李晶,李娜,丁品,楊海興,劉錦霞*,武建榮,杜文靜,張建軍

(1.甘肅省科學(xué)院生物研究所，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省榆中縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，甘肅 榆中 730100)

灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)和辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)分別為辣椒灰霉病、辣椒枯萎病、辣椒根腐病和辣椒疫病的病原菌，其寄主范圍十分廣泛，可引起葫蘆科、茄科、豆科和十字花科等100多種植物相應(yīng)病害的發(fā)生。它們的接種體能夠很好地在土壤中長(zhǎng)期存活，并可經(jīng)年累月地累積到相當(dāng)高的數(shù)量水平，且不易受氣象、環(huán)境等因子的影響而波動(dòng)，可持續(xù)為害[1-6]。近年來(lái)，我國(guó)保護(hù)地辣椒種植面積不斷擴(kuò)增，然而由于生產(chǎn)高度集約化，復(fù)種指數(shù)高、品種單一、長(zhǎng)期連作、高密度栽培、多水多肥，加之冬春季大棚內(nèi)溫度低、濕度大、結(jié)露持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)[7-9]，為各種病原菌提供了理想的賴以生存的寄主和繁殖場(chǎng)所，使其在土壤中大量積累，形成病土，發(fā)病率高達(dá)30%以上，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)達(dá)50%以上，甚至絕產(chǎn)，連年發(fā)病，防治困難[10-11]。幾十年來(lái)國(guó)內(nèi)外科研工作者在化學(xué)防治、抗病品種、農(nóng)業(yè)防治、生物防治等方面做了大量的工作，并取得了一些的成績(jī)，但由于各種技術(shù)本身的缺陷導(dǎo)致產(chǎn)業(yè)化發(fā)展受阻[12-17]。尤其是化學(xué)防治，長(zhǎng)期大量使用化學(xué)農(nóng)藥，病原菌抗藥性增強(qiáng)，農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量增加，品質(zhì)下降，農(nóng)業(yè)面污染加重，原本脆弱的農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境雪上加霜，區(qū)域農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境保護(hù)計(jì)劃的推進(jìn)舉步維艱[18-19]。因此，探索開發(fā)安全、高效、環(huán)保的化學(xué)農(nóng)藥替代資源，開發(fā)新產(chǎn)品，對(duì)防治保護(hù)地辣椒多發(fā)病害具有十分重要的意義。

在保護(hù)地辣椒病害防治體系中，具有無(wú)公害和可持續(xù)發(fā)展特征的生物防治技術(shù)及其產(chǎn)品越來(lái)越受到人們的重視[20-21]，我國(guó)幅員遼闊，地理環(huán)境復(fù)雜，有著極其豐富的天然資源，植物資源是其中最重要的一部分。充分利用優(yōu)勢(shì)資源從植物體中尋找新的高效、低毒、低殘留且與環(huán)境相容性好的生物農(nóng)藥天然活性物質(zhì)是當(dāng)今新農(nóng)藥開發(fā)的研究熱點(diǎn)之一[22-24]。目前發(fā)現(xiàn)有殺菌活性的植物有1400余種，其產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物超過40萬(wàn)種，生物堿類、萜烯類、黃酮類、檸檬素和番荔枝內(nèi)酯等化合物都具有較強(qiáng)的抑菌活性[25-26]。研究顯示其中一些植物源活性物質(zhì)對(duì)保護(hù)地辣椒的多發(fā)性真菌病害具有較強(qiáng)的抑制活性[27-33]。黃帚橐吾(Ligulariavirgaurea)系菊科橐吾屬多年生草本有毒植物, 生長(zhǎng)于海拔2600～4700 m的高寒草場(chǎng)、沼澤草甸、陰坡濕地及灌叢中，主要分布于我國(guó)西藏東北部、云南西北部、四川、青海、甘肅等地。黃帚橐吾莖葉含有豐富的萜類、脂肪族類、芳香族類和生物堿類等化合物，這些物質(zhì)的化感效應(yīng)協(xié)助其成為草原群落中的優(yōu)勢(shì)毒雜草，是草場(chǎng)退化的標(biāo)志性植物之一[34-36]。黃帚橐吾莖葉所含的化合物中萜類和生物堿類是其農(nóng)藥生物活性的主要成分，其全草提取物對(duì)鱗翅目和同翅目害蟲(如棉鈴蟲幼蟲、菜粉蝶幼蟲和蚜蟲等)具有較強(qiáng)的胃毒、觸殺、拒食和熏蒸等活性作用[37-38]，對(duì)一些致病病原菌和作物病原真菌也有較強(qiáng)的殺滅和抑制活性[39-41]，但關(guān)于黃帚橐吾提取物對(duì)蔬菜病害病原菌的抑制活性及其防治效果還未見相關(guān)報(bào)道。通過研究黃帚橐吾有機(jī)溶劑提取物對(duì)灰葡萄孢、尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和辣椒疫霉菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的影響，對(duì)這4種病原菌引發(fā)的保護(hù)地辣椒真菌病害的防治效果及其對(duì)辣椒種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響，以期更合理地開發(fā)和利用天然資源，使黃帚橐吾變害為寶，開發(fā)新型高效廣譜植物源農(nóng)藥資源，使其在農(nóng)、林、牧草的病蟲害綠色防控中發(fā)揮重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料

供試病原菌：灰葡萄孢、尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌、辣椒疫霉。均為本實(shí)驗(yàn)室從發(fā)病田間采集病樣，分離、純化、鑒定、保存。

PDA培養(yǎng)基：稱取200 g馬鈴薯置于1000 mL蒸餾水中，煮沸30 min，過濾，加葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1000 mL。

藥材：黃帚橐吾花前葉片采自甘肅省甘南州瑪曲縣高山牧場(chǎng)。新鮮葉片除塵、殺青后置通風(fēng)處晾干，粉碎，過篩。

主要藥劑：50%多菌靈可濕性粉劑購(gòu)自江陰市農(nóng)藥二廠有限公司，40%嘧霉胺可濕性粉劑購(gòu)自河北益海安格諾農(nóng)化有限公司，72%霜脲·錳鋅可濕性粉劑購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所廊坊農(nóng)藥中試廠，50%烯酰嗎啉水分散粒劑購(gòu)自上海禾本藥業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1黃帚橐吾提取物制備 將黃帚橐吾粉碎物與石油醚∶甲醇∶水(5∶8.5∶1)混合溶媒系按1∶1的質(zhì)量體積比，共置于帶塞的玻璃瓶中，浸泡12 h，再經(jīng)超聲功率250 W，溫度40 ℃處理30 min；靜置20 min后，再在相同條件下超聲提取30 min，過濾，收集濾液。同法共提取3次，濾渣再用少量溶媒系洗滌3～5次；合并所有濾液，再次過濾除雜，(30±1) ℃，0.8 kPa條件下減壓回收溶媒，即得黃帚橐吾提取物(深褐色浸膏)。

