劉　杰, 張瀟雅, 鄧　馨

(1.濰坊科技學(xué)院賈思勰農(nóng)學(xué)院設(shè)施園藝實(shí)驗(yàn)室，山東 壽光 262700；2.中國(guó)科學(xué)院植物研究所北方資源植物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100093)

隨著全球氣候變化，大范圍持續(xù)性嚴(yán)重干旱已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的最嚴(yán)重威脅.21世紀(jì)以來(lái)，重大干旱在我國(guó)主要糧食產(chǎn)區(qū)頻繁發(fā)生，對(duì)尚在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段的幼苗造成嚴(yán)重傷害，導(dǎo)致其光合受抑、生長(zhǎng)停滯、干枯甚至死亡，產(chǎn)量嚴(yán)重降低甚至絕收，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)農(nóng)業(yè)和生態(tài)環(huán)境造成威脅.與大多數(shù)植物不同，一些植物因?yàn)樵谔厥馍持虚L(zhǎng)期進(jìn)化獲得了特有的抵御某些逆境的能力，例如全球僅有的大約200種“復(fù)蘇被子植物”，它們的營(yíng)養(yǎng)組織可以長(zhǎng)期忍耐干旱脫水，且在遇水后仍可迅速恢復(fù)正常生長(zhǎng)[1].苦苣苔科旋蒴苣苔屬植物牛耳草(Boeahygrometrica)，即是一種廣泛分布于東南亞的復(fù)蘇被子植物，植株耐干旱脫水，甚至其離體葉片或葉片的一部分均耐旱，并在遇水后復(fù)蘇，幾天內(nèi)即可恢復(fù)正常生活狀態(tài).研究已證實(shí)這類植物中可能蘊(yùn)藏著一些特殊的逆境保護(hù)與調(diào)控機(jī)制，因其本身屬于種子植物，與農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物結(jié)構(gòu)和發(fā)育過(guò)程甚至分子調(diào)控機(jī)制相同，故此研究復(fù)蘇植物的這些特殊機(jī)制可為提高作物對(duì)水分脅迫的抗性提供新思路和新技術(shù).

近年來(lái)，植物表觀遺傳學(xué)成為研究熱點(diǎn)，研究表明表觀遺傳學(xué)在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著極其重要的作用，主要是通過(guò)DNA甲基化、蛋白質(zhì)共價(jià)修飾、非編碼RNA的調(diào)控、染色質(zhì)重塑和基因印記等機(jī)制調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育.而DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)中發(fā)現(xiàn)最早、研究最深入的內(nèi)容之一，它不僅參與植物個(gè)體發(fā)育和系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控, 而且還是基因組防御、親本印跡、副突變、轉(zhuǎn)基因沉默等表觀遺傳現(xiàn)象的主要機(jī)制[2,3].植物體內(nèi)DNA甲基化動(dòng)態(tài)也受到植物生理生態(tài)、發(fā)育階段及環(huán)境刺激等多種因素的影響[2].甲基化狀態(tài)的改變可啟動(dòng)植物體內(nèi)與逆境相關(guān)基因的表達(dá)以及某些轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座，從而提高植物對(duì)脅迫的抗性.DNA甲基化參與植物適應(yīng)干旱基因表達(dá)的調(diào)控已在模式植物和作物中被證實(shí)[4-6]，但DNA甲基化是否參與調(diào)控復(fù)蘇植物干旱復(fù)蘇過(guò)程還未見(jiàn)研究，因此，本研究利用MSAP技術(shù)分析牛耳草干旱復(fù)蘇過(guò)程中的DNA甲基化水平和狀態(tài)的變化及規(guī)律，為深入探討DNA甲基化在牛耳草干旱復(fù)蘇應(yīng)答過(guò)程中的作用提供依據(jù).

1　材料與方法

1.1　材料

復(fù)蘇植物旋蒴苣苔(Boeahygrometrica)，俗名牛耳草，種子采自北京植物園櫻桃溝.取種子進(jìn)行組織培養(yǎng)，待植株生長(zhǎng)到一定階段移至土中培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度為25 ℃±2 ℃，相對(duì)濕度為50%，光照周期為16 h光照/8 h黑暗.

