藍(lán)蔚青　張皖君　段賢源　吳啟月　盧　瑛　謝　晶

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院， 上海 201306； 2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心， 上海 201306)

(1/λ)1/2=bλ(T-Tminλ)

0　引言

鱸魚(yú)(Lateolabraxjaponicus)為鱸形目真鱸科花鱸屬經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)，其肉質(zhì)白嫩，營(yíng)養(yǎng)豐富。由于魚(yú)肉中的水分和蛋白質(zhì)含量高，組織脆弱，極易受微生物生長(zhǎng)的影響而發(fā)生腐敗變質(zhì)。鮮魚(yú)流通期間，在腐敗過(guò)程中逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)、并產(chǎn)生異味代謝產(chǎn)物的小部分微生物，被稱(chēng)為該產(chǎn)品的特定腐敗菌(Specific spoilage organism，SSO)[1-2]。SSO生長(zhǎng)變化與魚(yú)肉腐敗速度密切相關(guān)，因此建立與鱸魚(yú)品質(zhì)高度相關(guān)的腐敗菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型，預(yù)測(cè)其貯藏貨架期，是預(yù)防魚(yú)肉腐敗變質(zhì)的可靠而迅速的手段之一[3]。

低溫保鮮可降低水產(chǎn)品中微生物的增殖速率，是淡水魚(yú)最常用的貯存和保鮮方法，利用不同低溫保鮮方式模擬溫度對(duì)水產(chǎn)品品質(zhì)及微生物生長(zhǎng)變化的影響更契合實(shí)際。目前，一級(jí)模型中修正的Gompertz方程和Logistic方程在微生物動(dòng)力學(xué)研究中應(yīng)用較廣泛，二級(jí)模型用于表達(dá)不同環(huán)境因素(如pH值、溫度、水分活度等)對(duì)微生物增殖的影響。溫度是影響?hù)~(yú)肉腐敗菌生長(zhǎng)的最重要因子，常用Belehradek方程與Arrhenius方程描述其與微生物動(dòng)力學(xué)參數(shù)的最大比生長(zhǎng)速率(k)和延滯時(shí)間(λ)的關(guān)系[4-5]。不同研究對(duì)象描述其腐敗程度的模型存在差異，POWELL等[6]研究表明，Belehradek平方根方程能較好擬合0～10℃溫度下氣調(diào)包裝大西洋鮭魚(yú)中特定腐敗菌的生長(zhǎng)情況。LIU等[7]研究得出，Arrhenius方程對(duì)反映不同溫度下虹鱒魚(yú)片中菌落總數(shù)變化特點(diǎn)的擬合效果極佳，并能對(duì)0～9℃虹鱒魚(yú)片的貯藏品質(zhì)與剩余貨架期進(jìn)行更精準(zhǔn)的預(yù)測(cè)。在生產(chǎn)流通中，受操作環(huán)境的影響，水產(chǎn)品在流通期間也會(huì)發(fā)生溫度波動(dòng)，對(duì)其品質(zhì)造成嚴(yán)重影響。章志超等[8]模擬鱘魚(yú)的斷鏈流通溫度，并以8℃和波動(dòng)溫度對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，探究不同溫度下鱘魚(yú)中熒光假單胞菌的生長(zhǎng)模型。劉壽春等[9]通過(guò)對(duì)比分析4℃恒溫和0～4℃溫度波動(dòng)貯藏過(guò)程中冷卻豬肉感官、理化和微生物特征的變化，表明溫度波動(dòng)對(duì)豬肉品質(zhì)劣變速率和貨架期均有不同程度的影響。

為將微生物生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中，本文采用不同冰藏和冷藏方式模擬鱸魚(yú)的實(shí)際流通環(huán)境，建立-1.8～10 ℃范圍內(nèi)的特定腐敗菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型及貨架期預(yù)測(cè)模型，并同時(shí)采用碎冰貯藏(0℃)與溫度波動(dòng)條件對(duì)預(yù)測(cè)模型的適用性進(jìn)行驗(yàn)證，以期為快速預(yù)測(cè)鱸魚(yú)在流通過(guò)程中的品質(zhì)與貨架期提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　原料處理

鮮活鱸魚(yú)(Lateolabraxjaponicus)60條，質(zhì)量為(500±20)g，購(gòu)自上海市浦東新區(qū)工商超市，挑選個(gè)體均一魚(yú)樣，30 min內(nèi)運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

