杜海燁，康娜娜，成莎，渠云芳，黃晉玲

(山西農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，山西 太谷 030801)

棉花是一種栽培歷史悠久且經(jīng)濟回報高的作物。我國是世界上最大的棉花生產(chǎn)國和消費國，提高棉花產(chǎn)量與品質(zhì)面臨重大問題。植物抗氧化酶系統(tǒng)中最重要的3種酶SOD、POD和CAT在細胞內(nèi)抗氧化功能各不相同[1](圖1)，且其作為清除細胞活性氧自由基(ROS)進而影響植物生長發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素之一[2]，近年來被很多人作為切入點研究棉花受水澇干旱脅迫[3]、鹽脅迫[4]病害脅迫[5]等的抗逆性。此外抗氧化酶還影響著棉纖維初生壁非纖維素多糖類物質(zhì)合成[6]。而MDA作為細胞呼吸導致的膜脂過氧化產(chǎn)物，從側(cè)面反映著細胞的呼吸活性與抗逆性[7]。

圖1 抗氧化酶系統(tǒng)清除ROS過程Fig.1 The cleanning process from the antioxidant enzyme system to ROS

棉鈴作為一個有機整體，在鈴殼、棉籽和纖維的各器官中進行著物質(zhì)及信號分子的運輸，對整體研究棉花纖維發(fā)育具有重要作用[8]。棉纖維的伸長與棉鈴的增大相吻合。從開花起，經(jīng)20～30 d棉花纖維伸長接近最大長度，其中花后5～20 d是纖維伸長的關(guān)鍵階段，直接影響棉纖維的長度。本文以葉色不同的一對棉花近等基因系為研究材料，以棉鈴各器官為研究對象，對其棉纖維伸長階段抗氧化酶活性以及MDA含量變化進行研究，以期為棉花纖維品質(zhì)改良提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選用的材料為葉色不同的一對棉花近等基因系：綠葉、無毛、白絮、棕籽(簡稱綠葉棉)和紅葉、無毛、白絮、棕籽(簡稱紅葉棉)。該對近等基因系來自于亞洲棉(Gossypiumarboreum)×比克氏棉(G.bickii)×陸地棉(G.hirsutum) 3種雜種后代，由山西農(nóng)業(yè)大學棉花育種實驗室提供。

參試材料于2016年4月在山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)作站種植。每個材料種植2行，采用常規(guī)的栽培管理措施進行管理。在棉花開花盛期(7月25號)對參試材料同一果枝同一節(jié)位當天所開花進行掛牌標記，并于花后10 d與20 d取2種參試材料不同棉株相同部位棉鈴各30個，每10個為一次重復，重復3次。每一棉鈴分為鈴殼、棉籽、棉纖維3部分，液氮速凍后儲存于-80 ℃冰箱。

1.2 試驗方法

采用NBT(氮藍四唑)光還原法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性[9]，在560 nm波長下進行比色測定；采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶(POD)活性[9]，在波長470 nm處進行測定，記錄吸光度值。酶活性大小以每分鐘OD的變化值來表示，其單位為△OD470·g-1FW·min-1；采用高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶(CAT)活性[10]，酶活性用每克樣品鮮重1 min內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示；采用硫代巴比妥法測定丙二醛(MDA)含量[9]，在450 nm、532 nm和600 nm處測定其吸光度值，參比為0.5%的硫代巴比妥。

采用分梳法，隨機取10粒籽棉將纖維梳直，測定棉纖維長度；取100粒籽棉分別將纖維和棉籽稱重計算衣分衣指。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測定數(shù)據(jù)均采用3次重復均值，使用Excel對數(shù)據(jù)進行t檢驗方差分析；使用SPSS對纖維發(fā)育指標與測定的各項指標進行Pearson雙尾檢測相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SOD酶活性

