蒲小劍，田久勝，田新會(huì)，杜文華

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心, 甘肅 蘭州730070)

紅三葉(Trifoliumpratense)為豆科三葉草屬中最重要的一種牧草，其青干草中富含異黃酮，具有調(diào)節(jié)人體新陳代謝，抗腫瘤、心血管疾病、骨質(zhì)疏松癥、早老年性癡呆癥、婦女更年期綜合征、機(jī)體免疫力下降等作用[1]，在預(yù)防骨質(zhì)疏松癥、更年期綜合征及治療胃潰瘍、胃癌、乳腺癌、腸癌和前列腺癌等方面具有特殊功效，是保健食品業(yè)和醫(yī)藥生產(chǎn)中提取異黃酮的重要原料[2-3]。

岷山紅三葉(T.pratensecv. Minshan)是1944年從美國(guó)引進(jìn)，經(jīng)過多年栽培馴化，選育出的適宜于甘肅省高寒陰濕區(qū)種植的特有牧草種質(zhì)資源。其青干草中粗蛋白含量為19.75%，異黃酮含量為4.796 μg·mg-1，是大豆(Glycinemax)的8～10倍[2]。近年來，其種植面積不斷擴(kuò)大[4]。但在長(zhǎng)期種植過程中，由于品種更新緩慢、退化嚴(yán)重，重度感染白粉病(感病率達(dá)70%)，對(duì)單位面積草產(chǎn)量和異黃酮提取量影響極大[5]。因此，培育適宜于該區(qū)種植的抗白粉病紅三葉新品種，成為農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中亟待解決的問題。

雜交育種、誘變育種和雜種優(yōu)勢(shì)利用等常規(guī)育種技術(shù)均能達(dá)到培育新品種的目的。轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)能有效彌補(bǔ)傳統(tǒng)育種的不足，打破物種間的界限，使品種選育快速、高效、定向[6]，能夠有針對(duì)性地改良和選育作物新品種[7]。遺傳圖譜構(gòu)建和相關(guān)性狀基因定位是基因克隆和轉(zhuǎn)基因育種的前提[8]。

分子遺傳圖譜構(gòu)建作圖群體主要分臨時(shí)性和永久性兩大類，常用的標(biāo)記有RFLP、RAPD、AFLP、SSR和SRAP等。構(gòu)建某一植物的圖譜時(shí)，具體選用何種標(biāo)記，要依據(jù)具體研究情況決定[8]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用不同標(biāo)記構(gòu)建了不同植物的遺傳圖譜，就是同一種植物，也可以利用不同分子標(biāo)記構(gòu)建遺傳圖譜[9-12]。AFLP標(biāo)記是一項(xiàng)結(jié)合了RFLP和PCR技術(shù)特點(diǎn)的全基因組分子標(biāo)記。它具有RFLP技術(shù)的可靠性和PCR技術(shù)的高效性，只需要極少量DNA材料，而且不需要預(yù)知基因組DNA序列特征，不需要Southern雜交，試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠，可以快速獲得大量信息，而且再現(xiàn)性高，重復(fù)性好，因而非常適合于品種指紋圖譜繪制，遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性研究，很快便成為植物分子遺傳圖譜構(gòu)建的主要標(biāo)記[13]。在一些多態(tài)性極少，而且待測(cè)樣品較少的情況下，用AFLP分析能達(dá)到滿意結(jié)果。徐志等[9]利用AFLP標(biāo)記構(gòu)建了小麥(Triticumaestivum)白粉菌遺傳連鎖圖譜。其他學(xué)者也先后利用AFLP標(biāo)記構(gòu)建了水果[14]、蔬菜[15-17]、棉花[18]、大豆[19]等作物的遺傳圖譜。AFLP也是高密度基因圖譜繪制或?qū)δ硞€(gè)基因所在區(qū)域進(jìn)行精細(xì)定位較為理想的方法[9]。AFLP是目前農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中構(gòu)建遺傳圖譜和基因定位應(yīng)用最多的分子標(biāo)記[19]。

岷山紅三葉為異花授粉植物，品種的遺傳背景不一致，群體內(nèi)存在遺傳多樣性。白粉病抗性由單基因(質(zhì)量性狀遺傳位點(diǎn))或多基因(數(shù)量性狀遺傳位點(diǎn))控制[5]。目前國(guó)內(nèi)外在植物中共檢測(cè)到白粉病QTLs44個(gè)，這些抗白粉病QTLs分布在A、B和D染色體組里，在同源群間，第5群中檢測(cè)到QTL最多[11]。對(duì)抗白粉病基因的定位主要集中在小麥、黃瓜(Cucumissativus)、甜瓜(Cucumismelo)和草莓(Fragaria×ananassa)等植物上，小麥抗白粉病基因定位方面的研究尤為突出[12]。國(guó)際小麥基因命名委員會(huì)正式命名了來自39個(gè)位點(diǎn)的55個(gè)抗白粉病基因(Pm1～Pm39)，其中30個(gè)已找到連鎖的分子標(biāo)記[11]。這些眾多的分子標(biāo)記類型中，以SSR、AFLP和SRAP應(yīng)用最為廣泛。劉聯(lián)正等[11]利用SSR標(biāo)記將小麥抗白粉病基因PmWP6192定位于2AL染色體上，劉素蘭等[12]利用SSR技術(shù)將小麥新種質(zhì)N9628-2的抗白粉病基因定位在6AS上，李春鑫等[20]利用SSR和SRAP標(biāo)記將抗小麥白粉病新基因PmHNK定位于3BL，Alfandi等[21]利用AFLP標(biāo)記將黃瓜中的抗白粉病基因定位在5BL上，F(xiàn)ernando等[22]利用SSR和AFLP標(biāo)記將甜瓜的抗病基因定位在2AL染色體上。目前國(guó)內(nèi)外利用AFLP標(biāo)記構(gòu)建紅三葉遺傳圖譜及抗白粉病QTL定位方面的報(bào)道較少。本研究擬以紅三葉抗、感白粉病材料雜交得到的F1代為作圖群體，利用AFLP標(biāo)記構(gòu)建紅三葉高密度遺傳圖譜，并對(duì)抗白粉病QTL進(jìn)行定位，為抗白粉病基因克隆和轉(zhuǎn)基因等分子輔助育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