將鮮鱸魚(yú)放入盛滿(mǎn)碎冰的泡沫箱中，使其窒息死亡，經(jīng)去頭去尾去內(nèi)臟處理，用蒸餾水清洗、瀝干后裝入自封袋中，分成5組。為貼近實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)?zāi)M了鮮鱸魚(yú)的不同流通條件，具體如圖1所示(圖中n表示所用鱸魚(yú)樣品條數(shù))。

圖1　實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程圖Fig.1　Flowchart of experimental design

其中，模擬流通組鱸魚(yú)在捕獲后先經(jīng)流化冰預(yù)冷(-1.8℃)4 h，后置于無(wú)冰泡沫箱中模擬運(yùn)輸(0.8℃)8 h，當(dāng)天到達(dá)超市后利用碎冰進(jìn)行貯藏銷(xiāo)售(0℃)至23 d。取樣周期為流化冰處理組、碎冰處理組與模擬流通組(即波動(dòng)溫度)每2 d測(cè)定1次，冷藏處理組與常溫處理組每天測(cè)定1次，各組指標(biāo)至少重復(fù)3次。流化冰、碎冰處理組樣品置于冷藏柜中，根據(jù)需要及時(shí)更換補(bǔ)充冰，保持體系溫度恒定。采用數(shù)顯溫度記錄儀測(cè)定貯藏過(guò)程中冰箱溫度與魚(yú)肉溫度。流化冰由80%冰與20%水組成，鹽水質(zhì)量濃度為3.3 g/mL，利用RE-1000W-SP型流化冰機(jī)制取冰漿。

1.2　主要藥品試劑

NaCl，中鹽長(zhǎng)江鹽化有限公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂(PCA)培養(yǎng)基、假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基、含鐵瓊脂(IA)等，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3　主要儀器設(shè)備

RE-1000W-SP型流化冰機(jī)，南通瑞友工貿(mào)有限公司；MLS-3750型滅菌鍋，日本SANYO公司；生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Testo-176T4型德圖電子溫度記錄儀，德國(guó)儀器國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司。

1.4　實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1微生物計(jì)數(shù)

細(xì)菌總數(shù)(TVC)、假單胞菌和希瓦氏菌數(shù)均參照文獻(xiàn)[10]測(cè)定。稱(chēng)取10 g魚(yú)肉于滅菌袋中，加入90 mL 0.85%無(wú)菌生理鹽水，拍打均勻后以10倍梯度稀釋?zhuān)鶕?jù)不同貯藏時(shí)間，取3個(gè)合適的稀釋度，每個(gè)稀釋度取1 mL置于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度作3個(gè)平行。其中，PCA培養(yǎng)基測(cè)定TVC，在(30±1)℃下培養(yǎng)72 h計(jì)數(shù)。滅菌后的假單胞CFC選擇性培養(yǎng)基冷卻至50℃，加入假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基添加劑，搖勻后倒入平板。IA培養(yǎng)基測(cè)定希瓦氏菌，其均在(30±1)℃下培養(yǎng)48 h計(jì)數(shù)。

1.4.2感官分析

參考朱志偉等[11]法，稍作修改，感官評(píng)價(jià)采用質(zhì)量指標(biāo)法(Quality index method，QIM)。由7名專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)的評(píng)定人員，隨機(jī)抽取不同時(shí)期的鱸魚(yú)魚(yú)肉樣品，對(duì)其光澤度、通透性、顏色、表面粘液、氣味與質(zhì)地等方面進(jìn)行分析，為確保實(shí)驗(yàn)的一致性，所用魚(yú)片均取自魚(yú)體背部肌肉。QIM法中不同參數(shù)的分值范圍在0～3，其中0為最佳品質(zhì)，3或每個(gè)參數(shù)的最高分代表最低品質(zhì)，將各參數(shù)分值相加，得出最終質(zhì)量指標(biāo)(QI值)。

1.4.3總揮發(fā)性鹽基氮值

總揮發(fā)性鹽基氮值(TVB-N)含量參照文獻(xiàn)[12]測(cè)定。

1.4.4特定腐敗菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型的建立

利用修正的Gompertz模型[13]描述不同溫度下鱸魚(yú)特定腐敗菌的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，公式為

lgN(t)=lgN0+lg(Nmax/N0)·
exp(-exp(2.718k/lg(Nmax/N0)(λ-t)+1))

(1)

式中t——時(shí)間，h

N(t)——t時(shí)菌數(shù)，CFU/g

Nmax——最大菌數(shù)，CFU/g

N0——初始菌數(shù)，CFU/g

k——微生物生長(zhǎng)的最大比生長(zhǎng)速率，h-1

λ——微生物生長(zhǎng)的延滯時(shí)間，h

二級(jí)模型主要描述溫度與微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)(k和λ)的關(guān)系。采用Belehradek平方根方程[14]、Arrhenius方程[15]描述溫度對(duì)微生物最大比生長(zhǎng)速率k和延滯期λ的影響。Belehradek方程為

