陸惠平，楊　濤，龔婧如

(上海市浦東醫(yī)院藥劑科，上?！?01399)

中藥注射劑是以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，利用現(xiàn)代技術(shù)從中藥材中提取有效成分而供靜脈注射的制劑。目前，中藥注射劑已普遍應(yīng)用于臨床，但其引發(fā)的不良反應(yīng)/事件一直是社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)。藥物相互作用(drug-drug interactions，DDI)是聯(lián)合用藥中引起不良反應(yīng)的重要風(fēng)險(xiǎn)因素[1]。DDI最常見的原因就是細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP)酶的抑制和誘導(dǎo)所產(chǎn)生的代謝性相互作用，會(huì)引發(fā)藥品不良反應(yīng)或療效降低[2]。大部分的藥物代謝都是由CYP酶的亞型CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4參與的[2]。由CYP酶抑制引起的DDI約占全部DDI的70%，而CYP酶誘導(dǎo)引起的約占23%，其他約占7%[3]。阿司匹林和氯吡格雷分別是CYP2C19的誘導(dǎo)劑和抑制劑[4]。阿司匹林進(jìn)入人體后，一部分在酯酶的作用下通過非酶途徑去乙?；伤畻钏?，水楊酸在CYP酶作用下被催化生成2,3-二羥基苯甲酸和2,5-二羥基苯甲酸[5]；另一部分在CYP酶的作用下被催化生成2,5-二羥基苯甲酸。氯吡格雷在人體大部分被酯酶催化生成無活性的衍生物，小部分在CYP酶的作用下生成具有抗血小板活性的代謝物[6]。丹紅注射液是丹參、紅花經(jīng)提取制成的滅菌水溶液，具有活血化淤、通脈舒絡(luò)等功效，同時(shí)可阻止血栓形成和促進(jìn)血栓溶解[7]。臨床上，丹紅注射液常與抗血小板藥阿司匹林或(和)氯吡格雷等聯(lián)合應(yīng)用[8-9]。但目前，丹紅注射液與抗血小板藥的DDI研究相對(duì)缺乏，給臨床應(yīng)用帶來不確定性。本研究通過人肝微粒體酶體外孵育系統(tǒng)，考察丹紅注射液對(duì)CYP酶5種常見亞型的抑制作用，并通過檢測(cè)母體剩余率的方式，進(jìn)一步考察丹紅注射液對(duì)阿司匹林和氯吡格雷體外代謝的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料

1.1　儀器

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)包括Shimadzu LC20液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司)和自動(dòng)進(jìn)樣器API4000三重四級(jí)桿檢測(cè)器(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)有限公司)，操作軟件為Analyst 1.5.1。

1.2　藥品與試劑

丹紅注射液(山東丹紅制藥有限公司，規(guī)格：10 ml/支，批號(hào)：16111035)；還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH，羅氏公司，貨號(hào)：Roche 10621706001)；右美沙芬(阿達(dá)瑪斯試劑，貨號(hào)：Damas-beta 75469A)；睪酮(Dr.Ehrenstorfer公司，貨號(hào)：Dr.Ehrenstorfer 17322500)；咪達(dá)唑侖(中國(guó)食品藥品檢定研究院合成，批號(hào): 171265-201402)；磺胺苯吡唑(百靈威科技，貨號(hào)：J&K 178125)；奎尼丁(多倫多研究化學(xué)品公司，貨號(hào)：TRCQ685000)；酮康唑(東京化成工業(yè)株式會(huì)社，貨號(hào)：TCI K0045)；4-羥基美芬妥英(常州淞弘進(jìn)出口有限公司，批號(hào)：20101216)；6β-羥基睪酮[碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司，貨號(hào)：BD451012]；氯吡格雷硫酸鹽(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，貨號(hào)：阿拉丁S129544)；非那西汀(貨號(hào)：Sigma77440)，雙氯芬酸(貨號(hào)：SigmaD6899)，S-美芬妥英(貨號(hào)：Sigma UC175)，α-萘磺酮(貨號(hào)：Sigma N5757)，噻氯匹定(貨號(hào)：Sigma T6654)，對(duì)乙酰氨基酚(貨號(hào)：Sigma A-3035)，4-羥基雙氯芬酸(貨號(hào)：Sigma H-3661)，右啡唍(貨號(hào)：Sigma UC205)，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDPGA，貨號(hào)：Sigma U6751)，甲苯磺丁脲(貨號(hào)：Sigma T-0891)，阿司匹林(貨號(hào)：Sigma A6810)，均購(gòu)自Sigma-Aldrich中國(guó)。

