吳玉香,李昱櫻,申?duì)顮睿瑥埨?，鄭赟

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

棉花屬雙子葉植物(Dicotyledons)、錦葵科(Malvaceae)、棉屬(Gossypium)。棉屬有51個(gè)種，其中46個(gè)為二倍體棉種(2n=2X=26)，5個(gè)為異源四倍體棉種(2n=4X=52)[1]。多年來(lái)對(duì)棉屬四倍體種起源及其供體種問(wèn)題上，普遍一致的看法是草棉和亞洲棉是四倍體棉種A基因組的祖先供體種，雷蒙德氏棉是D基因組的祖先供體種[2]。這個(gè)基因組在棉屬進(jìn)化的早期大約700～1100萬(wàn)年前曾各自經(jīng)歷了單獨(dú)進(jìn)化[3,4]。棉屬A、D組棉種是研究物種形成過(guò)程中生殖隔離機(jī)制和基因組互作的良好材料，有關(guān)棉屬生殖隔離機(jī)制的研究對(duì)探討四倍體棉種形成和分化具有重要的科學(xué)意義，對(duì)棉屬遠(yuǎn)緣雜交親本選配有重要的參考價(jià)值。然而自然條件下由于棉屬A、D染色體組棉種之間存在較大的生殖隔離，A組和D組棉種較難雜交成功。

本研究選用A組亞洲棉、草棉為母本，D組雷蒙德氏和瑟伯氏棉為父本進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，旨在獲得雜種并從形態(tài)學(xué)初步鑒定雜種的真實(shí)性，探討A、D組棉種間生殖隔離的先后順序。進(jìn)一步探究親本基因組在雜種中的互作模式，為棉屬異源四倍體棉種形成和起源進(jìn)化提供最直接的證據(jù),為棉花種質(zhì)創(chuàng)新研究提供有價(jià)值的材料。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用材料有：A組草棉(G.herbaceum)(2n=2x=26)、亞洲棉(G.arboreum)(2n=2x=26)；D組野生雷蒙德氏棉(G.raimondii)(2n=2x=26)、瑟伯氏棉(G.thurberi)(2n=2x=26)。野生棉材料來(lái)源于國(guó)家種質(zhì)三亞野生棉圃，其染色體組及地理分布見(jiàn)表1。

表1 供試材料及其地理分布Table 1 The materials and geographic distribution

1.2 遠(yuǎn)緣雜交

試驗(yàn)分別以A組亞洲棉和草棉為母本，D組雷蒙德氏棉和瑟伯氏棉為父本進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，共進(jìn)行了4個(gè)組合的雜交，分別是：亞洲棉×雷蒙德氏棉；亞洲棉×瑟伯氏棉；草棉×雷蒙德氏棉；草棉×瑟伯氏棉。每個(gè)組合各選500朵母本花進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，具體步驟：母本去雄、父本花粉人工授粉、第二天重復(fù)授粉，以保證成功率。亞洲棉花蕾大小為苞葉和花蕾等長(zhǎng)且發(fā)黃時(shí)合適。草棉花蕾變黃，若隱若現(xiàn)時(shí)即為合適。

1.3 遠(yuǎn)緣雜種的形態(tài)學(xué)觀察和鑒定

收獲每個(gè)組合的雜交種子并播種，以當(dāng)年長(zhǎng)成的雜種植株為材料，獲得的遠(yuǎn)緣雜種從整個(gè)植株、葉片、花和父母本做比較，初步從形態(tài)學(xué)水平觀察鑒定雜種的真實(shí)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 遠(yuǎn)緣雜交結(jié)果

對(duì)4個(gè)組合的遠(yuǎn)緣雜交結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表2。每個(gè)組合雜交花數(shù)均為500，草棉×雷蒙德氏棉結(jié)鈴數(shù)為11，每個(gè)鈴有1～3棵種子，一共獲得27棵種子，只有3棵飽滿種子，播種后全部成苗，結(jié)鈴率為2.20%，成苗率為11.11%；亞洲棉×雷蒙德氏棉雜交花數(shù)為500朵，最終結(jié)鈴數(shù)為43，結(jié)鈴率為8.60%，獲得種子數(shù)為34粒，播種后成苗數(shù)為4棵，成苗率為11.76%；亞洲棉×瑟伯氏棉雜交花數(shù)為500朵，結(jié)鈴數(shù)為28，結(jié)鈴率為5.60%，獲得種子數(shù)為36粒，播種后成苗數(shù)為3棵，成苗率為8.33%；草棉×瑟伯氏棉雜交花數(shù)為500朵，結(jié)鈴數(shù)為4，結(jié)鈴率為0.80%，沒(méi)有收到飽滿種子，并無(wú)一成苗。雜交結(jié)果初步表明草瑟組合屬于合子前生殖隔離。草雷、亞雷、亞瑟組合生殖隔離是由合子前和合子后生殖隔離共同起作用。