(1/λ)1/2=bλ(T-Tminλ)

(2)

k1/2=bk(T-Tmink)

(3)

式中b——常數(shù)T——溫度，K

Tmin——假設(shè)的概念，指最大比生長(zhǎng)速率為零時(shí)的溫度

Arrhenius方程為

lnk=lnk0-Eak[1/(RT)-1/(RTref)]
ln(1/λ)=ln(1/λ0)-Eaλ[1/(RT)-1/(RTref)]

(4)

式中R——通用氣體常數(shù)，J/(mol·K)

Tref——基準(zhǔn)溫度，取273 K

k0——Tref時(shí)的最大比生長(zhǎng)速率，h-1

λ0——Tref時(shí)的延滯時(shí)間，h

Eak——k的活化能，kJ/mol

Eaλ——λ的活化能，kJ/mol

1.4.5生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型的可靠性評(píng)價(jià)

采用偏差度Bf和準(zhǔn)確度Af來(lái)評(píng)價(jià)已建立的微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)預(yù)測(cè)模型可靠性，Bf、Af為1.0，表示模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值完全吻合。偏差度和準(zhǔn)確度公式為

(5)

(6)

式中NMV——實(shí)測(cè)特定腐敗菌數(shù)量

NPV——同一時(shí)間由微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型得到的腐敗菌數(shù)量預(yù)測(cè)值

n——重復(fù)次數(shù)

1.4.6鱸魚(yú)貨架期預(yù)測(cè)與評(píng)價(jià)

根據(jù)已建立的-1.8～10℃溫度范圍內(nèi)特定腐敗菌的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)模型，由鱸魚(yú)特定腐敗菌從初始菌數(shù)增至感官拒絕點(diǎn)時(shí)最小腐敗菌數(shù)的時(shí)間進(jìn)行貨架期預(yù)測(cè)。將碎冰處理組與模擬流通組的鱸魚(yú)貨架期實(shí)測(cè)值與模型預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較，通過(guò)相對(duì)誤差評(píng)價(jià)預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確性。

2　結(jié)果與分析

2.1　優(yōu)勢(shì)腐敗菌數(shù)與最小腐敗量確定

為準(zhǔn)確預(yù)測(cè)鮮鱸魚(yú)的貨架壽命，需確定鱸魚(yú)的SSO數(shù)量與最小腐敗量Ns，即魚(yú)肉鮮度在感官拒絕時(shí)的特定腐敗菌數(shù)[16]。其中，圖2是采用修正的Gompertz方程回歸分析得到不同貯藏溫度下鱸魚(yú)的菌落總數(shù)、希瓦氏菌數(shù)和假單胞菌數(shù)生長(zhǎng)規(guī)律。

圖2　鱸魚(yú)在不同貯藏溫度下希瓦氏菌數(shù)、假單胞菌數(shù)和細(xì)菌總數(shù)的變化Fig.2　Changes of Shewanella, Pseudomonas and TVC growth of Lateolabrax japonicus stored at different temperatures

由圖2可見(jiàn)，新鮮鱸魚(yú)貯藏初期的微生物數(shù)量雖不多，但隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，其希瓦氏菌、假單胞菌數(shù)逐漸接近總菌數(shù)，成為優(yōu)勢(shì)菌。王慧敏等[17]研究確定鱸魚(yú)在微凍與冷藏下的主要優(yōu)勢(shì)腐敗菌是希瓦氏菌和假單胞菌。由表1得出，鱸魚(yú)4種溫度下貨架期終點(diǎn)(即感官拒絕點(diǎn))時(shí)的QI值集中在9～10，此時(shí)魚(yú)肉氣味和質(zhì)地已不符合消費(fèi)者食用要求。TVB-N質(zhì)量比為(20.45±3.77) mg/(100 g)，達(dá)到文獻(xiàn)[18]的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明當(dāng)微生物數(shù)超過(guò)上述數(shù)量級(jí)時(shí)，魚(yú)樣可能已腐敗。因此，可認(rèn)定希瓦氏菌、假單胞菌的最小腐敗量Ns為(6.48±0.41) lg CFU/g與(6.33±0.36) lg CFU/g，根據(jù)希瓦氏菌與假單胞菌的生長(zhǎng)規(guī)律可預(yù)測(cè)鱸魚(yú)的貯藏貨架期。