棉纖維快速伸長階段，綠葉棉棉鈴各器官中SOD酶活性呈現(xiàn)顯著上升趨勢，且在鈴殼和棉纖維中分別上升了50.6%和287%，達到了極顯著差異水平；紅葉棉的鈴殼和棉籽中SOD酶活性也呈現(xiàn)上升趨勢，但在棉纖維中SOD酶活性下降了32%，呈現(xiàn)顯著下降趨勢(圖2)。隨著棉纖維的伸長發(fā)育，棉鈴各器官氧化呼吸作用增強，細胞內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS。因此，棉鈴的正常發(fā)育需要更高的SOD酶活性。

圖2 纖維伸長期2種參試材料棉鈴各組織SOD酶活性Fig.2 SOD activity of two materials during fiber elongation periods注：圖中小寫字母表示在5%水平上差異；大寫字母表示1%水平上差異，下同Note:Lowercase letters in the figure indicate differences at the 5% level; capital letters represent 1% level difference，The same below

花后10 d，綠葉棉鈴殼中SOD酶活性高于紅葉棉且未達到差異水平(P>0.05)；棉籽和棉纖維中SOD酶活性低于紅葉棉，且纖維中酶含量差異顯著?；ê?0 d，綠葉棉鈴殼和纖維中SOD酶活性極顯著高于紅葉棉，棉籽中紅葉棉極顯著高于綠葉棉(圖3)。從花后10 d到20 d，隨著棉纖維的快速伸長，綠葉棉的鈴殼和纖維中SOD酶活性顯著高于紅葉棉，這可能是綠葉棉鈴殼和纖維的細胞具有比紅葉棉更為活躍的呼吸氧化活動。

圖3 纖維伸長期棉鈴各組織SOD活性的變化Fig.3 Changes of SOD activity in different tissues of cotton bolls during fiber elongation

2.2 POD酶活性

棉纖維快速伸長階段，2種參試材料棉鈴各器官中(除紅葉棉纖維外)POD酶活性逐漸上升，且在紅葉棉的鈴殼中上升了263%，差異極顯著(圖4)。在棉鈴發(fā)育的相應時期，SOD酶活性升高導致細胞內(nèi)超氧陰離子增加，相應升高的POD酶活性提高了對細胞內(nèi)超氧陰離子的清除能力。

圖4 纖維伸長期2種參試材料棉鈴各組織POD酶活性Fig.4 POD activity of two materials during fiber elongation periods

棉花開花后10 d和20 d兩個階段，綠葉棉棉鈴各器官中POD酶活性均高于紅葉棉同一器官，且鈴殼中POD酶活性在花后10 d達到極顯著差異，在花后20 d達到顯著差異水平；棉纖維中POD酶活性僅在花后20 d達到極顯著差異水平；而棉籽中POD酶活性差異在兩個時期均沒有達到顯著水平(圖5)。POD參與植物體內(nèi)多種生理活動，是H2O2的分解劑和解毒物，防止植物細胞受到氧脅迫，綠葉棉中較高的POD酶活性可能與綠葉棉較高的抗逆性有關(guān)。

圖5 纖維伸長期棉鈴各組織POD活性的變化Fig.5 Changes of POD activity in different tissues of cotton bolls during fiber elongation

2.3 CAT酶活性

棉纖維快速伸長階段，兩種參試材料棉纖維中CAT酶活性均呈現(xiàn)下降趨勢，且在紅葉棉纖維中下降了36%，差異極顯著；在鈴殼和棉籽中變化趨勢不同：綠葉棉鈴殼與紅葉棉的棉籽呈現(xiàn)下降趨勢；綠葉棉的棉籽與紅葉棉的鈴殼中呈現(xiàn)上升趨勢(圖6)。

圖6 纖維伸長期2種參試材料棉鈴各組織CAT酶活性Fig.6 CAT activity of two materials during fiber elongation periods