1.2.2黃帚橐吾提取物對(duì)保護(hù)地辣椒4種真菌病害病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 采用菌絲生長(zhǎng)速率法[42]。取一定量黃帚橐吾提取物，加入到經(jīng)過121 ℃、25 min高溫滅菌的PDA培養(yǎng)基中，使其成為含藥量為20、60、100、150、200 g·L-1的混合培養(yǎng)基。將此培養(yǎng)基倒入直徑90 mm的培養(yǎng)皿中制成含不同濃度黃帚橐吾提取物的平板(每皿30 mL混合培養(yǎng)基)。無(wú)菌條件下在灰葡萄孢、尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和辣椒疫霉活化平板近邊緣處取直徑0.5 cm的菌絲塊，接種于含藥平板上，對(duì)照為PDA培養(yǎng)基，(26±1) ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。每處理重復(fù)5次。計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。分析不同濃度黃帚橐吾提取物對(duì)供試病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性大小。以待測(cè)藥劑濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，菌絲生長(zhǎng)抑制率的幾率值為縱坐標(biāo)，采用回歸分析法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算黃帚橐吾提取物抑制供試病原菌菌絲生長(zhǎng)的EC50值及其95%置信限。

菌絲生長(zhǎng)抑制率(MGI)=[(dc-dt)/dc]×100%

式中：dc表示對(duì)照組菌絲平均生長(zhǎng)直徑；dt表示試驗(yàn)組菌絲平均生長(zhǎng)直徑。

1.2.3黃帚橐吾提取物對(duì)保護(hù)地辣椒4種真菌病害病原菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度測(cè)定 采用微量稀釋法[43]。分別將4種病原真菌在(26±1) ℃活化培養(yǎng)10 d左右，待生成大量孢子(或菌核)后，用適量無(wú)菌水洗脫制成含菌量大于1×108cfu·mL-1的孢子懸液。用PDA培養(yǎng)液將黃帚橐吾提取物稀釋至20 g·L-1作為母液。用96孔板，向第一孔中加入190 μL母液，然后以PDA培養(yǎng)液為溶劑進(jìn)行微量稀釋，使其從第1孔至第7孔的濃度范圍依次為20、15、10、5、2.5、1.0、0.5 g·L-1。最后每孔再加入10 μL配制好的病原菌懸液，使每孔的終體積為200 μL。第8孔中加入190 μL PDA培養(yǎng)液和10 μL病原菌懸液作為對(duì)照，第9孔中加入200 μL PDA培養(yǎng)液作為培養(yǎng)基對(duì)照。96孔板加蓋，置于(26±1) ℃、濕度70%～75%條件下培養(yǎng)5～7 d。每處理設(shè)5次重復(fù)。肉眼觀察無(wú)菌生長(zhǎng)孔所含黃帚橐吾提取物濃度為最小抑菌濃度。從上述每個(gè)無(wú)菌生長(zhǎng)的孔內(nèi)取100 μL接種于PDA培養(yǎng)基中，在(26±1) ℃、濕度70%～75%條件下培養(yǎng)5～7 d，無(wú)菌落生成的孔所對(duì)應(yīng)的化合物濃度為其最小殺菌濃度。

1.2.4黃帚橐吾提取物對(duì)保護(hù)地辣椒4種真菌病害病原菌孢子萌發(fā)的影響 采用孢子萌發(fā)法[42]。分別將灰葡萄孢、尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和辣椒疫霉(26±1) ℃活化培養(yǎng)，待生成大量孢子(或菌核)后，用適量無(wú)菌水洗脫制成高濃度孢子懸液，再用0.1%無(wú)菌葡萄糖溶液稀釋成適當(dāng)濃度，使其在低倍顯微鏡下(10×10倍)每視野中有30～40個(gè)孢子。取一定量上述病原菌孢子懸液與適量黃帚橐吾提取物混合均勻，使得混合液含黃帚橐吾提取物濃度為20、60、100、150、200 g·L-1。取各濃度混合物0.1 mL加在凹玻片上，在溫度(26±1) ℃、濕度不小于75%的條件下恒溫保濕培養(yǎng)，對(duì)照為孢子懸液。各處理均設(shè)重復(fù)5次。當(dāng)對(duì)照的孢子萌發(fā)率達(dá)到80%以上時(shí)，即檢查記錄。統(tǒng)計(jì)時(shí)孢子囊萌發(fā)產(chǎn)生芽管時(shí)計(jì)為萌發(fā)，每處理隨機(jī)觀察5個(gè)視野，記錄孢子總數(shù)和孢子萌發(fā)數(shù)，計(jì)算孢子萌發(fā)率、孢子萌發(fā)抑制率。分析不同濃度黃帚橐吾提取物對(duì)供試病原菌孢子萌發(fā)的抑制活性大小。以待測(cè)藥劑濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，孢子萌發(fā)抑制率的幾率值為縱坐標(biāo)，采用回歸分析法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算黃帚橐吾提取物抑制供試病原菌孢子萌發(fā)抑制率的EC50值及其95%置信限。計(jì)算公式：

孢子萌發(fā)率=(萌發(fā)孢子數(shù)/調(diào)查的孢子數(shù))×100%

校正孢子萌發(fā)抑制率=[(對(duì)照組萌發(fā)率-處理組萌發(fā)率)/對(duì)照組萌發(fā)率]×100%

1.2.5黃帚橐吾提取物對(duì)辣椒種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響 黃帚橐吾提取物對(duì)辣椒種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響參考徐佳琦等[44]的方法。辣椒品種為隴椒16號(hào)。

對(duì)種子萌發(fā)的影響：將黃帚橐吾提取物配制成2、5、10、20、50 g·L-1的供試溶液，直徑12 mm培養(yǎng)皿中放置3層濕濾紙，加入5 mL供試液。辣椒種子以70%的酒精消毒1 min后，再用0.5%的次氯酸鈉消毒1 min，無(wú)菌水沖洗5～6次，每20粒辣椒種子一組，放置于含不同濃度供試液的培養(yǎng)皿中。以無(wú)菌蒸餾水處理為對(duì)照。每處理重復(fù)5次。(26±1) ℃黑暗培養(yǎng)，對(duì)照95%種子發(fā)芽時(shí)，計(jì)量各處理種子的發(fā)芽率。

對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響：將黃帚橐吾提取物配制成2、5、10、20、50 g·L-1的供試溶液，小燒杯底部放置3層濕濾紙后，加入3.5 mL供試溶液。辣椒種子消毒沖洗后用40 ℃的無(wú)菌水浸泡2 h，(26±1) ℃恒溫、黑暗催芽24 h。將出芽種子放置于含不同濃度供試藥液的小燒杯中，每10粒種子一組，每組重復(fù)5次。以無(wú)菌蒸餾水處理作為空白對(duì)照。(26±1) ℃恒溫、保濕、10 h/14 h光周期培養(yǎng)，7～10 d后記錄實(shí)驗(yàn)辣椒苗生長(zhǎng)情況并計(jì)量苗高、根長(zhǎng)、苗鮮重。

1.2.6黃帚橐吾提取物對(duì)保護(hù)地辣椒4種真菌病害的防治效果 該試驗(yàn)于2015-2016年在榆中縣農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心實(shí)驗(yàn)基地完成 。辣椒品種為隴椒16號(hào)。