表1　不同貯藏溫度下鱸魚(yú)初始及貨架期終點(diǎn)時(shí)的SSO數(shù)、TVB-N質(zhì)量比和QI值Tab.1　SSO counts, TVB-N and QI values at beginning and end of storage time in Lateolabrax japonicus stored at different temperatures

2.2　鱸魚(yú)特定腐敗菌的生長(zhǎng)曲線

圖3為在模擬鱸魚(yú)4種流通溫度(-1.8、0、4、10℃)下得到的假單胞菌及希瓦氏菌生長(zhǎng)實(shí)測(cè)值，通過(guò)采用修正的Gompertz方程對(duì)微生物生長(zhǎng)曲線進(jìn)行擬合。

由表2可知，擬合的決定系數(shù)R2較高，均大于0.93，生長(zhǎng)曲線都呈現(xiàn)出典型“S”型特征，說(shuō)明修正的Gompertz方程能準(zhǔn)確描述不同溫度下假單胞菌和希瓦氏菌隨時(shí)間的變化規(guī)律。張新林等[19]在三文魚(yú)熒光假單胞菌的研究中也有類(lèi)似結(jié)論。兩種腐敗菌的初始菌數(shù)在3～4 lg CFU/g，表明樣品新鮮，符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期值，穩(wěn)定期的最大菌數(shù)在6.34～8.30 lg CFU/g。-1.8℃的假單胞菌、希瓦氏菌最大比生長(zhǎng)速率k為0.012 6、0.011 9 h-1，延滯期λ分別為217.20、269.28 h。隨著溫度的升高，兩種菌的最大比生長(zhǎng)速率逐漸增大，延滯期縮短，表明溫度對(duì)特定腐敗菌的生長(zhǎng)有較大影響[5]。低溫降低了微生物體內(nèi)酶的活性，抑制其生長(zhǎng)速率，延長(zhǎng)增殖適應(yīng)期，說(shuō)明流化冰的微凍處理對(duì)鱸魚(yú)腐敗菌生長(zhǎng)有明顯抑制作用。

圖3　不同貯藏溫度下鱸魚(yú)肉中假單胞菌、希瓦氏菌的生長(zhǎng)曲線Fig.3　Growth curves of Pseudomonas and Shewanella in Lateolabrax japonicus stored at different temperatures

微生物種類(lèi)貯藏條件溫度/℃R2λ/hk/h-1Nmax/(lgCFU·g-1)流化冰-1.80.9758217.200.01266.34假單胞菌碎冰00.9605201.120.01737.46冷藏140.9724102.480.02238.09冷藏2100.978648.000.04978.05流化冰-1.80.9325269.280.01196.76希瓦氏菌碎冰00.9576143.520.01117.49冷藏140.9669118.800.02048.30冷藏2100.983764.560.05647.41

圖4　Belehradek方程中溫度對(duì)特定腐敗菌最大比生長(zhǎng)速率(k)、延滯期(λ)的影響Fig.4　Effect of temperature on maximum specific growth rate (k) and lag phase (λ) of SSO with Belehradek equation

2.3　溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

應(yīng)用二級(jí)模型Belehradek 方程和Arrhenius方程描述溫度T與Gompertz方程所得的特定腐敗菌最大比生長(zhǎng)速率k和延滯期λ的關(guān)系。

從圖4可知，Belehradek方程對(duì)兩種特定腐敗菌的k、λ決定系數(shù)均大于0.90，表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，說(shuō)明Belehradek 方程能很好描述溫度對(duì)微生物k和λ的影響，反映鱸魚(yú)優(yōu)勢(shì)腐敗菌隨溫度變化而呈現(xiàn)出的規(guī)律。國(guó)內(nèi)相關(guān)人員[8, 20]研究假單胞菌在草魚(yú)、鱘魚(yú)等的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)也得到類(lèi)似結(jié)論。

溫度T與鱸魚(yú)假單胞菌最大比生長(zhǎng)速率k和延滯期λ的Belehradek方程為

k1/2=0.008 9T+0.127 0
(1/λ)1/2=0.006 6T+0.075 5

T與希瓦氏菌k和λ的Belehradek方程為

k1/2=0.011 2T+0.115
(1/λ)1/2=0.004 9T+0.075 6

由圖5可知，Arrhenius方程除對(duì)希瓦氏菌λ的擬合度(R2>0.877 6)較小外，其余R2均較大(R2>0.92)。

圖5　Arrhenius方程中溫度對(duì)特定腐敗菌最大比生長(zhǎng)速率(k)、延滯期(λ)的影響Fig.5　Effect of temperature on maximum specific growth rate (k) and lag phase (λ) of SSO with Arrhenius equation

