樣地點(diǎn)Samplinglocation菌核數(shù)量Microsclerotiumquantity病情指數(shù)Diseaseindex阿克蘇40±1．21b58．7b0a0a石河子193±7．99b94．5b6±1．10a24．5a庫(kù)爾勒73±2．64b80．8b17±0．98a2．5a

a,b 代表顯著性差異分析,相同字母代表無顯著性差異,不同字母代表有顯著性差異

圖2 不同時(shí)期棉田10cm耕層土壤中大麗輪枝菌微菌核含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamics of micro sclerotium quantity in 10 centimeters deep of cotton field in different times

圖3 大麗輪枝菌微菌核含量與棉花黃萎病發(fā)病程度的相關(guān)性 Fig.3 The correlationship of Micro sclerotium quantity and disease degree of Verticillium wilt A:阿克蘇無病田, Disease-free field of Aksu;B:庫(kù)爾勒輕病田, Mild disease field of Korla;C:石河子輕病田,Mild disease field of Shihezi;D:阿克蘇重病田,Serious disease field of Aksu;E:庫(kù)爾勒重病田,Serious disease field of Korla;F:石河子重病田,Serious disease field of Shihezi

2.4 土壤中可培養(yǎng)微生物數(shù)量的相關(guān)性與棉花黃萎病發(fā)生程度分析

2.4.1土壤中大麗輪枝菌微菌核含量與棉花黃萎病發(fā)生程度的相關(guān)性

阿克蘇市無病棉田未檢測(cè)到大麗輪枝菌微菌核,石河子市、庫(kù)爾勒市發(fā)病嚴(yán)重棉田土壤中微菌核數(shù)量均顯著高于發(fā)病輕棉田。相關(guān)性分析表明(圖3),大麗輪枝菌微菌核含量與棉花黃萎病發(fā)生程度的R2= 0.8474(Sig.=0.036),為顯著正相關(guān),在一定范圍內(nèi),大麗輪枝菌微菌核數(shù)量越多,棉花黃萎病發(fā)生越重。

2.4.2土壤中大麗輪枝菌微菌核含量與細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量的相關(guān)性

試驗(yàn)分析證明棉花黃萎病的發(fā)生程度與土壤中的大麗輪枝菌微菌核含量呈顯著正相關(guān),而大麗輪枝菌發(fā)酵液能夠?qū)?xì)菌生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。但是,對(duì)不同棉田土壤中大麗輪枝菌微菌核含量與放線菌、真菌、細(xì)菌數(shù)量的相關(guān)性分析表明,土壤中各微生物種群之間沒有顯著相關(guān)性(表6)。

表6 微生物數(shù)量與棉花黃萎病發(fā)生程度相關(guān)性

2.5 棉田土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組成與多樣性分析

對(duì)36個(gè)土壤樣品進(jìn)行高通量測(cè)序,共獲得4062258對(duì)Reads,雙端Reads拼接、過濾后產(chǎn)生3052997條Clean tags,平均每個(gè)樣品產(chǎn)生84805條Clean tags。

樣本文庫(kù)的覆蓋率指數(shù)均在99.6%以上,反映本次測(cè)序結(jié)果代表了樣本中細(xì)菌種群的真實(shí)情況。各樣品的菌群豐度指數(shù)(Chao1、Ace)、生物多樣性指數(shù)(Shannon、Simpson)表明采集的土壤樣品中的細(xì)菌種群多樣性較高(表7)。分析表明,在97%相似度水平下,阿克蘇市、庫(kù)爾勒市重病田和輕病田分別采集的樣品之間的操作分類單元(OUT)數(shù)目存在顯著性差異,而石河子市重病田和輕病田采集的樣品生物OUT數(shù)目不存在顯著性差異。

表7 不同樣品中細(xì)菌群落多樣性指數(shù)