花后10 d，綠葉棉的鈴殼與纖維中的CAT酶活性均顯著高于紅葉棉且在鈴殼中達到極顯著差異水平，棉籽中紅葉棉CAT酶活性極顯著高與綠葉棉；花后20 d，綠葉棉的棉籽與纖維中CAT酶活性顯著高于紅葉棉，且棉籽中達到極顯著差異水平，鈴殼中紅葉棉CAT酶活性極顯著高與綠葉棉(圖7)。

圖7 纖維伸長期棉鈴各組織CAT活性的變化Fig.7 Changes of SOD activity in different tissues of cotton bolls during fiber elongation

2.4 MDA含量

與花后10 d相比，花后20 d綠葉棉鈴殼和纖維中MDA含量分別下降了26%和53%，呈現(xiàn)顯著降低，而棉籽中MDA含量則略有升高。棉纖維伸長時期，紅葉棉棉鈴同一器官中MDA含量變化趨勢與綠葉棉相同，但紅葉棉纖維顯著降低，而棉籽中MDA含量顯著升高(圖8)。棉籽中升高的MDA含量推測與棉籽發(fā)育過程中較強烈的氧化呼吸作用導致膜脂過氧化程度升高有關(guān)聯(lián)。

圖8 纖維伸長期2種參試材料棉鈴各組織MDA含量Fig.8 MDA content in two different materials during fiber elongation periods

棉纖維伸長發(fā)育的不同階段，綠葉棉棉鈴各器官MDA含量均低于紅葉棉同一階段的相同器官的含量。 2種材料除花后10 d的鈴殼與纖維中MDA含量差異顯著外，其他器官之間MDA含量差異均沒有顯著差異，且MDA含量在鈴殼和棉籽中含量較高，纖維中含量較低(圖9)。MDA含量是植物細胞膜脂過氧化程度的直接反映，棉纖維伸長的不同階段，紅葉棉棉鈴各器官中MDA含量高于綠葉棉，由此可推測紅葉棉的膜脂過氧化強度較高。

圖9 纖維伸長期棉鈴各組織MDA含量的變化Fig.9 Changes of MDA content in different tissues of cotton bolls during fiber elongation

2.5 2種參試材料的品質(zhì)考察

參試的2種棉花，除百粒籽重外，綠葉棉的百粒籽重、衣指、衣分、纖維的均長均高于紅葉棉(表1)。

表1 棉花品質(zhì)測定Table 1 Determination of cotton quality

2.6 棉鈴各項酶活指標與纖維發(fā)育相關(guān)性分析

對棉鈴不同發(fā)育階段各器官的酶活性與纖維發(fā)育指標進行相關(guān)性分析(表2)，結(jié)果表明棉纖維伸長發(fā)育與SOD、POD和CAT酶活性以及MDA含量具有顯著的相關(guān)性，但棉鈴不同器官以及棉纖維發(fā)育的不同時期各器官的酶活指標與纖維發(fā)育的相關(guān)性大小不同。鈴殼與棉纖維中各項酶活指標與棉纖維的伸長發(fā)育顯著相關(guān)，且鈴殼中花10 d的SOD酶活性和花后20 d的CAT酶活性以及花后10 d棉纖維中的SOD酶活性與棉纖維的伸長發(fā)育呈顯著負相關(guān)；花后20 d棉籽中的SOD酶活性和CAT酶活性與纖維發(fā)育顯著相關(guān)，且CAT酶活性與纖維發(fā)育呈顯著負相關(guān)；棉鈴各器官中MDA含量與棉纖維發(fā)育均呈現(xiàn)負相關(guān)，且花鈴期纖維中達顯著水平。

表2 各項指標與纖維發(fā)育相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between fiber quality and each index of cotton

注：表中*表示在5%水平上差異；**表示1%水平上差異。

Note：* Indicates a difference at the 5% level;**indicates a 1% level difference.