1.3　微粒體

混合人肝微粒體(Bioreclamation IVT公司，貨號(hào)：X008067，批號(hào)：IHG)。

2　方法

2.1　體外酶抑制研究

2.1.1色譜條件：色譜柱為Diamonsil C18柱(4.6 mm×50 mm，5 μm)，柱溫為40 ℃，流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液(A)與0.1%甲酸甲醇溶液(B)，梯度洗脫，進(jìn)樣量為5 μl，運(yùn)行時(shí)間為2.0 min，流速為900 μl/min，4-羥基雙氯芬酸和6β-羥基睪酮的分析流速為800 μl/min，其余物質(zhì)分析流速為900 μl/min。

2.1.2質(zhì)譜條件：掃描模式為電噴霧正電離-多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，碰撞氣6 psi，氣簾氣20 psi，霧化氣50 psi，輔助氣60 psi，離子電壓5 kV，溫度500 ℃。

2.1.3孵育條件和研究方法：(1)實(shí)驗(yàn)組,肝微粒體加入不同濃度的樣品溶液(0.01%、0.3%、1%、3%、10%和30%)。(2)陰性對(duì)照組(NC),肝微粒體加入空白緩沖液。(3)陽(yáng)性對(duì)照組(PC),肝微粒體加入各亞酶的選擇性抑制劑。上述三組在預(yù)孵育15 min后，分別加入各亞酶的探針底物和輔酶NADPH孵育30 min，加入甲醇終止反應(yīng)，離心，取上清液，根據(jù)“2.1.1”“2.1.2”項(xiàng)下方法測(cè)定各探針底物的代謝產(chǎn)物生成量?；旌先烁挝⒘ｓw的終質(zhì)量濃度為0.3 mg/ml，所有孵育均在37 ℃水浴中進(jìn)行，每組均設(shè)3個(gè)平行樣本。各亞酶的底物、抑制劑的終濃度和代謝產(chǎn)物見表1。

表1　各亞酶的底物、抑制劑終濃度和代謝產(chǎn)物Tab 1　Substrates of different enzymes, concentration of inhibitors and metabolite products

2.1.4評(píng)價(jià)方法：依據(jù)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《藥物相互作用研究指導(dǎo)原則(2012)》對(duì)丹紅注射液對(duì)CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4的抑制作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過檢測(cè)CYP各亞酶底物代謝產(chǎn)物的減少以判斷樣品對(duì)各亞酶的抑制作用。CYP亞酶的相對(duì)活性以相對(duì)陰性對(duì)照的百分比表示，公式如下：相對(duì)活性(% of NC)=實(shí)驗(yàn)組或PC組中的代謝產(chǎn)物生成量/NC組中的代謝產(chǎn)物生成量×100%。平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對(duì)活性通過Excel軟件計(jì)算。半數(shù)抑制劑量(IC50)Y=Bottom+(Top-Bottom)/(1+10(LogIC50-X)*HillSlope)([Y是相對(duì)活性(% of NC)；X是測(cè)試濃度；Bottom是下限；Top是上限；HillSlope是斜率])。所有結(jié)果均保留3位有效數(shù)字。

2.2　體外藥物相互作用研究

2.2.1色譜條件：色譜柱為Phenomenex Syergni Hydro RP(2 mm×30 mm，4 μm)，柱溫為40 ℃，流動(dòng)相為0.1% 甲酸水溶液(A)與0.1%甲酸甲醇溶液(B)，梯度洗脫，進(jìn)樣量為5 μl，流速為500 μl/min，阿司匹林和氯吡格雷的分析時(shí)間為1.80 min，睪酮的分析時(shí)間為2.00 min。

2.2.2質(zhì)譜條件：掃描模式為電噴霧正電離-多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，碰撞氣6 psi，氣簾氣20 psi，霧化氣50 psi，輔助氣60 psi，離子電壓5 kV，溫度500 ℃。