OTUs：Operational taxonomic units，操作分類單元；a4w2、a4w4、a4w6： 4月份阿克蘇無病田土壤樣品；a8w1、a8w2、a8w3：8月份阿克蘇無病田土壤樣品；an4b1、an4b3、an4b6：4月份阿克蘇重病田土壤樣品；an8b1、an8b2、an8b3：8月份阿克蘇重病田土壤樣品；bn4w2、bn4w4、bn4w6：4月份石河子輕病田土壤樣品；bn8w1、bn8w2、bn8w3：8月份石河子輕病田土壤樣品；sn4b2、sn4b4、sn4b6：4月份石河子重病田土壤樣品；sn8b1、sn8b2、sn8b3：8月份石河子重病田土壤樣品；k4c1、k4c2、k4c3：4月份庫(kù)爾勒輕病田土壤樣品；k8c1、k8c2、k8c3：8月份庫(kù)爾勒輕病田土壤樣品；k4v1、k4v2、k4v3：4月份庫(kù)爾勒重病田土壤樣品；k8v1、k8v2、k8v3：8月份庫(kù)爾勒重病田土壤樣品

2.5.1 不同土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性分析

圖4 不同樣品中細(xì)菌群落多樣性的NMDS分析Fig.4 NMDS analysis of bacterial community diversity NMDS：非度量多維尺度法,non-metric multidimensional scaling

根據(jù)36個(gè)土壤樣品中細(xì)菌OTU類型的豐度值利用非度量多維尺度法(NMDS)進(jìn)行多樣性分析,比較不同樣品在細(xì)菌OTUs組成上的差異。在應(yīng)力值=0.055水平上,不同土壤中的細(xì)菌菌群受采集地點(diǎn)差異的影響最大(圖4),同一棉田采集的土壤樣品中細(xì)菌菌群相似,距離最近；繼而是同一地區(qū)土壤樣品中的菌群相似,距離次之。阿克蘇市和石河子市土壤樣品采集的棉田是相互獨(dú)立的,因此在不同的棉田水平上,阿克蘇、石河子采樣重病田和輕病田土壤中的細(xì)菌菌群距離較近,均能夠獨(dú)立區(qū)分開來。而庫(kù)爾勒市土壤樣品中細(xì)菌菌群受采集棉田的影響較小,不同棉田土壤樣品中細(xì)菌菌群距離較遠(yuǎn)；反而受采樣時(shí)間的影響較大,同一時(shí)期采集的土壤中細(xì)菌菌群距離更近,表明棉田接種大麗輪枝菌并未對(duì)土壤中細(xì)菌菌群造成明顯影響。

2.5.2 不同土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的聚類分析

圖5 不同樣品中細(xì)菌群落組成的層次聚類分析 Fig.5 Hierarchical cluster analysis of bacterial community composition in different samples

對(duì)36個(gè)樣品基于Beta多樣性分析得到距離矩陣,通過非加權(quán)組平均法(UPGMA)進(jìn)行層次聚類分析(圖5)。同一地區(qū)采集的土壤樣品均單獨(dú)歸為一支,其中阿克蘇市采集的土壤樣品與石河子市采集的土壤樣品歸為一個(gè)大的分支,庫(kù)爾勒市采集的樣品單獨(dú)歸為一支,在物種組成上阿克蘇市土壤樣品與石河子市土壤樣品較庫(kù)爾勒地區(qū)更近。

具體到采樣棉田,阿克蘇市同一棉田不同時(shí)期采集的土壤樣品能夠聚為一支；更進(jìn)一步,同一時(shí)期的采集土壤樣品歸為一支。石河子市采集土壤樣品的物種組成聚類情況與阿克蘇相同,同一時(shí)期、同一棉田均能夠單獨(dú)歸為一支。

庫(kù)爾勒市采樣棉田的物種組成聚類分析結(jié)果與阿克蘇和石河子不同,由于庫(kù)爾勒采樣的重病田與輕病田為同一塊棉田隔離而來,且管理措施一致,因此在棉田水平上沒有把重病田與輕病田單獨(dú)歸為一支,反而是相同采樣時(shí)期的土壤樣品中物種組成更為接近,4月份采集的樣品和8月份采集的樣品各自歸為一支,該結(jié)果與NMDS分析結(jié)果一致,充分說明人工接入大麗輪枝菌短期內(nèi)對(duì)土壤細(xì)菌種群未產(chǎn)生明顯影響。