1.2　方法

1.2.1不同處理?xiàng)l件下牛耳草表型觀察干旱脅迫處理：挑選生長(zhǎng)均勻一致的牛耳草12盆(每盆1株)，平均分為4組，每組3個(gè)重復(fù).其中Ⅰ組作為對(duì)照組(F)，Ⅱ組干旱處理5 d(SD5)，Ⅲ組干旱處理14 d(SD14)，Ⅳ組干旱處理14 d后復(fù)水3 d(A)，每組在干旱處理前1 d均充分澆足水.處理過(guò)程中時(shí)刻觀察牛耳草的生長(zhǎng)狀態(tài)與表型差異并拍照.

1.2.2基因組DNA提取從各處理組的3株牛耳草上取葉片，混合后，迅速置于液氮中備用.采用改良的CTAB法提取基因組DNA[7].用1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)提取的牛耳草基因組DNA的質(zhì)量，用NanoDrop儀(NanoDrop 2000, Thermo Scientific)檢測(cè)提取的基因組DNA的濃度與純度，剩余DNA于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.2.3甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(MSAP)分析MSAP主要步驟及體系:實(shí)驗(yàn)采用的接頭引物、預(yù)擴(kuò)增引物及選擇性擴(kuò)增引物見(jiàn)表1.接頭和引物序列由上海生工合成.酶切反應(yīng)體系25 μL(2.5 μL 10×NEBuffer，5UMspⅠ/HpaⅡ，5UEcoRⅠ，500 ng的基因組DNA)，37 ℃下酶切7 h，80 ℃下孵育30 min，使酶失活.接頭連接體系28 μL(雙酶切產(chǎn)物20 μL，EcoRⅠ接頭EA1、EA2各5×10-6μmol，MspⅠ/HpaⅡ接頭H/MA1、H/MA2各5×10-5μmol，T4 DNA ligase 0.8 U，10×T4 Ligation buffer 2.8 μL)，16 ℃連接12 h.將連接產(chǎn)物稀釋10倍作為預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)的模板，反應(yīng)體系為25 μL (10 μL 2×TaqPCR MasterMix，3 μL連接產(chǎn)物，5×10-6μ mol預(yù)擴(kuò)增引物E0，5×10-6μmol預(yù)擴(kuò)增引物H/M0)，擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min.預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍用于選擇性擴(kuò)增模板，反應(yīng)體系與預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)相同，引物為表1中的選擴(kuò)增引物組合(共25對(duì)引物組合).擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s(每循環(huán)降低0.7 ℃)，72 ℃ 1 min，共13個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min， 23個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min.選擇擴(kuò)增產(chǎn)物變性后進(jìn)行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，硝酸銀染色后進(jìn)行H(EcoRⅠ/HpaⅡ)和M(EcoRⅠ/MspⅠ)泳道條帶數(shù)及帶型統(tǒng)計(jì)分析.

1.3　RNA提取及第一鏈cDNA合成

用總RNA提取試劑盒(Trizol Reagent, TaKaRa)提取牛耳草葉片總RNA，并用DNaseⅠ(TaKaRa)純化.按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega)說(shuō)明書(shū)合成第一鏈cDNA，作為熒光定量PCR的模板.

1.4　Real-time PCR反應(yīng)

采用Eppendrof公司Realplex2 PCR儀來(lái)實(shí)時(shí)定量檢測(cè)基因表達(dá).qPCR反應(yīng)體系10 μL(2×SYBR? Green Realtime PCR Master Mix 5.0 μL，引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，cDNA模板0.4 μL，RNase-free H2O補(bǔ)足體積到10 μL).反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán).擴(kuò)增結(jié)束后繪制溶解曲線，95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，從55 ℃逐漸升溫至95 ℃ 20 min，95 ℃ 15 s.以18S rRNA為內(nèi)參基因，qRT-PCR所用引物序列見(jiàn)表2.

表1　MSAP分析中使用的接頭、預(yù)擴(kuò)增及選擇擴(kuò)增引物序列Table 1　Adaptors, pre-amplification primers and selective primers in MSAP analysis

1.5　數(shù)據(jù)處理與分析

表2　qRT-PCR所用引物Table 2　Primers used in qRT-PCR

在MSAP試驗(yàn)中，只對(duì)條帶清晰、與引物組合篩選時(shí)一致的條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì).在膠板上的1個(gè)特定位點(diǎn)，對(duì)每個(gè)樣本來(lái)說(shuō)，有條帶的記為“1”，沒(méi)有條帶的記為“0”.本次試驗(yàn)采用3次重復(fù)，所有數(shù)據(jù)處理及分析均使用SPSS 19.0完成，柱狀圖均由Origin 8.0完成.