表2 四個(gè)組合遠(yuǎn)緣雜交結(jié)果Table 2 The hybrid result of four combination

2.2 草雷雜種形態(tài)學(xué)觀察和鑒定

草雷雜種植株有很強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛，枝條伸展。播種后45 d現(xiàn)蕾開(kāi)花，雜種開(kāi)花時(shí)間比父本雷棉早比母本草棉晚，雜種只開(kāi)花不能結(jié)鈴。雜種葉形間于雙親之間且比親本厚，在老的枝條上出現(xiàn)3種葉型：父、母本葉型和中間葉型。雜種花比母本草棉大比父本雷棉小，花冠黃色并有深紅色花斑近似于草棉母本；花藥黃色近似于草棉母本，但花絲深紅像父本雷棉且比母本長(zhǎng)。柱頭淺黃比草棉長(zhǎng)比雷棉短，苞葉聯(lián)合近似草棉，小苞片數(shù)間于雙親之間，花絲平展且存在一絲多藥特征，這個(gè)特性既不像母本也不像父本，花絲數(shù)少于父母本(圖1和圖2)。

圖1 草雷雜種植株以及親本草棉和雷棉比較Fig.1 Hybrid plant comparison with its parents between G. herbaceum and G. raimondii 注：1：母本草棉，2：雜種，3：父本雷蒙德氏棉Note：1：G. herbaceum 2：Hybrid 3： G. raimondii

圖2 草雷雜種花以及親本草棉和雷棉比較Fig.2 Flower comparison with its parents between G. herbaceum and G. raimondii注：1：母本草棉，2：雜種花，3：父本雷蒙德氏棉Note：1: G. herbaceum 2: Hybrid 3: G. raimondii

草雷葉片密布表皮毛和腺體，有較強(qiáng)抗蟲(chóng)性，近似于雷棉父本。在海南常年進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)，5-10月份主要進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，但每天都能開(kāi)花；10-5(第二年)月份開(kāi)花最多。這是因?yàn)槟副静菝?來(lái)自非洲)抗旱基因的存在，草棉耐熱，一年四季開(kāi)花，加上父本雷棉也是抗旱材料，夏天進(jìn)行高效率的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。

2.3 亞雷雜種的形態(tài)學(xué)觀察和鑒定

以A組亞洲棉為母本，D組雷蒙德棉為父本進(jìn)行雜交，獲得了雜交種子并已成苗，觀察其形態(tài)性狀：亞雷雜種葉形間于兩親本之間，并且雜種植株呈現(xiàn)三種葉形，兩裂片和三裂片以及父本葉形都有，顏色比兩親本深；花瓣大小和花斑大小均間于兩親本之間，花瓣顏色淡黃色像父本，花斑顏色深紅趨向于母本亞洲棉，苞葉大小間于父母本之間但形狀像父本，花蕊顏色黃色像母本，但花絲深紅色且較長(zhǎng)像父本，雌蕊柱頭淡黃色間于兩親本之間，比母本長(zhǎng)比父本短(圖3和圖4)。

圖3 亞雷雜種植株和父母本比較Fig.3 Hybrid plant comparison with its parents between G. arboreum and G. raimondii注：1：母本亞洲棉(左)，雜種(右)，2：父本雷蒙德氏棉Note：1: G. arboreum (left), Hybrid (right) 2: G. raimondii

圖4 亞雷雜種花和父母本比較Fig.4 Flower comparison with its parents between G. arboreum and G. raimondii注：1：母本亞洲棉，2：雜種花，3：父本雷蒙德氏棉Note：1: G. arboreum 2: Hybrid 3: G. raimondii

2.4 亞瑟雜種的形態(tài)學(xué)觀察和鑒定

通過(guò)觀察亞瑟雜種植株及葉片性狀(圖5)：亞瑟雜種植株生長(zhǎng)受阻，植株矮小，但能長(zhǎng)側(cè)枝，比父母本都低，雜種植株不現(xiàn)蕾，不開(kāi)花，不結(jié)實(shí)，葉形間于雙親之間。另外，雜種的葉脈處有明顯的皺縮和不平整現(xiàn)象，可能是因?yàn)殡s種基因組互作的不協(xié)調(diào)導(dǎo)致植株出現(xiàn)異常。亞瑟雜種易受高溫影響，在海南4-9月生長(zhǎng)基本受阻，因?yàn)楦副旧厦薜牟荒蜔峄蚧蚩购虻拇嬖?。雜種長(zhǎng)勢(shì)還在繼續(xù)觀察中，希望采取一些管理措施如噴施葉面肥和激素或嫁接繁殖等恢復(fù)其生長(zhǎng)。

圖5 亞瑟雜種植株以及親本亞洲棉和瑟伯氏棉Fig.5 Hybrid plant comparison with its parents between G. arboreum and G. thurberi注：1：母本亞洲棉，2：雜種，3：父本瑟伯氏棉Note：1: G. arboreum 2: Hybrid 3: G. thurberi