3 討論

本研究旨在分析棉田土壤中大麗輪枝菌與微生物群落變化之間的相關(guān)性,通過研究棉花黃萎病不同發(fā)病程度棉田土壤中微生物群落的結(jié)構(gòu)差異,探究土壤中制約棉花黃萎病發(fā)生的關(guān)鍵因素,為利用微生態(tài)調(diào)控措施防控棉花黃萎病提供理論依據(jù)。

本文研究表明,在純培養(yǎng)條件下,大麗輪枝菌無菌發(fā)酵濾液對(duì)細(xì)菌AL7的生長(zhǎng)起明顯的抑制作用,且強(qiáng)致病力菌株的抑制能力更高,可能是大麗輪枝菌的致萎毒素[28]抑制了細(xì)菌的生長(zhǎng)或大麗輪枝菌生長(zhǎng)消耗了PDA培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)所致。據(jù)此推測(cè),當(dāng)土壤中大麗輪枝菌種群達(dá)到一定數(shù)量時(shí),可能會(huì)通過致萎毒素直接抑制或通過侵染棉花引起根系分泌物的改變來影響土壤微生物的種群結(jié)構(gòu)[29-31]。但是,庫(kù)爾勒市采樣的無病棉田通過連續(xù)3年人工大量接種大麗輪枝菌使之成為棉花黃萎病重病田后,經(jīng)土壤微生物數(shù)量分析發(fā)現(xiàn),與輕病對(duì)照田相比,細(xì)菌、真菌、放線菌的數(shù)量動(dòng)態(tài)呈交替變化的趨勢(shì),各微生物類群數(shù)量均沒有明顯的差異；結(jié)合高通量測(cè)序,對(duì)各樣品進(jìn)行NMDS和層次聚類分析,也得出接種大麗輪枝菌并未對(duì)土壤中細(xì)菌菌群遺傳關(guān)系產(chǎn)生較大影響的結(jié)論。加之,石河子、阿克蘇棉花黃萎病重病田中細(xì)菌數(shù)量反而顯著高于輕病田(阿克蘇重病田5月份樣品除外),據(jù)此認(rèn)為,短時(shí)期內(nèi)大麗輪枝菌并不能夠引起棉田土壤中細(xì)菌菌群的明顯改變。

研究認(rèn)為細(xì)菌型土壤是土壤肥力提高的一個(gè)生物指標(biāo)[32],李秀英[33]、章家恩[34]等認(rèn)為土壤養(yǎng)分含量與微生物數(shù)量存在較好的正相關(guān)性,土壤微生物的數(shù)量高低在一定程度上反映了土壤的肥力水平。石河子采樣重病田為連作20年以上棉田,該棉田土壤肥力水平較高,土壤中的有機(jī)質(zhì)、全氮含量2—4倍高于其他棉田；同時(shí),該棉田黃萎病發(fā)病最重,病情指數(shù)接近100,土壤中大麗輪枝菌微菌核含量高達(dá)近200個(gè)/g土。高通量測(cè)序表明該田與石河子輕病對(duì)照田內(nèi)細(xì)菌群落存在遺傳差異,且重病田其土壤中細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量均顯著高于對(duì)照輕病田,與張海燕等對(duì)新疆南疆不同連作年限棉田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)研究的結(jié)果接近[35]。該結(jié)果證明了土壤肥力水平和微生物數(shù)量高的棉田并不能有效降低發(fā)病,而土壤中的大麗輪枝菌數(shù)量才是決定棉花黃萎病發(fā)生的主導(dǎo)因素。棉田土壤中有機(jī)質(zhì)主要來源于棉籽餅以及棉秸稈還田等,當(dāng)常年棉花連作加之帶菌秸稈還田會(huì)造成大量的病原菌積累,就會(huì)導(dǎo)致棉花黃萎病的嚴(yán)重發(fā)生?？刂圃摬￡P(guān)鍵在于利用生物防治、輪作、深翻等生態(tài)調(diào)控手段增加土壤中有益菌群數(shù)量,降低耕層土壤中菌源數(shù)量,同時(shí)種植抗病品種結(jié)合改善土壤生態(tài)、水肥條件加之健康的農(nóng)事管理促進(jìn)棉花健康生長(zhǎng),降低該病的危害。