其中，溫度與鱸魚(yú)假單胞菌k和λ的Arrhenius方程為

lnk=-8 326.19/T+26.35
ln(1/λ)=-9 958.75/T+31.28

T與希瓦氏菌k和λ的Arrhenius方程為

lnk=-10 444.35/T+33.91
ln(1/λ)=-8 091.00/T+24.43

2.4　微生物生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型的建立與可靠性評(píng)價(jià)

為使建立的模型更具實(shí)用性與可靠性，結(jié)合鱸魚(yú)實(shí)際流通環(huán)境，本實(shí)驗(yàn)以碎冰貯藏(0℃)和波動(dòng)溫度條件下的特定腐敗菌實(shí)測(cè)值驗(yàn)證生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確性。ROSS[21]曾提出Bf值的劃分標(biāo)準(zhǔn)：0.901.15，模型為不可接受。Af值越小(大于1)，模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性越高。

由表3可知，0℃和波動(dòng)溫度下基于Belehradek方程得出的假單胞菌、希瓦氏菌生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型的Bf分別為0.951 0、0.993 6和0.982 1、1.024 2，處于模型最佳范圍，Af分別為1.042 5、1.084 5和1.093 4、1.107 5，模型的預(yù)測(cè)誤差絕對(duì)值在4.25%～10.75%，表明建立的模型能很好預(yù)測(cè)鱸魚(yú)特定腐敗菌在0℃和波動(dòng)溫度下的生長(zhǎng)規(guī)律。而基于Arrhenius方程所得的假單胞菌、希瓦氏菌的預(yù)測(cè)模型的Bf處于模型可接受范圍，預(yù)測(cè)誤差絕對(duì)值在9.55%～21.66%，因此，基于Belehradek方程的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型對(duì)腐敗菌的預(yù)測(cè)效果更好。

表3　波動(dòng)溫度條件下特定腐敗菌生長(zhǎng)模型預(yù)測(cè)的偏差度和準(zhǔn)確度Tab.3　Bias and accuracy factors from different models of growth value of SSO under non-isothermal conditions

2.5　鱸魚(yú)剩余貨架期模型建立與評(píng)價(jià)

由表1已知假單胞菌、希瓦氏菌的初始菌數(shù)(N0)和最小腐敗值(Ns)，利用修正的Gompertz方程結(jié)合2.3節(jié)的溫度T與最大比生長(zhǎng)速率k和延滯期λ的Belehradek方程得出鱸魚(yú)在-1.8～10℃下的貨架期預(yù)測(cè)模型

(7)

(8)

同理，結(jié)合2.3節(jié)的溫度T與k和λ的Arrhenius方程得出鱸魚(yú)在-1.8～10℃下的貨架期預(yù)測(cè)模型

(9)

(10)

表4是鱸魚(yú)特定腐敗菌在0℃和波動(dòng)溫度條件下預(yù)測(cè)值和實(shí)際值比較，其中由Belehradek方程得到的貨架期預(yù)測(cè)模型對(duì)假單胞菌、希瓦氏菌的預(yù)測(cè)相對(duì)誤差為-4.96%、-8.81%和-7.30%、-5.02%，絕對(duì)值在0～10%范圍內(nèi)，表明預(yù)測(cè)模型準(zhǔn)確度較好。由Arrhenius方程得到的貨架期預(yù)測(cè)模型對(duì)假單胞菌、希瓦氏菌的預(yù)測(cè)相對(duì)誤差較大，其中希瓦氏菌達(dá)19.37%，說(shuō)明由Belehradek方程所得貨架期模型預(yù)測(cè)效果更佳。

表4　波動(dòng)溫度條件下貨架期預(yù)測(cè)模型的驗(yàn)證Tab.4　Validation of shelf life prediction models under non-isothermal conditions

3　結(jié)論

(1)修正的Gompertz方程能較好描述-1.8～10℃下鱸魚(yú)假單胞菌和希瓦氏菌的生長(zhǎng)情況，擬合決定系數(shù)R2均達(dá)0.93以上。在Belehradek方程下，溫度與希瓦氏菌和假單胞菌最大比生率(k)和延滯期(λ)呈良好線性關(guān)系，R2均大于0.90，擬合效果優(yōu)于Arrhenius方程，反映了低溫對(duì)特定腐敗菌生長(zhǎng)的抑制效果。

(2)基于Belehradek方程所建鱸魚(yú)溫度模型在-1.8～10℃范圍內(nèi)預(yù)測(cè)誤差較小，位于模型最佳范圍，且剩余貨架期預(yù)測(cè)模型的相對(duì)誤差絕對(duì)值在0～10%，比Arrhenius方程建立的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型和貨架期模型準(zhǔn)確。

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