本試驗(yàn)田間部分在甘肅省臨洮縣臨洮農(nóng)校農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行，E 103°87′，N 35°37′。海拔1892 m，降水量562 mm，無霜期80～190 d，年平均氣溫7.0 ℃(最高氣溫34.6 ℃，最低氣溫-29.5 ℃)，土壤為黑麻土，有灌溉條件，試驗(yàn)地肥力均勻。前茬作物為玉米(Zeamays)。

1.2 試驗(yàn)材料鑒定及接種

以重度感染白粉病岷山紅三葉為父本(male parent，M)、甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)培育的高抗白粉病紅三葉新品系“甘農(nóng)PR1”(據(jù)任繼周[23]病害調(diào)查與研究方法分別確定為重感和高抗，數(shù)據(jù)未發(fā)表，其中新品系“甘農(nóng)RP1”為育種用試驗(yàn)材料)為母本(female parent，F(xiàn))雜交形成F1代群體以及親本。2015年3月下旬將雜交F1代種子點(diǎn)播，株距20 cm，行距30 cm，播種深度1～2 cm，得到F1代群體。利用項(xiàng)目組前期研究篩選出的11對(duì)AFLP引物對(duì)提取自紅三葉親本及雜交F1代群體的基因組DNA進(jìn)行電泳(JY-ECP3000高壓電泳儀-北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；JY-SPFT水平電泳槽-北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)。根據(jù)電泳圖譜條帶特征，淘汰假雜種，保留真雜種，用于構(gòu)建遺傳圖譜。參照文獻(xiàn)[5]的白粉菌接種方法和侵染型記載標(biāo)準(zhǔn)，于2015年6月中旬為F1代群體和父母本苗期人工接種白粉菌，待岷山紅三葉6月底充分發(fā)病后，記載F1代群體中每個(gè)單株的侵染型。從F1代群體中分別隨機(jī)選取15株抗病和感病單株，采用改良CTAB(cetyl trimethyl ammonium bromide)法[9]分別提取DNA(TGL16M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)-湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；水浴鍋)，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度(PCR擴(kuò)增儀-BioRad-MyCycler；紫外凝膠成像儀-UVP GDS-8000；超微量紫外分光光度計(jì)-Quawell-Q5000；相機(jī))，OD260/280為1.8±0.1，符合試驗(yàn)要求。提純合格后的DNA樣置于4 °C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?次重復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 試劑

MseI、EcoRI和T4DNA連接酶均購(gòu)自Thermo Scientific；2×PCR Master Mix，DNA Marker均購(gòu)自BBI Life Sciences；引物及接頭(表1)由上海生工生物工程(上海)有限公司人工合成；其他試劑均為國(guó)藥分析純。

表1 接頭和引物序列Table 1 The sequence of adapter and primer

1.4 AFLP分析

參照Vos等[24]的方法，略作調(diào)整。分步法酶切體系：200～300 ng DNA 9.0 μL、10×Tag Buffer 3 μL、8 UEcoRI，6 UMseI，ddH2O補(bǔ)齊20 μL。37 ℃水浴5 h、65 ℃水浴15 min，-20 ℃保存。連接體系：?jiǎn)捂溔斯そ宇^加ddH2O稀釋至50 μmol·L-1，經(jīng)PCR反應(yīng)合成雙鏈，加入3 U T4DNA連接酶，于22 ℃下連接過夜。接頭制作：將合成的人工單鏈稀釋至50 μmol·L-1，經(jīng)PCR反應(yīng)94 ℃，5 min；65 ℃，10 min；37 ℃，10 min；25 ℃，10 min；4 ℃保存。合成雙鏈接頭，-20 ℃保存?zhèn)溆谩ｎA(yù)擴(kuò)增體系：連接產(chǎn)物模板DNA 4 μL、0.8 μLEcoRI，0.6 μLMseI預(yù)擴(kuò)增引物，15 μL 2×PCR Master Mix，然后ddH2O補(bǔ)平，離心混勻進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min進(jìn)行變性；94 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，進(jìn)行擴(kuò)增，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min進(jìn)行延伸，-20 ℃保存?zhèn)溆?。選擇性擴(kuò)增體系：2.0 μL稀釋30倍的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物，Primer E，0.8 μL；Primer M，1.0 μL；2×PCR Master Mix，10 μL；ddH2O，6.2 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min進(jìn)行變性；65 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，每個(gè)循環(huán)開始溫度下降0.7 ℃，共擴(kuò)增13個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共擴(kuò)增23個(gè)循環(huán)；-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