3 討論

3.1 抗氧化酶活性與棉纖維發(fā)育相關(guān)性分析

氧作為植物體內(nèi)重要的電子受體參與植物多種生命活動，但其接受來自葉綠體和線粒體電子傳遞鏈泄露的電子則會形成ROS[11]?；钚匝踝杂苫兄妊醺鼮榛顫姷幕瘜W反應性，會對植物細胞產(chǎn)生氧化脅迫性[12]。長期以來，ROS被視為脅迫代謝的有害產(chǎn)物[13]。但是近年來眾多研究發(fā)現(xiàn)ROS還能作為信號分子行使調(diào)控作用[14]，尤其是H2O2可以輕易穿越細胞膜且半衰期較長的特性，使得H2O2在植物發(fā)育的許多過程中充當信號分子[15,16]。植物體內(nèi)，在ROS清除的過程中SOD酶將超氧陰離子(O2-)還原成過氧化氫(H2O2)；POD和CAT在細胞內(nèi)分別將過氧化氫還原成羥基自由基和水，這說明POD和CAT競爭共同底物過氧化氫，并且ROS在引起生物毒性的同時也促進著多糖的代謝[17]。而羥基自由基被認為可以增加細胞壁延伸性，使細胞伸長生長[18]；同時羥基自由基也介導生長素的產(chǎn)生，間接促進細胞伸長生長[19]。

本研究中，在棉纖維伸長發(fā)育階段，一方面，綠葉棉纖維中具有POD活性上升，CAT活性下降的趨勢；紅葉棉纖維中則呈現(xiàn)POD酶活性和CAT酶活性共同緩慢下降趨勢。綠葉棉纖維中較高的POD酶活性有利于羥基自由基的積累，而較高的羥基自由基含量對于纖維細胞的伸長生長具有促進作用，從而影響棉纖維長度。另一方面棉纖維的發(fā)育是鈴殼、棉籽和纖維協(xié)同發(fā)育的共同結(jié)果。鈴殼中POD酶活性與棉纖維長度呈現(xiàn)顯著正相關(guān)[8]。2種參試材料鈴殼中SOD與POD酶活性的上升，而CAT變化趨勢的不同，這可能導致綠葉棉羥基自由基在棉鈴中更多的積累。而由考種數(shù)據(jù)可知，與紅葉棉相比，綠葉棉的纖維較長，這可能與其在棉纖維伸長發(fā)育時期較高的羥基自由基含量有關(guān)。對棉鈴中活性氧代謝產(chǎn)物含量變化的后續(xù)研究，將為闡明抗氧化酶對棉花纖維長度的影響機制提供依據(jù)。

3.2 MDA含量與棉鈴發(fā)育相關(guān)性分析

活性氧不僅是有氧代謝的副產(chǎn)物，而且在環(huán)境脅迫下也能大量形成[20]。植株在逆境脅迫下產(chǎn)生大量活性氧，導致各種生物大分子遭到破壞，改變膜的通透性和流動性，引發(fā)膜脂的過氧化反應，影響植物正常的代謝。MDA是膜脂過氧化反應的產(chǎn)物之一，對膜和一些生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸等有較強的破壞性。植物體內(nèi)的MDA的含量能夠反應植物抵御逆境的能力以及細胞膜脂的過氧化程度[21]。

本研究中，在棉纖維伸長發(fā)育階段，綠葉棉棉鈴各器官中MDA含量均低于紅葉棉，由此推測綠葉棉細胞膜的膜質(zhì)過氧化程度較低。綠葉棉較高的抗氧化酶系統(tǒng)活性，降低了細胞中MDA含量，促進了纖維素的積累[8]。因而，綠葉棉的衣指與衣分均高于紅葉棉。

4 結(jié)論

通過一對棉花近等基因系棉鈴抗氧化酶活性研究結(jié)果表明，棉纖維快速伸長階段棉鈴抗氧化酶活性與棉纖維的伸長發(fā)育密切相關(guān)。綠葉棉中較高的抗氧化酶活性促進棉纖維的伸長發(fā)育，特別是相對紅葉棉較高的POD酶活性有利于羥基自由基的形成，促進棉纖維的伸長發(fā)育。

[1]Székely G. Oxidative stress in plants[J]. Studia Universitatis Babes-Bolyai, Biologia, 2009, 10(11):19.