供試植株培養(yǎng)：挑選籽粒飽滿的辣椒種子用70%的酒精消毒1 min后，再用0.5%的次氯酸鈉消毒1 min，無(wú)菌水沖洗5～6次，然后用40 ℃的無(wú)菌水浸泡2 h，(26±1) ℃恒溫、黑暗催芽，待大部分種子出芽后，挑取出芽情況一致的種子播種于裝有混合基質(zhì)(椰糠∶黑土3∶1)的育苗盤中，在 19～23 ℃、濕度70%～75%，光周期9 h/15 h的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，待幼苗長(zhǎng)出6～8片真葉后進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)處理。

病原菌孢子懸液：制備方法同1.2.3，得含菌量大于1×108cfu·mL-1的灰葡萄孢、尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和辣椒疫霉孢子懸液。

預(yù)防效果試驗(yàn)：處理藥液為黃帚橐吾提取物的10、50、100、300、500 倍稀釋液；陽(yáng)性對(duì)照為50%多菌靈可濕性粉劑、40%嘧霉胺可濕性粉劑、72%霜脲·錳鋅可濕性粉劑和50%烯酰嗎啉水分散粒劑的500 倍稀釋液；空白對(duì)照為清水。每處理供試植株30株。尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和辣椒疫霉采用灌根接種法[45], 先以每株40 mL黃帚橐吾不同濃度處理液灌根，24 h后，再將制備的尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和辣椒疫霉孢子懸液以每棵植株40 mL灌注接入，覆一層薄土，正常管理。每個(gè)處理4次重復(fù)?；颐共〔≡捎脟婌F接種法[46],先將各濃度黃帚橐吾提取物稀釋液噴于受試植株莖葉表面，平均每棵植株用藥量20 mL，24 h后，將灰葡萄孢孢子懸液同法噴于植株表面，平均每株用孢子懸液20 mL。正常管理。接種后第2天開始觀察植株發(fā)病情況,每天記錄發(fā)病株數(shù),9～15 d后(空白對(duì)照發(fā)病株數(shù)超過50%后)拔出處理植株,測(cè)量發(fā)病植株根、莖或葉病斑長(zhǎng)度或大小,并進(jìn)行分級(jí)。病情分級(jí)參照易永圖等[45]灌根接種法分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和農(nóng)業(yè)部病害試驗(yàn)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[46],根據(jù)各處理的病情指數(shù)計(jì)算防治效果。

治療效果試驗(yàn)：先按“預(yù)防試驗(yàn)”方法接種灰葡萄孢、尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和辣椒疫霉孢子懸液于待測(cè)植株根部或莖葉表面，待植株發(fā)病后，再按照“預(yù)防試驗(yàn)”的量和方法施用處理藥液、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照。其余管理、觀察、記錄、計(jì)算、分析均同“預(yù)防試驗(yàn)”。 計(jì)算公式：

病情指數(shù)=∑[(各級(jí)病株數(shù)或葉數(shù)×病級(jí)數(shù)值)/(調(diào)查總株數(shù)或葉數(shù)×最高病級(jí)數(shù)值)]×100

防治效果=[(對(duì)照病情指數(shù)—處理病情指數(shù))/對(duì)照病情指數(shù)]×100%

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行處理參數(shù)的差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃帚橐吾提取物

采用超聲波輔助有機(jī)溶劑提取法制備黃帚橐吾提取物，提取率為9.48%，產(chǎn)物為含水量約8%的深褐色浸膏。進(jìn)一步分離純化獲得34個(gè)化合物，其中含萜類化合物79.53%、芳香族類化合物6.53%和生物堿類化合物2.41%。

2.2 黃帚橐吾提取物對(duì)保護(hù)地辣椒4種真菌病害病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性

黃帚橐吾提取物對(duì)灰葡萄孢、尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和辣椒疫霉菌絲生長(zhǎng)均有抑制活性，且抑制活性強(qiáng)度與其濃度呈正相關(guān)，濃度越大，抑制活性越強(qiáng)，不同濃度的抑制活性存在顯著性差異(P<0.05)。當(dāng)濃度為200 g·L-1時(shí)，菌絲生長(zhǎng)抑制率均在90%以上，濃度為20 g·L-1時(shí)，對(duì)灰葡萄孢和辣椒疫霉的菌絲生長(zhǎng)抑制率在70%以上，對(duì)尖孢鐮刀菌和茄病鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)抑制率為45%～50%(表1)?；貧w分析得知，黃帚橐吾提取物對(duì)灰葡萄孢、尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和辣椒疫霉菌絲生長(zhǎng)的抑制毒力存在一定差異，它們的半數(shù)抑制濃度EC50分別為11.93、51.25、19.93、13.84 g·L-1，對(duì)灰葡萄孢抑制毒力最強(qiáng)，其次為辣椒疫霉和茄病鐮刀菌，EC50均低于20 g·L-1，對(duì)尖孢鐮刀菌抑制毒力相對(duì)較弱，EC50大于50 g·L-1(表2)。

表1 黃帚橐吾提取物對(duì)灰葡萄孢、尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和辣椒疫霉菌絲生長(zhǎng)的抑制活性Table 1 The inhibition activity of extracts from L. virgaurea against mycelial growth of B. cinerea, F. oxysporum, F. solani and P. capsici (%)

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。同列不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著；藥物濃度是指黃帚橐吾提取物浸膏含量，下同。

Note: Data are mean±SE. Different letters in the same column indicate significant differences atP<0.05. Drug concentration is the content of extracts fromL.virgaurea, the same below.

表2 黃帚橐吾提取物對(duì)灰葡萄孢、尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和辣椒疫霉菌絲生長(zhǎng)的抑制毒力Table 2 The inhibition toxicity of extracts from L. virgaurea against mycelial growth of B. cinerea, F. oxysporum, F. solani and P. capsici

2.3 黃帚橐吾提取物對(duì)保護(hù)地辣椒4種病原真菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

黃帚橐吾提取物對(duì)4種保護(hù)地辣椒病原真菌灰葡萄孢、尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和辣椒疫霉的最小抑菌濃度為0.83～1.83 g·L-1。最小殺菌濃度差異較大，對(duì)灰葡萄孢和辣椒疫霉的最小殺菌濃度大于等于2.5 g·L-1，對(duì)尖孢鐮刀菌和茄病鐮刀菌的最小殺菌濃度大于等于10.00 g·L-1(表3)。由此初步判斷黃帚橐吾提取物對(duì)灰葡萄孢和辣椒疫霉有較好的防治效果，對(duì)尖孢鐮刀菌和茄病鐮刀菌的防治效果相對(duì)弱一些。

2.4 黃帚橐吾提取物對(duì)保護(hù)地辣椒4種病害病原真菌孢子萌發(fā)的抑制活性

表3 黃帚橐吾提取物對(duì)保護(hù)地辣椒4種病原真菌最小抑菌濃度和最小殺菌濃度Table 3 The minimal inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration of extracts from L. virgaurea against 4 fungal pathogens (g·L-1)