3 討論

3.1 遠(yuǎn)緣雜交生殖隔離機(jī)制探討

生殖隔離是指由于各方面的原因，使親緣關(guān)系接近的類群之間在自然條件下不交配，即使能交配也不能產(chǎn)生后代或不能產(chǎn)生可育后代的隔離機(jī)制。生殖隔離最早被劃分為合子前隔離和合子后隔離2種形式[5]，若隔離發(fā)生在受精以前，就稱為受精前的生殖隔離，包括地理隔離、生態(tài)隔離、季節(jié)隔離、生理隔離、形態(tài)隔離和行為隔離等；若隔離發(fā)生在受精以后，就稱為受精后的生殖隔離，包括雜種不活、雜種不育和雜種衰敗等。合子前隔離主要受生態(tài)和生殖因素的影響；合子后隔離高度依賴于遺傳因素，受親本間相配程度的影響[6]。影響物種間生殖隔離的先后順序里，那些阻止雜交的隔離將成為限制基因流發(fā)生的第一次機(jī)會(huì)，因此生態(tài)地理隔離在一些分類群的總隔離中起到了更重要的作用，激發(fā)研究者更大的動(dòng)力去探究[7]。然而其他一些研究發(fā)現(xiàn)合子后障礙對(duì)阻止基因交流也非常重要[8～12]，因?yàn)樯掣綦x也常常表現(xiàn)為環(huán)境是否強(qiáng)烈影響雜種的行為，即外在的生殖隔離障礙是否依賴于環(huán)境，因?yàn)殡s種要面對(duì)自然條件下的強(qiáng)選擇壓力才能最終存活。

物種形成是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，其實(shí)質(zhì)是生殖隔離

機(jī)制的進(jìn)化，因此研究物種形成主要是研究各種生殖隔離機(jī)制形成和進(jìn)化的過(guò)程。本研究結(jié)果表明草×瑟組合生殖隔離完全是由于合子前生殖隔離，草×雷、亞×雷、亞×瑟生殖隔離是由合子前和合子后生殖隔離共同起作用。結(jié)果還表明D組雷蒙德氏棉能同時(shí)和A1、A2組雜交成功并獲得了雜種后代，這也進(jìn)一步驗(yàn)證了雷蒙德氏棉被視為四倍體棉種祖先的直接證據(jù)。

3.2 遠(yuǎn)緣雜種中親本基因組互作探討

對(duì)于進(jìn)行有性生殖的生物來(lái)說(shuō)，雜種新個(gè)體生物學(xué)上的適應(yīng)需要父母本基因組成功協(xié)調(diào)的互作，而這些互作表現(xiàn)在從DNA到外在表型的不同階段發(fā)生。雜交后的基因組互作探討也將極大的促進(jìn)物種形成生物學(xué)的發(fā)展[13]。因此我們期望將兩組分化百萬(wàn)年的A、D基因組棉種雜交到F1中產(chǎn)生新的表現(xiàn)型。遠(yuǎn)緣雜種的基因組互作和協(xié)調(diào)是雜種穩(wěn)定和存活的關(guān)鍵，基因組互作能夠很好解釋種間雜交導(dǎo)致的極端后果如雜種優(yōu)勢(shì)和互作不親和導(dǎo)致的雜種壞死。本研究4個(gè)組合遠(yuǎn)緣雜交，只有3個(gè)組合獲得雜種植株，雜種大多數(shù)性狀間于雙親之間。只有草雷、亞雷2個(gè)組合雜種植株能現(xiàn)蕾開(kāi)花，雜種基因組互作親和且有較強(qiáng)生長(zhǎng)勢(shì)。亞瑟雜種植株矮小，不現(xiàn)蕾不開(kāi)花，但能長(zhǎng)側(cè)枝，究其原因是親本基因組互作不親和的結(jié)果。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)提供了解析來(lái)自父母本基因組互作和表達(dá)模式的強(qiáng)大信息，來(lái)自不同親本的雜種后代轉(zhuǎn)錄組學(xué)比較，可以闡明基因組互作在轉(zhuǎn)錄親和中起到的關(guān)鍵作用。本研究獲得的3個(gè)組合雜種的基因組互作模式有待于進(jìn)一步從轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平來(lái)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

草瑟屬于合子前生殖隔離；草雷、亞雷、亞瑟生殖隔離是由合子前和合子后生殖隔離共同起作用。且草雷、亞雷雜種基因組互作親和，而亞瑟雜種基因組互作不親和。D組雷蒙德氏棉能同時(shí)和A1、A2組雜交成功并獲得雜種后代，進(jìn)一步驗(yàn)證了雷蒙德氏棉被視為四倍體棉種祖先的直接證據(jù)。

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