制備4%變性聚丙烯酰胺凝膠，待膠聚合后恒電壓1800 V預(yù)電泳30 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(2 μL)與上樣Buffer混合均勻，經(jīng)90 ℃變性3 min后，置于4 ℃保存等待點(diǎn)樣。點(diǎn)樣后1500 V恒功率電泳1.5 h左右。采用Carlos銀染方法[25]，膠版微干后拍照、并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)與分析

以30個(gè)F1群體真雜種個(gè)體及雙親共32個(gè)單株的基因組DNA為PCR模板，用11對(duì)AFLP引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。讀帶的原則：記錄清晰、明確的條帶；模糊、不易辨認(rèn)的條帶不做紀(jì)錄。同一位點(diǎn)有帶記為“H”，無帶記為“A”，缺失用“-”表示。AFLP標(biāo)記名稱由引物組合編號(hào)和多態(tài)性條帶序號(hào)組合而成。由同1對(duì)引物組合擴(kuò)增出多個(gè)多態(tài)性條帶，分別記為引物組合名-01、-02，依此類推如E3M4-01，E3M7-05等。最后按軟件JoinMap 4.0的作圖格式要求對(duì)獲得的標(biāo)記基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和編輯。

利用JoinMap 4.0軟件[26]構(gòu)建遺傳圖譜的過程：File—New Project—Load Data，分別將基因型數(shù)據(jù)導(dǎo)入JoinMap 4.0作圖軟件；然后運(yùn)行Data—Locus Genot. Freq.—Calculate Dudo，對(duì)標(biāo)記進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，剔除偏分離標(biāo)記；接著運(yùn)行LOD Groupings (tree)窗口下的Calculate命令，對(duì)各標(biāo)記間的連鎖關(guān)系進(jìn)行分組，圖距也由Calculate命令計(jì)算出來；然后根據(jù)計(jì)算后不同的分組，運(yùn)行Population—Create Groups using the Groupings Tree，選擇適宜的LOD值(2～10)在Population菜單下分別構(gòu)建各個(gè)基因連鎖群；然后運(yùn)行Group—Calculate Map命令對(duì)每個(gè)連鎖群創(chuàng)建連鎖圖；最后用Export命令導(dǎo)出結(jié)果。

利用本試驗(yàn)構(gòu)建的紅三葉AFLP圖譜和MAPQTL 6.0軟件[27]對(duì)抗白粉病有關(guān)QTL進(jìn)行定位分析，并計(jì)算各位點(diǎn)性狀的育種值和貢獻(xiàn)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅三葉遺傳圖譜構(gòu)建

基于149個(gè)AFLP標(biāo)記構(gòu)建的紅三葉基因連鎖圖包含7個(gè)連鎖群(LG1～LG7)(圖1，表2)。所獲得連鎖圖譜總距離為640.5 cM，標(biāo)記間平均距離4.3 cM。各連鎖群的距離為55.2～140.6 cM，標(biāo)記數(shù)為10～33，標(biāo)記間的距離為1.8～9.4 cM。其中，連鎖群LG1的遺傳距離(140.6 cM)最大，包含15個(gè)AFLP標(biāo)記，標(biāo)記間平均距離為9.4 cM；LG2的遺傳距離為70.6 cM，包含19個(gè)AFLP標(biāo)記，標(biāo)記間平均距離為3.7 cM；LG3的遺傳距離為110.3 cM，包含23個(gè)AFLP標(biāo)記，標(biāo)記間平均距離為4.8 cM；LG4的遺傳距離(55.2 cM)是所有連鎖群中最小的，但包含31個(gè)AFLP標(biāo)記，標(biāo)記間平均距離為1.8 cM；LG5的遺傳距離為83.2 cM，包含10個(gè)AFLP標(biāo)記，標(biāo)記間平均距離為8.3 cM；LG6的遺傳距離為122.9 cM，包含的AFLP標(biāo)記最多(33個(gè))，標(biāo)記間平均距離為3.7 cM；LG7的遺傳距離為57.7 cM，包含18個(gè)AFLP標(biāo)記，標(biāo)記間平均距離為3.2 cM。

2.2 紅三葉抗白粉病基因QTL分析

利用MAPQTL 6.0對(duì)紅三葉抗白粉病QTL進(jìn)行定位分析(圖1)。LOD≥2.0時(shí)，檢測(cè)到5個(gè)與紅三葉抗白粉病性狀有關(guān)的QTL，分別定位于遺傳圖譜的LG4和LG5連鎖群(圖1中陰影部分)。

圖1 紅三葉遺傳圖譜及抗白粉病QTL定位Fig.1 Linkage map and QTL analysis on powdery mildew resistance in red clover 圖中LG4和LG5的陰影為紅三葉抗白粉病QTL位點(diǎn)。Shadows on LG4 and LG5 mean QTLs resistant to the powdery mildew in red clover.