黃帚橐吾提取物對(duì)灰葡萄孢、尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和辣椒疫霉孢子萌發(fā)均有抑制活性，抑制活性作用大小與其濃度呈正相關(guān)，即濃度越大，抑制活性越強(qiáng)，不同濃度的抑制活性存在顯著性差異(P<0.05)，當(dāng)濃度為200 g·L-1時(shí)，孢子萌發(fā)抑制率在83%～97%，為60 g·L-1時(shí)，孢子萌發(fā)抑制率可達(dá)52%～69%，為20 g·L-1時(shí)，對(duì)灰葡萄孢、茄病鐮刀菌和辣椒疫霉的孢子萌發(fā)抑制率仍在46%～66%，但對(duì)尖孢鐮刀菌的孢子萌發(fā)抑制率僅為33.02%，較弱(表4)?；貧w分析得知，黃帚橐吾提取物對(duì)灰葡萄孢、尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和辣椒疫霉的孢子萌發(fā)抑制毒力存在明顯差異，對(duì)它們的半數(shù)抑制濃度EC50分別為15.05、55.26、57.86和16.50 g·L-1，對(duì)灰葡萄孢和辣椒疫霉抑制毒力最強(qiáng)，EC50均低于20 g·L-1，對(duì)尖孢鐮刀菌和茄病鐮刀菌抑制毒力相對(duì)較弱，EC50大于55 g·L-1(表5)。

表4 黃帚橐吾提取物對(duì)灰葡萄孢、尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和辣椒疫霉孢子萌發(fā)的抑制活性Table 4 The inhibition activity of extracts from L. virgaurea against spore germination of B. cinerea, F. oxysporum, F. solani and P. capsici (%)

表5 黃帚橐吾提取物對(duì)灰葡萄孢、尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和辣椒疫霉孢子萌發(fā)的抑制毒力Table 5 The inhibition toxicity of extracts from L. virgaurea against spore germination of B. cinerea, F. oxysporum, F. solani and P. capsici

2.5 黃帚橐吾提取物對(duì)辣椒種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)的影響

黃帚橐吾提取物對(duì)辣椒種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)均有抑制作用(表6)。黃帚橐吾提取物對(duì)辣椒種子發(fā)芽抑制作用較強(qiáng)，且與濃度呈正相關(guān)，5 g·L-1時(shí)開始顯現(xiàn)抑制作用，種子發(fā)芽率為83.33%，與空白對(duì)照之間存在顯著性差異(P<0.05)；50 g·L-1時(shí)，種子發(fā)芽率僅為15.00%，幾乎完全抑制。黃帚橐吾提取物對(duì)辣椒幼苗的根長(zhǎng)、株高和鮮重表現(xiàn)出不同的抑制強(qiáng)度，其中對(duì)根生長(zhǎng)的抑制作用最強(qiáng)，10 g·L-1時(shí)開始顯現(xiàn)顯著抑制作用，幼苗根長(zhǎng)為47.67 mm，與空白對(duì)照(幼苗根長(zhǎng)為66.60 mm)之間存在顯著性差異(P<0.05)；50 g·L-1時(shí)，幼苗根長(zhǎng)僅為16.00 mm，極顯著抑制。對(duì)幼苗株高和植株生物量的抑制作用相對(duì)較小，在50 g·L-1時(shí)才開始顯現(xiàn)顯著抑制作用，株高10.60 mm,平均鮮重33.73 mg·株-1，與空白對(duì)照(株高17.27 mm,平均鮮重44.93 mg·株-1)之間存在顯著性差異(P<0.05)?？傮w兼顧濃度低于20.00 g·L-1應(yīng)用將不影響植株生長(zhǎng)發(fā)育。

表6 黃帚橐吾提取物對(duì)辣椒種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響Table 6 Effects of extracts from L. virgaurea on seed germination and seedling growth of pepper

2.6 黃帚橐吾提取物對(duì)保護(hù)地辣椒4種真菌病害的防治效果

黃帚橐吾提取物對(duì)保護(hù)地辣椒灰霉病、枯萎病、根腐病和辣椒疫病均有顯著的預(yù)防效果，防治效果與其濃度呈正相關(guān)。稀釋50倍時(shí)，防治效果均在80%以上，與現(xiàn)用化學(xué)農(nóng)藥(陽(yáng)性對(duì)照)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。稀釋300倍時(shí)，防治效果為60%～80%，雖然與現(xiàn)用化學(xué)農(nóng)藥(陽(yáng)性對(duì)照)存在顯著差異(P<0.05)，但改用多次連續(xù)施藥仍可達(dá)到有效控制病害危害的目標(biāo)。稀釋500倍時(shí)，防治效果均在50%以下，無(wú)法達(dá)到控制病害危害的目的。對(duì)不同真菌病害黃帚橐吾提取物的預(yù)防效果強(qiáng)弱存在較大差異。對(duì)辣椒灰霉病和辣椒疫病預(yù)防效果最好，稀釋300倍時(shí)，防治效果仍可達(dá)到80.46%、78.63%，對(duì)辣椒枯萎病和根腐病預(yù)防效果稍弱一些，稀釋300倍時(shí)，防治效果分別為61.39%和63.35%，需要多次連續(xù)施藥，才可達(dá)到比較好的防治效果(表7)。黃帚橐吾提取物對(duì)保護(hù)地辣椒灰霉病、枯萎病、根腐病和辣椒疫病均有一定的治療效果，防治效果也與其濃度呈正相關(guān)，稀釋50倍時(shí)，防治效果均在75%以上，與現(xiàn)用化學(xué)農(nóng)藥(陽(yáng)性對(duì)照)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 稀釋100倍時(shí)，防治效果為68%～78%，與現(xiàn)用化學(xué)農(nóng)藥(陽(yáng)性對(duì)照)存在顯著差異(P<0.05)，但采用多次連續(xù)用藥可以控制病害進(jìn)一步危害。稀釋300倍時(shí)，防治效果大多數(shù)在50%以下，實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值降低。對(duì)于保護(hù)地辣椒4種真菌病害黃帚橐吾提取物的治療效果存在顯著差異，對(duì)辣椒灰霉病和辣椒疫病治療效果好，100倍稀釋的防治效果為78.04%和76.22%，300倍稀釋的防治效果為64.44%和62.41%，對(duì)辣椒枯萎病和根腐病治療效果相對(duì)較弱，100倍稀釋的防治效果分別為68.94%和70.84%，300倍稀釋液的防治效果均在55%以下，無(wú)法有效控制病情發(fā)展(表8)。黃帚橐吾提取物對(duì)保護(hù)地辣椒4種真菌病害的防治中，預(yù)防效果比治療效果更好。