2　試驗(yàn)結(jié)果

2.1　不同干旱處理?xiàng)l件下牛耳草表型差異

研究表明，干旱處理5 d的牛耳草葉片開(kāi)始萎蔫；干旱處理14 d的牛耳草失去大部分水分，葉片變得干硬卷縮，呈現(xiàn)一種典型的復(fù)蘇植物特有的類似脫水休眠的狀態(tài)；對(duì)干旱處理14 d的牛耳草進(jìn)行復(fù)水處理3 d后，牛耳草基本恢復(fù)原來(lái)的生活狀態(tài)(圖1).

圖1　不同處理下牛耳草狀態(tài)Fig.1　Status of Boea hygrometrica plants during dehydration and rehydration

2.2　不同干旱處理對(duì)牛耳草甲基化水平的影響

樣品全基因組DNA經(jīng)EcoRⅠ/HpaⅡ(H)和EcoRⅠ/MspⅠ(M)兩組限制性內(nèi)切酶組合酶切后，其產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)到3種甲基化類型：Ⅰ.H有帶，M無(wú)帶，代表CCGG位點(diǎn)發(fā)生單鏈外部甲基化(CHG甲基化/半甲基化)；Ⅱ.H無(wú)帶，M有帶，代表CCGG位點(diǎn)發(fā)生雙鏈內(nèi)部甲基化(CG甲基化/全甲基化)；Ⅲ.H和M組合都有帶，代表CCGG位點(diǎn)未甲基化.

利用5條EcoRⅠ引物和5條HpaⅡ/MspⅠ引物組合成25對(duì)引物，篩選出5對(duì)擴(kuò)增效果較好且結(jié)果穩(wěn)定的引物組合(表1).對(duì)不同干旱復(fù)水條件下牛耳草葉片DNA的甲基化水平進(jìn)行了MSAP分析，分析100～750 bp的條帶.結(jié)果表明，在所有處理樣品中甲基化水平均在50.65%～60.82%范圍內(nèi).由對(duì)照組F結(jié)果可知，牛耳草在新鮮狀態(tài)下CCGG位點(diǎn)的甲基化水平約為50.65%，在干旱處理后，CCGG位點(diǎn)甲基化水平明顯升高，并且在干旱5 d時(shí)，甲基化水平最高達(dá)到60.82%；而干旱14 d時(shí)，牛耳草甲基化水平又降低到與新鮮狀態(tài)相當(dāng)?shù)乃?，?0.94%；復(fù)水3 d后甲基化水平略微上升，為53.12%(表3).無(wú)論哪種狀態(tài)，牛耳草葉片甲基化位點(diǎn)均以Ⅰ型CHG(半甲基化)位點(diǎn)為主，占約32.3%～40.2% (圖2).

表3　不同干旱條件牛耳草葉片基因組DNA甲基化水平1)Table 3　Levels of major types of MSAP profiles in leaves of B.hygrometrica during dehydration and rehydration

1)F代表新鮮對(duì)照，SD5代表干旱5 d，SD14代表干旱14 d，A代表復(fù)水3 d.

2.3　不同干旱處理下牛耳草葉片DNA甲基化變化類型

F代表新鮮對(duì)照，SD5代表干旱5 d，SD14代表干旱14 d，A代表復(fù)水3 d.圖2　不同干旱處理下牛耳草葉片DNA甲基化水平Fig.2　Levels of major types of DNA methylation calculated based on the MSAP profiles in leaves of B.hygrometrica during dehydration and rehydration

當(dāng)同一個(gè)CCGG位點(diǎn)的MSAP條帶在不同處理?xiàng)l件下發(fā)生變化，就說(shuō)明此位點(diǎn)的甲基化模式發(fā)生了變化.為揭示牛耳草在干旱復(fù)蘇過(guò)程中甲基化變化的程度和類型，本文將可檢測(cè)到的條帶變化進(jìn)一步分為10個(gè)亞類(表4).A類是干旱脅迫時(shí)牛耳草基因組甲基化水平上升的條帶，即發(fā)生了甲基化(methylation)，包括5個(gè)亞類；B類是與對(duì)照相比，甲基化水平下降，即發(fā)生了去甲基化(demethylation)，包括5個(gè)亞類.(表3，圖3).