5個(gè)與紅三葉抗白粉病相關(guān)的QTL暫命名qrp-1，qrp-2，qrp-3，qrp-4和qrp-5，其中qrp-1、qrp-2、qrp-3和qrp-4位于LG4連鎖群上，qrp-5位于LG5連鎖群上。5個(gè)QTL位點(diǎn)的加性效應(yīng)均為負(fù)值，對(duì)抗白粉病表現(xiàn)增效加性效應(yīng)，其中qrp-1最小(-2.22)，qrp-4最大(-1.11)(表3)。在5個(gè)QTL位點(diǎn)中，qrp-1的遺傳距離為4.6 cM，包含的AFLP標(biāo)記數(shù)最多(3個(gè))，其LOD值(10.45)和對(duì)紅三葉白粉病抗性的貢獻(xiàn)率(90%)最大，為主效基因；qrp-2的LOD值(3.28)次之，包含2個(gè)AFLP標(biāo)記，其加性效應(yīng)和貢獻(xiàn)率分別為-1.48和39%；qrp-5的遺傳距離最大(6.1 cM)，但包含的位點(diǎn)數(shù)最少(0)，LOD值(2.44)和貢獻(xiàn)率(31%)相對(duì)較低，其也是唯一一個(gè)不在LG4連鎖群上的QTL位點(diǎn)。

3 討論

3.1 作圖群體的選擇

作圖群體的選擇是影響遺傳圖譜構(gòu)建和圖譜質(zhì)量好壞的主要因素之一，常見遺傳連鎖圖譜作圖群體有臨時(shí)性作圖群體和永久性分離群體，臨時(shí)性作圖群體包括雜交F1代、F2代和F4代群體[28-30]。永久性分離群體包括近等基因系群體、雙單倍體群體、重組自交系群體、回交自交系群體[31-34]。如果植物的親本基因型雜合度較高，則F1分離作圖群體為適宜作圖群體[28]。包括紅三葉在內(nèi)的大多數(shù)多年生牧草為異花授粉植物，親本高度雜合，自交不親和，選育高純度自交系相對(duì)較難，構(gòu)建回交群體有一定阻礙[28]。雜交F1代是大多數(shù)牧草分子遺傳連鎖圖譜構(gòu)建的常用作圖群體，已應(yīng)用于紫花苜蓿(Medicagosativa)[35]、紅三葉[36]、鴨茅(Dactylisglomerata)[37]、黑麥草(Loliumperenne)[38]和高羊茅(Festucaelata)[39]等牧草。

表2 紅三葉遺傳連鎖圖譜中各連鎖群的圖距和標(biāo)記分布Table 2 Genetic distance and distribution of markers in the linkage groups of red clover

表3 紅三葉抗白粉病性狀的QTL分析Table 3 QTL analysis of powdery mildew resistance in red clover

3.2 作圖標(biāo)記的選擇

DNA分子標(biāo)記直接體現(xiàn)植物DNA水平上的遺傳多樣性，因?yàn)槠湟撞僮?、不易受環(huán)境影響和可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在牧草遺傳圖譜構(gòu)建研究中應(yīng)用廣泛?，F(xiàn)階段，SRAP、AFLP、SSR、RFLP和RAPD等分子標(biāo)記是遺傳作圖的主要方法。遺傳圖譜構(gòu)建的關(guān)鍵在于選取適宜的標(biāo)記系統(tǒng)。實(shí)踐證明，AFLP的多態(tài)性條帶在圖譜上定位的比例非常高，能夠滿足構(gòu)建遺傳連鎖圖譜要求[40-42]。荷蘭Keygene公司和PE公司共同構(gòu)建了擬南芥(Arabidopsisthaliana)遺傳連鎖圖譜，共有700多個(gè)AFLP位點(diǎn)，擬南芥的全部基因組在圖譜中體現(xiàn)的非常好[43-44]。Jaime等[45]利用AFLP結(jié)合27個(gè)形態(tài)學(xué)性狀，對(duì)馬鈴薯(Solanumtuberosum)多態(tài)性水平及其親緣關(guān)系進(jìn)行了研究。

3.3 遺傳圖譜構(gòu)建

牧草的草產(chǎn)量、品質(zhì)和非生物抗性等性狀往往具有連續(xù)的表型變異，并且由多個(gè)數(shù)量性狀位點(diǎn)調(diào)控[46-48]。前人主要利用回交法，對(duì)具有優(yōu)良性狀的親本進(jìn)行改良，其育種時(shí)間較長(zhǎng)，效率十分低[46]。分子遺傳連鎖圖譜不僅能夠在分子層面分析，而且可以對(duì)主要農(nóng)藝性狀的基因進(jìn)行標(biāo)記、定位和基因克隆，并可以將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)入到特定植物中[48]。利用轉(zhuǎn)基因等分子標(biāo)記輔助育種，可加快牧草育種進(jìn)程[49]。