[2]張晉龍. 棉花細胞質(zhì)雄性不育系晉A與亞棉A活性氧代謝研究[D].太谷:山西農(nóng)業(yè)大學,2016.

[3]田又升,王志軍,于航,等. 干旱脅迫對不同抗旱性棉花品種抗氧化酶活性及基因表達的影響[J]. 西北植物學報,2015,35(12):2483-2490.

[4]李向前. 棉花耐鹽與抗氧化的相關(guān)性及H2O2對抗氧化系統(tǒng)的調(diào)控[D].烏魯木齊:新疆大學,2010.

[5]郭海軍, 董志強, 林永增,等. 黃萎病對棉花葉片SOD、POD酶活性和光合特性的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學, 1995, 28(6):40-45.

[6]杜雄明, 潘家駒, 汪若海. 棉纖維細胞分化和發(fā)育[J]. 棉花學報, 2000, 12(4):212-217.

[7]高京草, 王慧霞, 李西選. 可溶性蛋白、丙二醛含量與棗樹枝條抗寒性的關(guān)系研究[J]. 北方園藝, 2010(23):18-20.

[8]宋世佳,孫紅春,張永江,等. 彩色棉抗氧化系統(tǒng)生理特征及纖維素累積對纖維品質(zhì)的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學,2015,48(19):3811-3820.

[9]高俊鳳. 植物生理學實驗指導[M]. 北京: 高等教育出版社, 2006: 58-66.

[10]葉寶興，朱新產(chǎn). 作物科學基礎(chǔ)實驗[M]. 北京: 高等教育出版社，2007: 447.

[11]del Río L A, Pastori G M, Palma J M, et al. The activated oxygen role of peroxisomes in senescence[J]. Plant Physiology, 1998, 116(4): 1195-2000.

[12]陳俊. 堿地膚幼苗抗氧化酶系統(tǒng)對鹽堿混合脅迫的生理響應特點[D].長春:東北師范大學,2006.

[13]Miller G, Shulaev V, Mittler R. Reactive oxygen signaling and abiotic stress[J]. Physiologia Plantarum, 2008, 133(3):481-89.

[14]Mittler R, Vanderauwera S, Gollery M, et al. Reactive oxygen gene network of plants[J]. Trends in Plant Science, 2004, 9(10):490-498.

[15]Bienert G P, Schjoerring J K, Jahn T P. Membrane transport of hydrogen peroxide[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 2006, 1758(8): 994-1003.

[16]Vandenbroucke K, Robbens S, Vandepoele K, et al. Hydrogen peroxide-induced gene expression across kingdoms: A comparative analysis[J]. Molecular Biology and Evolution, 2008, 25(3): 507-516.

[17]Liu N, Lin Z, Guan L, et al. Antioxidant enzymes regulate reactive oxygen species during pod elongation in Pisum sativum and Brassica chinensis[J]. Plos One, 2014, 9(2):e87588.

[18]Liszkay A, Van der Zalm E, Schopfer P.Production of reactive oxygen intermediates (O2.-, H2O2,and.OH) by maize roots and their role in wall loosening and elongation growth[J]. Plant Physiology, 2004, 136(2):3114-3123.

[19]Schopfer P, Liszkay A, Bechtold M, et al. Evidence that hydroxyl radicals mediate auxin-induced extension growth[J]. Planta, 2002, 214(6):821-828.

[20]薛鑫, 張芊, 吳金霞. 植物體內(nèi)活性氧的研究及其在植物抗逆方面的應用[J]. 生物技術(shù)通報,2013 (10): 6-11.

[21]譚永安, 柏立新, 肖留斌, 等. 綠盲蝽危害對棉花防御性酶活性及丙二醛含量的誘導[J]. 棉花學報, 2010, 22(5): 479-485.