以F樣品為對(duì)照，對(duì)SD5、SD14、A的甲基化變化進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，從表3中可以看出，SD5、SD14以及A多態(tài)性條帶數(shù)分別為55、64、69條，分別占擴(kuò)增總條帶數(shù)的56.70%、60.37%、71.88%.其中SD5時(shí)有18條發(fā)生甲基化升高，37條發(fā)生去甲基化；SD14時(shí)有15條發(fā)生甲基化升高，49條發(fā)生去甲基化；A時(shí)有26條發(fā)生甲基化升高，43條發(fā)生去甲基化.這些甲基化變異主要集中在CG位點(diǎn)，且主要以去甲基化為主(圖4).

表4　不同干旱處理下牛耳草CCGG位點(diǎn)甲基化模式的變異1)Table 4　Change of DNA methylation pattern in CCGG sites of B.hygrometrica during dehydration and rehydration

1)+:有帶，-:無(wú)帶；H和M分別表示EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ酶切組合.

H代表EcoRⅠ/HpaⅡ限制性內(nèi)切酶組合酶；M代表EcoRⅠ/MspⅠ限制性內(nèi)切酶組合酶；F代表新鮮對(duì)照，SD5代表干旱5 d，SD14代表干旱14 d，A代表復(fù)水3 d.圖3　不同干旱處理下牛耳草葉片MSAP示意圖Fig.3　Examples of MSAP profiles in leaves of B.hygrometrica during dehydration and rehydration

F代表新鮮對(duì)照，SD5代表干旱5 d，SD14代表干旱14 d，A代表復(fù)水3 d.圖4　不同干旱處理下牛耳草葉片CCGG位點(diǎn)甲基化變化類型差異Fig.4　Variation in the major methylation patterns, including CG, CHG, simultaneous CG/CHG types in leaves of B.hygrometrica during dehydration and rehydration

2.4　不同干旱處理下牛耳草DNA甲基化酶相關(guān)基因表達(dá)情況

利用前文報(bào)道的牛耳草芯片數(shù)據(jù)[8](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/，NO.GSE53058)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)2個(gè)與DNA甲基化相關(guān)的酶編碼基因在干旱及復(fù)蘇過(guò)程中表達(dá)發(fā)生變化.根據(jù)cDNA序列設(shè)計(jì)引物，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證上述2個(gè)基因在牛耳草干旱及復(fù)蘇過(guò)程中的表達(dá)情況，BhDnmt2 (DNA methyltransferase 2)在干旱5 d時(shí)表達(dá)量急劇上升，而干旱14 d時(shí)幾乎不表達(dá)，復(fù)水后表達(dá)量又明顯增加；而B(niǎo)hCMT2 [DNA (cytosine-5) methyltransferase]在干旱過(guò)程中下降，尤其是干旱14 d時(shí)，但在復(fù)水后表達(dá)量有明顯升高.這些數(shù)據(jù)與芯片數(shù)據(jù)趨勢(shì)吻合(數(shù)據(jù)未列出).

3　討論

牛耳草在遭受干旱脅迫后葉片會(huì)迅速失水并向葉柄方向卷曲，以休眠狀態(tài)生存；當(dāng)澆水后逆轉(zhuǎn)，恢復(fù)正常的生長(zhǎng)狀態(tài)，這種表型變化對(duì)于牛耳草適應(yīng)極端干旱環(huán)境具有重要作用.轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)與信號(hào)途徑、保護(hù)蛋白(包括LEA蛋白和分子伴侶等)、活性氧清除、蛋白質(zhì)質(zhì)量控制和自噬等過(guò)程相關(guān)的大量基因在干旱復(fù)水過(guò)程中表達(dá)發(fā)生變化，上調(diào)或者下調(diào)，從而在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控牛耳草抗旱生理反應(yīng)，最終保障其在脫水狀態(tài)下存活并在水分條件恢復(fù)后復(fù)蘇[8].