一般而言，連鎖框架圖要求標(biāo)記間平均間隔要小于20 cM。如果標(biāo)記間的平均距離為10～20 cM或更小時(shí)，就可以進(jìn)行主基因定位[50]。本試驗(yàn)由149個(gè)AFLP標(biāo)記構(gòu)建的遺傳圖譜，全長(zhǎng)640.5 cM，標(biāo)記間平均距離為4.3 cM，平均間距1.8～9.4 cM。圖譜標(biāo)記分布均勻，可用于QTL定位。

3.4 抗白粉病QTL定位

近年來QTL定位研究是國(guó)內(nèi)外高度重視的一種方法，其發(fā)展非常迅猛。最初使用傳統(tǒng)的單標(biāo)記分析法[51]，然后發(fā)明了利用兩個(gè)側(cè)鄰標(biāo)記的區(qū)間作圖法[52]，后來發(fā)展為在模型中加入其他類型標(biāo)記，以減少遺傳背景效應(yīng)誤差的復(fù)合區(qū)間作圖法[36]，目前QTL定位最先進(jìn)的方法是多重區(qū)間作圖法[53]。多重區(qū)間作圖法能夠?qū)我籕TL進(jìn)行快速、有效定位[37,51]。本研究以抗、感白粉病紅三葉材料雜交形成的F1群體為作圖群體，構(gòu)建AFLP遺傳圖譜，并利用多重區(qū)間作圖法對(duì)抗白粉病QTL進(jìn)行定位分析，可以為紅三葉分子輔助育種奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)利用紅三葉雜交F1代群體為作圖群體，由149個(gè)AFLP標(biāo)記構(gòu)建得到7個(gè)連鎖群(LG1，LG2，LG3，LG4，LG5，LG6和LG7)。所獲得遺傳圖譜的總距離和標(biāo)記間平均距離分別為640.5和4.3 cM。在所得連鎖圖譜中，LG4遺傳距離最小(55.2 cM)，包含的標(biāo)記數(shù)高達(dá)31個(gè)，標(biāo)記間平均距離最小(1.8 cM)，是所有連鎖圖譜中最密集的。

應(yīng)用區(qū)間作圖法對(duì)紅三葉抗白粉病基因進(jìn)行QTL分析定位，共檢測(cè)到5個(gè)與抗白粉病相關(guān)的QTL位點(diǎn)(qrp-1，qrp-2，qrp-3，qrp-4和qrp-5)，分布在LG4和LG5連鎖群上，其中LG4上含有4個(gè)QTL位點(diǎn)。qrp-1對(duì)紅三葉白粉病抗性的貢獻(xiàn)率最大(90%)，為主效QTL。

參考文獻(xiàn)References：

[1] Jiang Y B, Wang C Z, Cui G W. Effect of red clover isoflavone on immune organs, igs and anti-oxidation activity of broiler chicks. Acta Agrestia Sinica, 2011, 19(3): 520-524.

姜義寶, 王成章, 崔國(guó)文. 紅車軸草異黃酮對(duì)肉雞免疫器官、免疫球蛋白及抗氧化性能的影響. 草地學(xué)報(bào), 2011, 19(3): 520-524.

[2] Du W H. Red clover. Lanzhou: Gansu Science and Technology Press, 2006： 7-8.

杜文華. 紅三葉. 蘭州: 甘肅科學(xué)技術(shù)出版社, 2006： 7-8.

[3] Liu X L, Du W H, Song C. Effects of nitrogen and phosphorus fertilization on isoflavone content in red clover. Acta Agriculture Boreali-occidentalis Sinica, 2010, 19(7): 159-163.

劉曉玲, 杜文華, 宋超. 氮磷肥施用量對(duì)紅三葉中異黃酮含量的影響. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2010, 19(7): 159-163.

[4] Wang Z M, Yue M Q, Du W H,etal. Excellent legume for feeding and medicine-MinshanTrifoliumpretense. Pratacultural Science, 2005, 22(4): 33-35.

王志明, 岳民勤, 杜文華, 等. 集飼用和藥用價(jià)值于一體的牧草新秀——岷山紅三葉. 草業(yè)科學(xué), 2005, 22(4): 33-35.

[5] Liu X L, Song C, Du W H. Study on mechanism of resistance to powdery mildew in Minshan red clover. Grassland and Turf, 2011, 31(3): 73-76.

劉曉玲, 宋超, 杜文華. 紅三葉對(duì)白粉病抗性機(jī)理研究. 草原與草坪, 2011, 31(3): 73-76.

[6] Wang Z H, Zhu D L, Yu C. Application in germplasm improvement of medical plants via biotechnology. Bulletin of Science and Technology, 2010, 26(1): 88-92.

王忠華, 朱東亮, 俞超. 現(xiàn)代育種技術(shù)在藥用植物品種改良中的應(yīng)用. 科技通報(bào), 2010, 26(1): 88-92.

[7] Jia X X, Qi E F, Ma S,etal. Analysis of drought tolerance and herbicide resistance in transgenic potato plants over-expressingDREB1A/Bar. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(11): 58-64.

賈小霞, 齊恩芳, 馬勝, 等. 轉(zhuǎn)DREB1A/Bar雙價(jià)基因馬鈴薯的耐旱性及除草劑抗性分析. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 24(11): 58-64.