3 討論

本研究黃帚橐吾有效成分的提取采用超聲波輔助有機(jī)溶劑提取法，提取率為9.48%，提取物主要包含萜類化合物、芳香族類化合物和生物堿類化合物。與前人的相關(guān)研究結(jié)果相比，提取率提高了一倍多， 提取物包含的化合物成分相對(duì)更復(fù)雜[47]。其主要原因一是提取方法改進(jìn),超聲波能使提取體系產(chǎn)生獨(dú)特的機(jī)械振動(dòng)作用和空化作用，黃帚橐吾結(jié)構(gòu)發(fā)生變化, 且形成高溫和高壓的環(huán)境, 同時(shí)伴隨有強(qiáng)大的沖擊波和微聲流, 從而破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu), 使其在瞬間破裂, 植物細(xì)胞內(nèi)的有效成分得以釋放，盡可能多的進(jìn)入溶媒中，從而提高提取率[48]。二是同一種植物，由于生境不同，有效成分及其含量差異較大，生態(tài)環(huán)境的植物多樣性越復(fù)雜越有利于有效成分積累不同種屬的病原微生物，其生物特性和結(jié)構(gòu)不同，抗性差異很大，同一植物源活性成分對(duì)不同病原真菌的生物活性作用必然存在極顯著差異[50]。本研究結(jié)果顯示黃帚橐吾提取物對(duì)保護(hù)地辣椒4種病原真菌—灰葡萄孢、尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和辣椒疫霉的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均有較強(qiáng)的抑制活性，且對(duì)不同病原菌的抑制活性強(qiáng)度有顯著差異，對(duì)它們菌絲生長(zhǎng)抑制率的EC50分別為11.93、51.25、19.93、13.84 g·L-1， 對(duì)孢子萌發(fā)抑制率的EC50分別為15.05、55.26、57.86、16.50 g·L-1。這一結(jié)果與其他人的相關(guān)研究類似，周麗[41]報(bào)道，黃帚橐吾乙醇提取物濃度為5 g·L-1時(shí)，對(duì)作物病原真菌稻瘟病菌、水稻紋枯病菌、玉米大斑病菌和小麥赤霉病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率有明顯差異，分別為45.36%、77.47%、90.16%和59.57%。陳琴等[51]報(bào)道，郁金莖葉醇提物對(duì)4種植物病原真菌的抑菌活性不同，其對(duì)油菜菌核菌、辣椒灰霉菌、小麥赤霉菌和山葵墨入菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率的EC50分別是1.6634、2.1653、2.9687和3.3164 g·L-1(浸膏含量)。[49]。

黃帚橐吾提取物中主要的生物活性物質(zhì)是倍半萜類化合物[52], Luo等[53]研究發(fā)現(xiàn)紅乳菇子實(shí)體的次級(jí)代謝產(chǎn)物Rufuslactone對(duì)云臺(tái)鏈格孢、禾谷鐮刀菌、葡萄孢菌和互隔交鏈孢霉等真菌菌絲都有一定的抑制活性，并且在同等劑量下，Rufuslactone對(duì)互隔交鏈孢霉的抑制活性明顯高于對(duì)照藥品多菌靈。劉曉漫[54]從紫莖澤蘭(Eupatoriumadenophora)葉片中分離得到了兩種杜松烷型倍半萜(9-羰基-10Hβ澤蘭酮和9-羰基-10,11去氫澤蘭酮)，它們均能較好地抑制細(xì)極鏈格孢、尖孢鐮刀、層出鐮刀、麥根腐平臍蠕孢和群結(jié)腐霉的菌絲生長(zhǎng)及尖孢鐮刀孢子萌發(fā)。曹坳程等[32]報(bào)道了二氫呋喃類倍半萜化合物對(duì)瓜果腐霉、辣椒疫霉、茄子立枯病菌、瓜類枯萎病菌、番茄灰霉等嚴(yán)重危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的病原真菌均有很好的抑制活性。本研究結(jié)果顯示，黃帚橐吾提取物對(duì)保護(hù)地辣椒真菌病害病原菌：灰葡萄孢、尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和辣椒疫霉的最小抑菌濃度分別為 1.50、1.75、1.83、0.83 g·L-1，最小殺菌濃度分別為2.50、11.67、10.00、2.67 g·L-1。溫室盆栽防效試驗(yàn)顯示，黃帚橐吾提取物對(duì)由上述病原真菌引發(fā)的辣椒灰霉病、枯萎病、根腐病和疫病防治效果顯著，100倍稀釋液對(duì)4種保護(hù)地辣椒真菌病害的預(yù)防效果均可達(dá)75%以上，治療效果也可達(dá)70%左右，與相應(yīng)常用化學(xué)農(nóng)藥(陽(yáng)性對(duì)照)防治效果不存在顯著性差異(P<0.05)。這證明本研究制備的黃帚橐吾提取物的主要抑菌活性物質(zhì)可能是倍半萜類化合物，這些倍半萜類化合物對(duì)上述真菌病害病原菌對(duì)辣椒植株的浸染和擴(kuò)展致病均有很大影響，從而達(dá)到了防控病菌進(jìn)一步繁殖危害的目的，是一種具備開發(fā)前景的生物殺菌劑優(yōu)質(zhì)資源。關(guān)于黃帚橐吾提取物對(duì)植物尤其是蔬果病原菌的抑菌報(bào)道很少，其抑菌譜、主要抑菌化合物及其抑菌機(jī)理等有待進(jìn)一步深入研究。

植物通過根系分泌、降雨淋溶、殘?bào)w分解和新陳代謝向土壤釋放化感物質(zhì)，對(duì)周圍其他植物產(chǎn)生有利或有害作用，使之處于生存競(jìng)爭(zhēng)的優(yōu)勢(shì)地位，以擴(kuò)大自己的生存空間和種群數(shù)量[55]。王明理[56]研究發(fā)現(xiàn)黃帚橐吾通過揮發(fā)和雨水淋溶等途徑向環(huán)境釋放化感物質(zhì)，增強(qiáng)其生存競(jìng)爭(zhēng)力和種群數(shù)量，可能是黃帚橐吾單優(yōu)勢(shì)種群落形成和造成草場(chǎng)退化的原因之一。這種物質(zhì)主要是黃帚橐吾揮發(fā)物，其對(duì)早熟禾(Poaannua)、大雀麥(Bromusmagnus)、中華羊茅(Festucasinensis)、羊茅(Festucaovina)和垂穗披堿草(Elymusnutans)種子的萌發(fā)速度指數(shù)和最終萌發(fā)率均產(chǎn)生抑制作用，且牧草種子萌發(fā)期對(duì)黃帚橐吾化感作用的敏感性高于幼苗生長(zhǎng)期。而本研究制備的黃帚橐吾提取物也含有大量揮發(fā)性活性成分，為了安全高效用藥，研究了其對(duì)辣椒種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，高濃度時(shí)，即浸膏濃度大于20 g·L-1，黃帚橐吾提取物明顯抑制辣椒種子發(fā)芽率和幼苗生長(zhǎng)，其中對(duì)種子發(fā)芽影響更大。這一結(jié)果與王明理[56]的研究結(jié)果吻合。因此，在黃帚橐吾提取物作為農(nóng)用生物殺菌劑開發(fā)應(yīng)用時(shí)，應(yīng)避開被保護(hù)植物種子發(fā)芽期，幼苗期應(yīng)用時(shí)避免高濃度根施。關(guān)于具體的應(yīng)用技術(shù)還應(yīng)依據(jù)不同的被保護(hù)植物和應(yīng)用環(huán)境進(jìn)一步探討。另外，黃帚橐吾提取物作為農(nóng)藥開發(fā)時(shí)，在研究其對(duì)目標(biāo)有害生物的毒力效果外，還應(yīng)該充分考慮其應(yīng)用安全性，即對(duì)人畜、天敵、環(huán)境、被保護(hù)植物等的安全性。本課題組前期研究顯示，黃帚橐吾提取物浸膏對(duì)小鼠的經(jīng)皮急性毒性LD50>30 g·kg-1，經(jīng)口急性毒性LD50為6.9831 g·kg-1，符合低毒農(nóng)藥登記的毒性標(biāo)準(zhǔn)，屬于低微毒類，合理應(yīng)用對(duì)人畜是安全的。萜類化合物遇光、熱易分解，而黃帚橐吾提取物浸膏中萜類化合物占79.53%，因此在應(yīng)用過程中不會(huì)對(duì)環(huán)境和食品造成蓄積危害。關(guān)于對(duì)天敵毒性以及亞慢性毒性試驗(yàn)還有待進(jìn)一步研究探討。