土壤中是否存在大麗輪枝菌微菌核是棉花黃萎病能否發(fā)生流行的先決條件。研究認(rèn)為,每克土壤中0.03個(gè)微菌核就可造成發(fā)病,每克土壤中微菌核3.5個(gè)以上該病的發(fā)病率可達(dá)100%[36]；另有研究認(rèn)為導(dǎo)致棉花黃萎病發(fā)病的臨界量為0.5個(gè)/g土[37-38]。本文研究發(fā)現(xiàn),石河子、庫(kù)爾勒輕病田8月份每克土壤中微菌核數(shù)量分別為6個(gè)和17個(gè),對(duì)應(yīng)病情指數(shù)則分別為24.5和2.5,發(fā)病率未達(dá)100%,說明發(fā)病程度不是單純的由菌源數(shù)量決定,而是由棉花品種的抗病性以及大麗輪枝菌的致病力等因素在黃萎病發(fā)生程度與菌核數(shù)量的相互關(guān)系上起到主導(dǎo)作用。阿克蘇棉花黃萎病重病田經(jīng)過水稻輪作后未發(fā)生黃萎病,土壤中也未分離到大麗輪枝菌微菌核,充分證明了菌源是該病發(fā)生的先決條件,同樣也證明了水旱輪作對(duì)土傳病害極佳的控制效果[15]。

土壤中大麗輪枝菌微菌核含量與細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量的相關(guān)性分析同樣證明,棉花黃萎病的發(fā)生與大麗輪枝菌微菌核含量呈顯著正相關(guān),與放線菌、真菌、細(xì)菌三大微生物種群之間沒有顯著相關(guān)性。制約棉田土壤中微生物群落的因素很多。前人研究認(rèn)為,棉花抗枯萎病品種連作田枯萎病菌數(shù)量明顯少于重病田[4-5],連作是新疆棉花種植中的突出問題,長(zhǎng)期連作造成棉花根際微生物多樣性水平降低,土壤中三大類微生物總數(shù)下降[10],病原拮抗菌減少,土壤酶活性下降[11]。秸稈還田雖然能提高連作棉田土壤微生物量的含量,緩解棉花連作的不利影響,提高土壤質(zhì)量[14],但是從病原菌傳播、積累的角度來看,當(dāng)棉田黃萎病發(fā)生時(shí)該模式不利于控制棉花黃萎病的蔓延。而輪作可提高土壤酶活性和微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性,水稻棉花輪作[16]、蒜棉套作、麥棉套作[15]均提高棉田土壤微生物中細(xì)菌和放線菌的數(shù)量,有效抑制棉田連作障礙的發(fā)生。

本文研究表明,水稻輪作能夠有效降鹽、減病、改善土壤肥力；接種大麗輪枝菌短期內(nèi)不能造成土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的明顯改變；常年連作的重病田在土壤肥力高的情況下,土壤中微生物種群數(shù)量會(huì)高于健康棉田。不同類型棉田土壤中微生物群落主要受土壤肥力、栽培措施、種植品種等因素影響,土壤中大麗輪枝菌微菌核數(shù)量與棉花黃萎病的發(fā)生程度之間呈顯著正相關(guān),但并未顯著造成微生物數(shù)量的變化。改善棉田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)可能會(huì)一定程度促進(jìn)棉田土壤生態(tài)健康,但是,通過生物防治水旱、輪作、機(jī)械深翻等調(diào)控措施降低棉田耕層土壤中病原菌數(shù)量,才是減輕棉花黃萎病危害的基礎(chǔ)。

致謝： 感謝中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所簡(jiǎn)桂良研究員惠贈(zèng)2株大麗輪枝菌標(biāo)準(zhǔn)菌株,感謝新疆農(nóng)墾科學(xué)院植物保護(hù)研究所劉政和新疆兵團(tuán)第一師農(nóng)科所武剛在土壤樣品采集過程中給予的幫助。

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