[8] Li D M. Constructions on the linkage genetic map and QTL mapping for forage yield and rust resistance related traits in triticale. Lanzhou: Gansu Agricultural University, 2016.

李冬梅. 飼草型小黑麥的遺傳圖譜構(gòu)建及草產(chǎn)量和抗銹病相關(guān)基因的QTL定位. 蘭州: 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué), 2016.

[9] Xu Z, Mei L H, Li Z Y,etal. A genetic linkage map ofBlumeriagramf.sp. tritici based on AFLP molecular markers and a virulence genes. Acta Phytopathologica Sinica, 2009, 39(1): 16-22.

徐志, 梅麗宏, 李志英, 等. 利用AFLP分子標(biāo)記和無毒基因構(gòu)建小麥白粉菌遺傳連鎖圖譜. 植物病理學(xué)報(bào), 2009, 39(1): 16-22.

[10] Xu J Q, He F, Cui F,etal. Powdery mildew resistant locus inTritileymustranslocation line shannong 6343 mapped by molecular markers. Molecular Plant Breeding, 2012, 10(1): 86-91.

徐金秋, 何方, 崔法, 等. 小濱麥易位系山農(nóng)6343抗白粉病基因的分子標(biāo)記定位. 分子植物育種, 2012, 10(1): 86-91.

[11] Liu L Z, Li H, Yang R,etal. Mapping of gene resistance to wheat powdery mildew using SSR markers. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2012, 32(7): 1322-1327.

劉聯(lián)正, 李華, 楊睿, 等. 小麥抗白粉病基因SSR標(biāo)記定位. 西北植物學(xué)報(bào), 2012, 32(7): 1322-1327.

[12] Liu S L, Wang C Y, Wang Q Y,etal. SSR analysis of powdery mildew resistance gene in a new GERMPLASM N9628-2 ofTriticumaestivumL. Acta Agronomica Sinica, 2008, 34(1): 84-88.

劉素蘭, 王長(zhǎng)有, 王秋英, 等. 小麥新種質(zhì)N9628-2抗白粉病基因的SSR分析. 作物學(xué)報(bào), 2008, 34(1): 84-88.

[13] Li Q Y, Zhang X L, Zhang Z G,etal. Advance of studies on constructing linkage map in Chinese cabbage using molecular marker. Biotechnology Bulletin, 2012, (6): 18-24.

李巧云, 張曉亮, 張志剛, 等. 大白菜分子遺傳圖譜構(gòu)建研究進(jìn)展. 生物技術(shù)通報(bào), 2012, (6): 18-24.

[14] Zhu J, Wang T, Zhao Y J,etal. Identification of apple varieties with AFLP molecular markers. Acta Horticulturae Sinica, 2000, 27(2): 102-106.

祝軍, 王濤, 趙玉軍, 等. 應(yīng)用AFLP分子標(biāo)記鑒定蘋果品種. 園藝學(xué)報(bào), 2000, 27(2): 102-106.

[15] Gao J Q, Zhou J C, Wang X C,etal. Construction of AFLP fingerprint of partial high resistance to low phosphorus stress genotypic in Sugarbeet (BetavulgarisL.). Jiangsu Agricultural Sciences, 2017, 45(6): 36-38.

高金秋, 周建朝, 王孝純, 等. 部分高抗低磷脅迫基因型甜菜AFLP指紋圖譜的構(gòu)建. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 45(6): 36-38.

[16] Wang D, Yu X X, Yu Z,etal. AFLP analysis of genetic differences among elite hybrid potato lines. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(9): 117-124.

王丹, 于肖夏, 于卓, 等. 馬鈴薯雜種優(yōu)良株系遺傳差異的AFLP分析. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 25(9): 117-124.

[17] Xie L B, Wang X, Chen L X,etal. QTL mapping of Vitamin C in pepper fruit based on AFLP and SSR. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2017, 33(16): 41-45.

謝立波, 王雪, 陳立新, 等. 基于AFLP和SSR技術(shù)對(duì)辣椒果實(shí)維生素C含量的QTL定位. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2017, 33(16): 41-45.

[18] Wang Z W, Wei L M, Xie X M,etal. Establishment of cotton genetic map and QTL analysis of fiber quality traits by using AFLP. Jiangsu Agricultural Sciences, 2015, 43(7): 71-74.

王志偉, 魏利民, 謝曉美, 等. 利用AFLP構(gòu)建棉花遺傳圖譜及纖維品質(zhì)性狀QTL分析. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 43(7): 71-74.

[19] Wang X Z, Zhou R, Zhang X J,etal. Map construction and QTL analysis of oil content in soybean. Chinese Journal of Oil Crop Sciences, 2008, 30(3): 272-278.

王賢智, 周蓉, 張曉娟, 等. 大豆遺傳圖譜的構(gòu)建和含油量的QTL分析. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào), 2008, 30(3): 272-278.

[20] Li C X, Xu W G, Wang G S,etal. Molecular marker mapping and genetic analysis of a novel powdery mildew resistance genePmHNK. Scientia Agricultura Sinica, 2009, 42(8): 2771-2777.

李春鑫, 許為鋼, 王根松, 等. 小麥白粉病抗病新基因PmHNK的遺傳分析和分子標(biāo)記定位. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 42(8): 2771-2777.