4 結(jié)論

對(duì)黃帚橐吾有機(jī)溶劑提取物對(duì)保護(hù)地辣椒4種病原真菌的抑制活性及其所引發(fā)病害的防控效果以及對(duì)辣椒種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響研究表明，黃帚橐吾有機(jī)溶劑提取物對(duì)灰葡萄孢、尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和辣椒疫霉均有顯著的抑制活性，抑制活性強(qiáng)度與其濃度呈正相關(guān)，對(duì)各病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制率和孢子萌發(fā)抑制率不同，對(duì)灰葡萄孢菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)抑制最強(qiáng)，其次為辣椒疫霉和茄病鐮刀菌，對(duì)尖孢鐮刀菌相對(duì)較弱，但仍能達(dá)到控制病害發(fā)展的目標(biāo)。對(duì)4種病原真菌引發(fā)的辣椒灰霉病、枯萎病、根腐病和疫病的防治效果可達(dá)70%以上，與相應(yīng)常用化學(xué)農(nóng)藥防效相當(dāng)。但其對(duì)辣椒種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)有一定的抑制作用，濃度大于20 g·L-1時(shí)，對(duì)種子萌發(fā)和幼苗株高、根長(zhǎng)和生物量的影響會(huì)波及辣椒正常生產(chǎn)，在應(yīng)用開發(fā)中應(yīng)結(jié)合其對(duì)4種病原真菌抑制活性的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度，研究科學(xué)合理的應(yīng)用技術(shù)，最大可能發(fā)揮黃帚橐吾有機(jī)溶劑提取物作為一種廣譜生物殺菌劑新資源的優(yōu)勢(shì)。

參考文獻(xiàn)References：

[1] Chen Y, Ji M S, Liu C Y,etal. Fungicides screening and pot experiment for pepper root rot disease control. Agrochemicals, 2008, 47(7): 523-527.

陳彥, 紀(jì)明山, 劉長(zhǎng)遠(yuǎn), 等. 防治辣椒根腐病殺菌劑篩選及盆栽藥效試驗(yàn). 農(nóng)藥, 2008, 47(7): 523-527.

[2] Xue Q H, Yang F M, Wang Z Q. Main diseases and their comprehensive prevention and control of protect the pepper. Northern Horticulture, 2000, 134: 38-39.

薛慶華, 楊鳳梅, 王志強(qiáng). 保護(hù)地辣椒主要病害及其綜合防治. 北方園藝, 2000, 134: 38-39.

[3] Xu Q L, Chen S A, Chen L,etal. The kinds of capsicum root disease occurs and the symptoms in China. Changjiang Vegetables, 2015, 15: 51-54.

徐巧玲, 陳世安, 陳璐, 等. 我國(guó)辣椒根部病害發(fā)生的種類及癥狀. 長(zhǎng)江蔬菜, 2015, 15: 51-54.

[4] Sui Y H, Hu N B, Zhang Z X,etal. The identification of pathogens with four diseases of pepper and resistance cluster analysis of 26 chili germplasm. Seed, 2013, 32(6): 59-63.

隋益虎, 胡能兵, 張子學(xué), 等. 辣椒4 種病害病原鑒定及26份種質(zhì)資源的抗性聚類分析. 種子, 2013, 32(6): 59-63.

[5] Li Q F, Zhao C M, Yu G Z,etal. Study on ecological prevention and control technology about soil-borne disease of vegetable. Northern Horticulture, 2011, (14): 192-194.

李清飛, 趙承美, 余國(guó)忠, 等. 蔬菜土傳病害生態(tài)防控技術(shù)研究. 北方園藝, 2011, (14): 192-194.

[6] Wu Z M, Yu Z R, Lu L H,etal. Diagnosis and comprehensive prevention and control measures for soil-borne diseases of protected vegetables. Journal of Anhui Agricultural, 2013, 41(31): 12320-12321, 12323.

武澤民, 于振茹, 盧立華, 等. 設(shè)施蔬菜土傳病害的診斷與綜合防控措施. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 41(31): 12320-12321, 12323.

[7] Zheng L, Lü R, Hsiang T,etal. Host range and phytotoxicity ofStemphyliumsolani, causing leaf blight of garlic (Alliumsativum) in China. European Journal of Plant Pathology, 2009, 124(1): 21-30.

[8] Zheng L, Huang J, Hsiang T. First report of leaf blight of garlic (Alliumsativum) caused byStemphyliumsolaniin China. Plant Pathology, 2008, 57(2): 380.

[9] Zhao M L, Zhang R G, Luo X Q. The occurrence and prevention of pepperBotrytiscinereain the little tunnel seedling in winter. Agricultural Technology, 2008, 25(8): 51.

趙滿亮, 張仁剛, 羅向瓊. 辣椒灰霉病在冬季小拱棚育苗中的發(fā)生與防治. 農(nóng)技服務(wù), 2008, 25(8): 51.

[10] Shen A M, Zhao X M. Pepper production and prospect in China. Bulletin of Agricultural Science and Technology, 2010, (6): 5-7.

申愛民, 趙香梅. 我國(guó)辣椒生產(chǎn)概況及發(fā)展方向. 農(nóng)業(yè)科技通訊, 2010, (6): 5-7.

[11] Wang L L. Status quo and developmental strategy of hot pepper production and research in Gansu province. Journal of China Capsicum, 2015, (4): 1-3.

王蘭蘭. 甘肅省辣椒生產(chǎn)與科研現(xiàn)狀及發(fā)展對(duì)策. 辣椒雜志, 2015, (4): 1-3.

[12] Chen Z F, Wang W Q, Han X Y,etal. Review of chemical control of gray mould and fungicide resistance ofBotrytiscinerea. Journal of Hebei Agricultural Sciences, 2010, 4(8): 19-23.

陳治芳, 王文橋, 韓秀英, 等. 灰霉病化學(xué)防治及抗藥性研究進(jìn)展. 河北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 4(8): 19-23.

[13] Liu F. Occurrence and control technology of pepperBotrytiscinereain protected areas. Hubei Agricultural Sciences, 2010, 49(3): 587-589.

劉峰. 保護(hù)地辣椒灰霉病發(fā)生規(guī)律與防治技術(shù)初探. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 49(3): 587-589.

[14] Ma J Y, Zhang X F, Wang W Q,etal. The sensitivity ofBotrytiscinereato SYP-Z480 and cross resistance against diverse fungicides. Journal of Plant Protection, 2009, 36(1): 61-65.

馬建英, 張小風(fēng), 王文橋, 等. 灰葡萄孢霉(Botrytiscinerea)對(duì)啶菌惡唑的敏感性和不同殺菌劑的交互抗性. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2009, 36(1): 61-65.