F代表新鮮對(duì)照，SD5代表干旱5 d，SD14代表干旱14 d，A代表復(fù)水3 d.圖5　不同干旱處理下牛耳草DNA甲基化酶相關(guān)基因的表達(dá)變化Fig.5　The expression changes of DNA methylation related genes in B.hygrometrica during dehydration and rehydration

DNA甲基化水平的變化是影響基因表達(dá)的重要表觀調(diào)控機(jī)制.MSAP分析結(jié)果顯示，牛耳草甲基化水平較高，在50.65%～60.82%之間.研究表明，甲基化水平與物種基因組復(fù)雜性密切相關(guān)，甲基化的DNA絕大多數(shù)由轉(zhuǎn)座子和其他重復(fù)序列構(gòu)成；重復(fù)序列多的基因組，甲基化水平程度亦較高[9].而牛耳草基因組較大，約1.691×109bp，包含了75.75%的重復(fù)序列(主要是轉(zhuǎn)座子序列)[10]，這些重復(fù)序列可能發(fā)生甲基化而失去活性，因此導(dǎo)致牛耳草的甲基化水平相對(duì)較高.

環(huán)境刺激，諸如干旱、冷、熱、鹽害等都會(huì)引起植物DNA甲基化狀態(tài)的改變[11-14].多數(shù)脅迫情況下植物總甲基化水平會(huì)降低[14-17]；但在本研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫初期牛耳草DNA甲基化水平卻升高，這可能是復(fù)蘇植物所特有的變化特征，推測(cè)有助于一些特定基因的表達(dá)抑制；而干旱脅迫后期，DNA甲基化總體水平降低，可能有助于一些脫水特異性基因的表達(dá)誘導(dǎo)；復(fù)水3 d后，盡管牛耳草表型基本恢復(fù)，但CG位點(diǎn)甲基化水平仍明顯高于未處理組，這說(shuō)明牛耳草基因組特定位點(diǎn)仍被DNA甲基化控制.牛耳草基因組DNA甲基化水平在其干旱復(fù)蘇過(guò)程中發(fā)生明顯改變，表明DNA甲基化很可能參與調(diào)控牛耳草干旱相關(guān)基因的表達(dá)；并且由半甲基化和全甲基化條帶比例可推測(cè)，半甲基化調(diào)控在牛耳草抗旱過(guò)程中作用可能更明顯.

DNA甲基化和去甲基化，與轉(zhuǎn)錄的抑制或激活密切相關(guān)；甲基化抑制基因的表達(dá)，去甲基化可能激活基因的轉(zhuǎn)錄[18-21].而DNA甲基化主要是通過(guò)DNA甲基化相關(guān)酶來(lái)催化完成.目前植物中已鑒定的甲基轉(zhuǎn)移酶亞家族有4類：methylatransferase (MET)、chromomethyltransferse (CMT)、domain-rearranged methyltransferase (DRM)以及DNA methyltransferase homologue 2 (DNMT2)，這4類酶共同維持著植物體內(nèi)DNA甲基化[22].在本研究中，干旱處理過(guò)程中甲基化發(fā)生變異的位點(diǎn)主要以CG位點(diǎn)為主，且去甲基化程度大于甲基化程度，暗示表達(dá)被激活的基因可能多于抑制的基因.通過(guò)本研究qRT-PCR檢測(cè)的BhDnmt2、BhCMT2的表達(dá)情況也能看出，牛耳草為了適應(yīng)干旱脅迫，通過(guò)體內(nèi)多個(gè)甲基化相關(guān)酶來(lái)參與牛耳草基因組DNA甲基化水平調(diào)控，進(jìn)而增強(qiáng)其適應(yīng)干旱脅迫的能力，但具體各個(gè)酶之間是如何協(xié)調(diào)還應(yīng)進(jìn)一步研究.

4　結(jié)論與展望

干旱復(fù)蘇過(guò)程中，牛耳草DNA甲基化狀態(tài)發(fā)生變化，總甲基化水平在脅迫初期明顯升高，發(fā)生甲基化/去甲基化的位點(diǎn)占總擴(kuò)增位點(diǎn)的50%.這些變化表明DNA甲基化可能參與了牛耳草抗旱復(fù)蘇過(guò)程，是旋蒴苣苔干旱抗性反應(yīng)系統(tǒng)的一個(gè)環(huán)節(jié).通過(guò)MSAP檢測(cè)到不同干旱脅迫處理下牛耳草基因組中的胞嘧啶甲基化存在差異,這些差異片段與牛耳草響應(yīng)干旱脅迫是否有關(guān)，具體涉及到哪些基因，尚需進(jìn)一步研究證實(shí).這就需要對(duì)許多5′-CCGG-3′被甲基化修飾的序列進(jìn)行分離以及基因功能的研究，以便更準(zhǔn)確深入地理解干旱脅迫下基因組DNA的甲基化和逆境適應(yīng)機(jī)制的聯(lián)系.

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