[21] Alfandi M, Ji Y, Shen L P,etal. Construction of genetic linkage map and localization of QTLs for powdery mildew resistance in cucumber (Cucumissativus). IV International Symposium on Cucurbits, 2010, 871: 33-41.

[22] Fernando Y L, Carmen C, Emilio S,etal. Genetic linkage map of melon (CucumismelonL.) and localization of a major QTL for powdery mildew resistance. Molecular Breeding, 2011, 27(2): 181-192.

[23] Ren J Z. Scientific research methods of pratacultural science. Beijing: China Agricultural Press, 1998: 214-236.

任繼周. 草業(yè)科學(xué)研究方法. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 1998: 214-236.

[24] Vos P, Hogers R, Bleeker M,etal. AFLP a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research, 1995, 23: 4407-4414.

[25] Liu S X. Practical biological histological techniques. Beijing: Science Press, 2003: 222-224.

劉世新. 實(shí)用生物組織學(xué)技術(shù). 北京: 科學(xué)出版社, 2003: 222-224.

[26] Jiang Z Y, Yu X X, Yu Z,etal. Construction of a genetic linkage map for tetraploid hybrid wheat grass using a SSR molecular marker. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(6): 94-101.

姜志艷, 于肖夏, 于卓, 等. 利用SSR分子標(biāo)記構(gòu)建四倍體雜交冰草的遺傳連鎖圖譜. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 25(6): 94-101.

[27] Ding C L, Liu Y, Xu N X,etal. QTL analysis of traits relating to cold resistance ofZoysiajaponica. Acta Agrestia Sinica, 2010, 18(5): 703-707.

丁成龍, 劉穎, 許能祥, 等. 日本結(jié)縷草抗寒相關(guān)性狀的QTL分析. 草地學(xué)報(bào), 2010, 18(5): 703-707.

[28] Cai C F, Liu G X, Cheng F Y,etal. Selecting optimal F1segregation population for genetic linkage mapping in tree peony. Journal of Beijing Forestry University, 2015, 37(3): 140-147.

蔡長(zhǎng)福, 劉改秀, 成仿云, 等. 牡丹遺傳作圖最適F1分離群體的選擇. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 37(3): 140-147.

[29] Guo J B, Huang L, Cheng L Q,etal. An integrated genetic linkage map from three F2population of cultivated peanut (ArachishypogaeaL.). Acta Agronomica Sinica, 2016, 42(2): 159-169.

郭建斌, 黃莉, 成良強(qiáng), 等. 利用3個(gè)F2群體整合高密度栽培種花生遺傳連鎖圖. 作物學(xué)報(bào), 2016, 42(2): 159-169.

[30] Du X L, Zhang Z W, Wu B,etal. Construction and analysis of genetic linkage map in tartary buckwheat (Fagopyrumtataricum) using SSR. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2013, 29(21): 61-65.

杜曉磊, 張宗文, 吳斌, 等. 苦蕎SSR分子遺傳圖譜的構(gòu)建及分析. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2013, 29(21): 61-65.

[31] Jiang Z Y, Yu X X, Yu Z,etal. Construction of an AFLP-based genetic linkage map of tetraploid hybrid wheatgrass. Journal of Triticeae Crops, 2015, 35(4): 457-463.

姜志艷, 于肖夏, 于卓, 等. 四倍體雜交冰草AFLP遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建. 麥類作物學(xué)報(bào), 2015, 35(4): 457-463.

[32] Fang Y Y, Yu X X, Yu Z,etal. QTL mapping analysis of 10 important traits inSorghum-Sudangrass hybrid. Journal of Northwest A&F University (Nature Science Edition), 2015, 43(4): 26-34, 43.

房永雨, 于肖夏, 于卓, 等. 高丹草10個(gè)重要性狀的QTL定位分析. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2015, 43(4): 26-34, 43.

[33] Li L, Chen Z W, Du Z Z,etal. Genetic map preliminary structure of low-nitrogen tolerance used DH population in barley. Journal of Triticeae Crops, 2012, 32(6): 1021-1025.

李梁, 陳志偉, 杜志釗, 等. 大麥DH群體在耐低氮相關(guān)遺傳連鎖圖譜初步構(gòu)建中的運(yùn)用. 麥類作物學(xué)報(bào), 2012, 32(6): 1021-1025.

[34] Studer B, Jensen L B, Hentrup S,etal. Genetic characterisation of seed yield and fertility traits in perennial ryegrass (LoliumperenneL.). Theoretical and Applied Genetics, 2008, 117(5): 781-791.

[35] Wang M Y, Zhang T J, Long R C,etal. Preliminary construction of genetic map in tetraploid alfalfa. Acta Agrestia Sinica, 2015, 23(6): 1247-1251.

王夢(mèng)穎, 張鐵軍, 龍瑞才, 等. 四倍體紫花苜蓿遺傳圖譜的初步構(gòu)建. 草地學(xué)報(bào), 2015, 23(6): 1247-1251.

[36] Isobe S, K?lliker R, Hisano H,etal. Construction of a consensus linkage map for red clover (Trifoliumpretense L.). BMC Plant Biology, 2009, (9): 57.