[15] Rosslenbroich H J, Stuebler D.Botrytiscinerea-history of chemical control and novel fungicides for its management. Crop Protect, 2000, 19(8): 557-561.

[16] Ma L P, Hao B Q, Wang J,etal. Efficacy of an antagonist strain B96-Ⅱ against chili pepper diseases and its growth promoting effects. Journal of Shanxi Agricultural Sciences, 2013, 41(10): 1108-1111.

馬利平, 郝變青, 王靜, 等. B96-Ⅱ發(fā)酵液對(duì)辣椒病害的防治及對(duì)植株的促生效果. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 41(10): 1108-1111.

[17] Liu G K, Chen Q J, Wu Z J,etal. Inhibition of plant extracts against plant pathogenic fungi. Journal of Fujian Agriculture and Forestry University (Natural Science Edition), 2004, 33(3): 295-299.

劉國(guó)坤, 陳啟建, 吳祖建, 等. 幾種植物提取物對(duì)4 種植物病原真菌的抑制作用. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2004, 33(3): 295-299.

[18] Wang J B. Review of pepper industrial status and development trend in China. Auhui Agricultural Science Bulletin, 2013, 19: 64-78.

王繼榜. 我國(guó)辣椒產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)綜述. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào), 2013, 19: 64-78.

[19] Wu Y, Li H Q, Qiao X,etal. Optimization of ferment conditions of pepper wilt antagonistic bacterium strain Ljb002. Journal of Microbiology, 2015, 35(5): 67-72.

吳月, 李海群, 喬雪, 等. 辣椒枯萎病拮抗細(xì)菌Ljb002 菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化. 微生物學(xué)雜志, 2015, 35(5): 67-72.

[20] Zhou Q, Li B T, Tang L M. A study on fungicidal activity of allicin againstColletotrichumcapsiciandPhytophthoracapsiciin the laboratory and its efficacy in the field. Acta Prataculturae Sinica, 2014, 23(3): 262-268.

周清, 李保同, 湯麗梅. 大蒜素對(duì)辣椒炭疽病和辣椒疫病病菌的室內(nèi)抑制活性測(cè)定及田間防效研究. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2014, 23(3): 262-268.

[21] Li S M. Biological control of sollborn phythopathogens includingRalstonasolanacearum,Phytophthoracapsici, andMeloidogyneincognitaon pepper and tomato. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2008.

李師默. 辣椒和番茄青枯病等土傳病害的生物防治研究. 南京: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2008.

[22] Yuan G Q, Li Q Q, Wang J,etal. Advances in researches on plant germicides Ⅱ: Methods for determining antimicrobial activity, active metabolites and their application. Guangxi Agricultural Sciences, 2010, 41(2): 136-140.

袁高慶, 黎起秦, 王靜, 等. 植物源殺菌劑研究進(jìn)展Ⅱ: 活性測(cè)定、活性物質(zhì)及其應(yīng)用. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 41(2): 136-140.

[23] Ma X, Qiao J Q. Antifungal activity of Chinese herbal extracts against soil-borne pathogenic fungi of vegetables. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2015, 43(6): 113-115.

馬欣, 喬俊卿. 中草藥提取物對(duì)蔬菜土傳病原真菌的抑制作用. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 43(6): 113-115.

[24] Liu H Y, Gao W W, Fan Y. Advances in research and development of the botanical fungicide. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2005, (4): 254-257.

劉海燕, 高微微, 樊瑛. 植物源殺菌劑的研究進(jìn)展. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2005, (4): 254-257.

[25] Wu C W, Du X F, Xu J M,etal. Research advances in natural antibacterial constituents from plant origin. Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica, 2004, 13(3): 81-88.

吳傳萬(wàn), 杜小鳳, 徐建明, 等. 植物源抑菌活性成分研究新進(jìn)展. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2004, 13(3): 81-88.

[26] Zhang X, Ma Z Q, Feng J T,etal. Review on research and development of botanical pesticides. Chinese Journal of Biological Control, 2015, 31(5): 685-698.

張興, 馬志卿, 馮俊濤, 等. 植物源農(nóng)藥研究進(jìn)展. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào), 2015, 31(5): 685-698.

[27] Zhu H, Song J X, Zhao Y D,etal. Antifungal activity of extracts from eleven plants onBotrytiscinereain pepper. Anhui Agriculture Science, 2010, 16(10): 191-194.

朱虹, 宋僅星, 趙亞東, 等. 11種植物提取物對(duì)辣椒灰霉菌的抑菌活性及應(yīng)用評(píng)價(jià). 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào), 2010, 16(10): 191-194.

[28] Feng J T, Han L R, Fan R J,etal. Effects of cuminic acid on the growth and development ofPhytophthoracapsiciLeonian. Scientia Agricultura Sinica, 2012, 45(13): 2628-2635.

馮俊濤, 韓立榮, 范瑞娟, 等. 枯茗酸對(duì)辣椒疫病菌生長(zhǎng)發(fā)育的影響. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 45(13): 2628-2635.

[29] Miao J Q, Wang M, Li X H. Antifungal and nematicidal activities of five volatile compounds against soil-borne pathogenic fungi and nematodes. Journal of Plant Protection, 2012, 39(6): 561-566.

苗建強(qiáng), 王猛, 李秀環(huán). 五種揮發(fā)性化合物對(duì)土傳病原真菌及線蟲的生物活性. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2012, 39(6): 561-566.

[30] Zheng Y Y. Antibacterial activity ofSophoraflavescensextracts against pepper blight (Fusariumoxysporum). Plant Diseases and Pests, 2011, 2(3): 59-61.

[31] Jiao X L, Du J, Bi X B,etal. Effect of phenolic acid and ginsenosides in american ginseng on the growth of pathogenic fungi. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2015, 31(17): 105-110.

焦曉林, 杜靜, 畢曉寶, 等. 西洋參中酚酸及皂苷成分對(duì)病原菌的作用. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2015, 31(17): 105-110.

[32] Cao A C, Zhang X C, Guo M X,etal. Determining microbial inhibitory activity of sesquiterpenoids. Chinese Journal of Pesticides, 2005, 44(1): 37.

曹坳程, 張向才, 郭美霞, 等. 倍半萜類化合物的抑菌活性. 農(nóng)藥, 2005, 44(1): 37.

[33] Manici L, Lazzeri L, Palmieri S.Invitrofungi toxic activity of some glucosinolates and their enyme-derived productstoward plant pathogentic fungi. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1997, 45: 3768-3773.

[34] Hu Y C, Liu P, Wang J H,etal. The preliminary investigation report on ecological distribution of main poisonous plants in Sichuan province. Chinese Journal of Grassland, 2009, 31(1): 80-85.

胡延春, 劉鵬, 王建華, 等. 四川省主要有毒植物的生態(tài)分布. 中國(guó)草地學(xué)報(bào), 2009, 31(1): 80-85.

[35] Ma R J, Wang M L, Zhao K,etal. Allelopathy of aqueous extract fromLigulariavirgaureaa dominant weed in psychro-grassland on pasture plants. Chinese Journal of Applied Ecology, 2006, 17(5): 845-850.

馬瑞君, 王明理, 趙坤, 等. 高寒草場(chǎng)優(yōu)勢(shì)雜草黃帚橐吾水浸液對(duì)牧草的化感作用. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2006, 17(5): 845-850.

[36] Ma R J, Wang M L, Zhu X T,etal. Allelopathy and chemical constituents ofLigulariavirgaureavolatile. Chinese Journal of Applied Ecology, 2005, 16(10): 1826-1829.

馬瑞君, 王明理, 朱學(xué)泰, 等. 黃帚橐吾揮發(fā)物的化感作用及其主要成分分析. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2005, 16(10): 1826-1829.

[37] Liu J X, Li J, Li N,etal. Bioactivity of ethanol extracts ofLigulariavirgaureaagainstHelicoverpaarmigera. Plant Protection, 2015, 41(4): 191-199.

劉錦霞, 李晶, 李娜, 等. 黃帚橐吾乙醇提取物對(duì)棉鈴蟲的生物活性. 植物保護(hù), 2015, 41(4): 191-199.

[38] Hu G F, Liu M Y, Li Y Q,etal. Antifeeding and contact effects on extracts from 30 kinds of poisonous plants in natural grassland of Gansu Province against larva ofPierisrapae. Acta Prataculturae Sinica, 2011, 20(5): 169-176.

胡冠芳, 劉敏艷, 李玉奇, 等. 甘肅天然草地30種有毒植物提取物對(duì)菜粉碟幼蟲的拒食和觸殺作用研究. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2011, 20(5): 169-176.

[39] Wang X L, Li Q, Yang Y J,etal. Analysis of volatile constituent and reach of activity of plants of the genusLigularia. Journal of Chinese Medicinal Materials, 2014, 37(6): 1005-1011.

王曉麗, 李強(qiáng), 楊永建, 等. 橐吾屬植物揮發(fā)油成分分析及活性研究. 中藥材, 2014, 37(6): 1005-1011.

[40] Zheng B. Study on the chemical constituents and antibacterial activity ofLigulariafischeri. Lanzhou: Lanzhou Jiaotong University, 2014.

鄭斌. 蹄葉橐吾化學(xué)成分及其抑菌活性研究. 蘭州: 蘭州交通大學(xué), 2014.

[41] Zhou L. The bioactivity study of poisonous plants from grassland against pathogenic germs. Chengdu: Sichuan University, 2007.

周麗. 高原草地有毒植物對(duì)植物病原菌抑菌活性的初步研究. 成都: 四川大學(xué), 2007.

[42] Shen J L. Bioassay of pesticide. Beijing: China Agriculture Press, 2013: 79-87.

沈晉良. 農(nóng)藥生物測(cè)定. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2013: 79-87.

[43] Gulluce M, Sahin F, Sokmen M,etal. Antimicrobial and antioxidant properties of the essential oils and methanol extract fromMenthalongifoliaL. ssp.longifolia. Food Chemistry, 2007, 103: 1449-1456.

[44] Xu J Q, Qi J M, Gao L,etal. Effects of colchicine treatment on the seed germination and seedling growth ofBauhiniavariegate. Forestry and Environmental Science, 2017, 33(1): 63-67.

徐佳琦, 戚嘉敏, 高樂, 等. 秋水仙素對(duì)洋紫荊種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響. 林業(yè)與環(huán)境科學(xué), 2017, 33(1): 63-67.

[45] Yi Y T, Zhang B X, Xie B Y,etal. Comparation of three inoculation methods forPhytophthorablight resistance. China Vegetables, 2003, (2): 16-18.

易永圖, 張寶璽, 謝丙炎, 等. 辣椒疫病三種接種方法的比較. 中國(guó)蔬菜, 2003, (2): 16-18.

[46] Biological Testing Department of Institute for the Control of Agrochemicals. Pesticide-guidelines for the field efficacy trials. Beijing: Standards Press of China, 2000: 190-193.

農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所生測(cè)室. 農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2000: 190-193.

[47] Sun X B. Studies on the chemical constituents ofPolveommbistortaandLigulariavigaurea. Lanzhou: Lanzhou University, 2007.

孫曉白. 拳參和黃帚橐吾化學(xué)成分研究. 蘭州: 蘭州大學(xué), 2007.

[48] Zhu X P. Application of ultrasonic extraction of active ingredients in natural products. Storage and Process, 2012, 2(2): 43-45.

朱新鵬. 超聲波在天然產(chǎn)物活性成分提取中的應(yīng)用. 保鮮與加工, 2012, 2(2): 43-45.

[49] Sun Y. Relation of active ingredients ofTripterygiumwilfordiihook and environmental effect. Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University, 2012.

孫艷. 雷公藤有效成分與環(huán)境效應(yīng)的關(guān)系. 福州: 福建農(nóng)林大學(xué), 2012.

[50] Li Y P. Studes on fungicidical activity of compositae abstract. Yangling: Northwest Agriculture and Forestry University, 2001.

李玉平. 菊科植物殺菌活性系統(tǒng)篩選的初步研究. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2001.

[51] Chen Q, Liu Q Y, Chen C Q,etal. Antifugal activity and stems GC/MS analysis of extracts fromCurcumaphaeocaulisstems and leaves against plant pathogenic fungi. Journal of Sichuan University (Natural Science Edition), 2017, 54(1): 209-214.

陳琴, 劉慶亞, 陳次瓊, 等. 郁金莖葉提取物抑殺植物病原真菌活性研究與GC/MS分析. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2017, 54(1): 209-214.

[52] Zhang Z X. Studies on the chemical constituents and their bioactivities of three Comnnsitae and one Scronhulariaceae species. Lanzhou: Lanzhou University, 2008.

張占欣. 三種菊科植物和一種玄參科植物化學(xué)成分及其生物活性研究. 蘭州: 蘭州大學(xué), 2008.

[53] Luo D Q, Wang F, Bian X Y,etal. Rufuslactone, a new antifungal sesquiterpene from the fruiting bodies of the basidiomyceteLactariusrufus. Journal of Antibiotics, 2005, 58(7): 456-459.

[54] Liu X M. Antimicrobial activity, mechanism against pathogen and hydrolysis of sesquiterpenoids fromEupatoriurnadenophorumSpreng. Beijing: Chinese Academy of Agricultural Sciences, 2016.

劉曉漫. 紫莖澤蘭中倍半萜化合物的抗菌活性作用機(jī)理及水解規(guī)律研究. 北京: 中國(guó)農(nóng)化科學(xué)院, 2016.

[55] Gao X X, Li M, Gao Z J,etal. The releasing mode of the allelochemicals inConyzacanadesisL. Acta Ecologica Sinica, 2010, 30(8): 1966-1971.

高興祥, 李美, 高宗軍, 等. 外來(lái)入侵植物小飛蓬化感物質(zhì)的釋放途徑. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2010, 30(8): 1966-1971.

[56] Wang M L. Allelopathy of the dominant noxious weedLigulariavirgaureaon pasture plants in psychro-grasslands. Lanzhou: Northwest Normal University, 2006.

王明理. 高寒草場(chǎng)優(yōu)勢(shì)毒雜草黃橐帚吾對(duì)牧草化感作用的研究. 蘭州: 西北師范大學(xué), 2006.