[37] Xie W G. Genetic linkage map and flowering time gene mapping in orchard grass (DactylisglomerataL.). Ya’an: Sichuan Agricultural University, 2012.

謝文剛. 鴨茅分子遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及開花基因定位. 雅安: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

[38] Luo Y C, Ma X, Zhang X Q. DNA fingerprinting of annual ryegrass (LoliummultiflorumLam.) varieties using SSR makers. Journal of Agricultural Biotechnology, 2013, 21(7): 799-810.

羅永聰, 馬嘯, 張新全. 利用SSR技術(shù)構(gòu)建多花黑麥草品種指紋圖譜. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2013, 21(7): 799-810.

[39] Zhong L, Yang C Y, Shu J H,etal. Research progress on genetic breeding of tall fescue (FestucaarundinaceaSchreb.). Agricultural Science & Technology, 2014, 15(2): 265-268.

[40] Li S, Zhao G F. AFLP molecular marker and its application. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2003, 23(5): 830-836.

李珊, 趙桂仿. AFLP分子標(biāo)記及其應(yīng)用. 西北植物學(xué)報(bào), 2003, 23(5): 830-836.

[41] Hu Z H, Guo H Y, Hu X L,etal. Genetic diversity ofCannabissativaL. based on AFLP analysis. Journal of Plant Genetic Resources, 2012, 13(4): 555-561.

胡尊紅, 郭鴻彥, 胡學(xué)禮, 等. 大麻品種遺傳多樣性的AFLP分析. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2012, 13(4): 555-561.

[42] Li H Y, Li Z Y, Xin X,etal. Genetic diversity inMedicagoruthenica(L.) Trautv. populations using AFLP marker. Journal of Plant Genetic Resources, 2016, 17(1): 78-83.

李鴻雁, 李志勇, 辛霞, 等. 野生扁蓿豆種質(zhì)資源AFLP 遺傳多樣性的分析. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2016, 17(1): 78-83.

[43] Wang B, Weng M L. The principle and application of AFLP. Hybrid Rice, 1996, (5): 27-30.

王斌, 翁曼麗. AFLP的原理及其應(yīng)用. 雜交水稻, 1996, (5): 27-30.

[44] Bert P F, Charmet G, Sourdille P,etal. A high-density molecular map for ryegrass (Loliumperenne) using AFLP markers. Theoretical and Applied Genetics, 1999, 99(3): 445-452.

[45] Jaime S S, Daniza M U, Leonardo A R. Molecular description and similarity relationships among native germplasm potatoes (Solanumtuberosumssp.tuberosumL.) using morphological data and AFLP markers. Electronic Journal of Biotechnology, 2007, 10(3): 436-443.

[46] Xie W G, Liu W X, Zhang J Q,etal. Molecular genetic linkage map and its application in forage crops. Pratacultural Science, 2014, 31(6): 1147-1159.

謝文剛, 劉文獻(xiàn), 張建全, 等. 牧草分子遺傳連鎖圖譜及其應(yīng)用. 草業(yè)科學(xué), 2014, 31(6): 1147-1159.

[47] Jing Z B, Yu L, Wei L,etal. Research advances in genomics and transgenic of forage in abroad. Biotechnology Bulletin, 2011, (11): 12-25.

井趙斌, 俞靚, 魏琳, 等. 國(guó)外牧草基因組學(xué)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究進(jìn)展. 生物技術(shù)通報(bào), 2011, (11): 12-25.

[48] Zhu Y W, Lin Y R, Chen L. Research progress of rice molecular breeding in China. Journal of Xiamen University (Natural Science), 2016, 55(5): 661-671.

朱義旺, 林雅容, 陳亮. 我國(guó)水稻分子育種研究進(jìn)展. 廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2016, 55(5): 661-671.

[49] Hirata M, Cai H W, Inoue M,etal. Development of simple sequence repeat (SSR) markers and construction of an SSR-based linkage map in Italian ryegrass (LoliummultiflorumLam.). Theoretical and Applied Genetics, 2006, 113(2): 270-279.

[50] Tian L B. Constructing of genetic maps and QTL mapping of powdery mildew resistance in bitter melon. Shenyang: Shenyang Agricultural University, 2015.

田麗波. 苦瓜遺傳圖譜構(gòu)建及白粉病抗性的QTL定位. 沈陽(yáng): 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué), 2015.

[51] Shang L G. Genetic analysis of heterosis using backcross population in upland cotton (GossypiumhirsutumL.). Beijing: China Agricultural University, 2016.

商連光. 陸地棉回交群體雜種優(yōu)勢(shì)遺傳基礎(chǔ)研究. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 2016.

[52] Zhang J. Construction of high-density genetic map and QTL analysis of ornamental traits in Mei. Beijing: Beijing Forestry University, 2016.

張杰. 梅花高密度遺傳圖譜構(gòu)建及部分觀賞性狀QTL分析. 北京: 北京林業(yè)大學(xué), 2016.

[53] Wang L. Construction of wheat molecular genetic map and QTL analysis for agronomic and quanlity traits. Taian: Shandong Agricultural University, 2012.

王霖. 小麥遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及主要農(nóng)藝和品質(zhì)性狀QTL定位. 泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.