2.2.3孵育條件和研究方法：(1)實(shí)驗(yàn)組,阿司匹林(終濃度0.25 μmol/L)或氯吡格雷(終濃度5 μmol/L)分別在有、無丹紅注射液條件下預(yù)孵育5 min后，與輔酶NADPH和UDPGA(終濃度1.5 mmol/L)和微粒體孵育0、15、30、60、90和120 min。(2)陽(yáng)性對(duì)照組(PC),CYP3A4的標(biāo)準(zhǔn)底物睪酮(終濃度0.5 μmol/L)預(yù)孵育5 min后，加入輔酶NADPH和UDPGA(終濃度1.5 mmol/L)與微粒體孵育0和120 min。(3)陰性對(duì)照組(NC),樣品預(yù)孵育5 min后，在無任何輔酶的條件下與微粒體孵育0和120 min。上述三組在孵育后加入預(yù)冷的甲醇，沉淀蛋白，離心取上清液，根據(jù)“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下的方法測(cè)定阿司匹林和氯吡格雷的母體量?；旌先烁挝⒘ｓw的終質(zhì)量濃度為 0.5 mg/ml，所有孵育均在37 ℃水浴中進(jìn)行，每組均設(shè)3個(gè)平行樣本。

2.2.4評(píng)價(jià)方法：樣品的代謝穩(wěn)定性用樣品在各時(shí)間點(diǎn)的母體剩余量相對(duì)于孵育前的母體量(0 min)的百分比表示，公式如下：母體剩余百分率(% of 0 min)=Tx母體量/T0母體量×100%(Tx為任一孵育時(shí)間點(diǎn)；T0為0 min孵育時(shí)間點(diǎn))。母體半數(shù)消除時(shí)間(T1/2)和消除速率常數(shù)K通過軟件Prism計(jì)算。體外清除率(CLint)=(0.693/T1/2)×[1/(microsomal protein)]×Scaling Factors(microsomal protein是指所使用的微粒體蛋白量；Scaling Factors為不同種屬肝微粒體的比例因子，人類的為1 254.2)。均值、標(biāo)準(zhǔn)差等通過Excel計(jì)算，所有結(jié)果均保留3位有效數(shù)字。

3　結(jié)果

3.1　體外酶抑制研究結(jié)果

0.01%、0.3%、1%、3%、10%和30%的丹紅注射液對(duì)人肝微粒體中CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4酶活性均存在濃度依賴性的潛在抑制作用，IC50分別為0.593%、0.816%、0.740%、0.841%和0.780%；CYP酶的選擇性抑制劑α-萘磺酮、磺胺苯吡唑、噻氯匹定、奎尼丁和酮康唑分別抑制了CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4酶活性的85.6%、91.0%、97.2%、92.4%和99.7%，表明測(cè)試系統(tǒng)符合該評(píng)價(jià)研究，見表2、圖1。

表2　丹紅注射液對(duì)5種CYP亞酶的抑制作用Tab 2　Inhibitory effect of danhong injections on 5 CYP enzymes

3.2　體外藥物相互作用研究

0.25 μmol/L的阿司匹林在有、無1%丹紅注射液的條件下與人肝微粒體孵育120 min后，其母體剩余率分別為孵育前的93.9%和83.2%；其母體T1/2>120 min且體外清除率<20。0.5 μmol/L的氯吡格雷在有、無1%丹紅注射液的條件下與人肝微粒體孵育15 min后，其母體剩余率分別為孵育前的10.4%和4.33%；母體T1/2分別為4.01和2.05 min，體外清除率分別為434和847，且在無輔酶的條件下的母體剩余率為0.257%，見表3—4。作為系統(tǒng)對(duì)照的睪酮在與人肝微粒體孵育120 min后，其母體剩余率為孵育前的8.04%，提示微粒體測(cè)試系統(tǒng)正常工作。

3　討論

丹紅注射液的日用量占人體血液的體積分?jǐn)?shù)為0.4%～1.6%[10]。而根據(jù)體外酶抑制研究結(jié)果，丹紅注射液對(duì)人肝微粒體中的CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4的IC50分別為0.593%、0.816%、0.740%、0.841%和0.780%，推測(cè)在臨床上正常用量下，丹紅注射液可能會(huì)引起CYP450相關(guān)的DDI。

表3　0.25 μmol/L阿司匹林在人肝微粒體中的代謝穩(wěn)定性Tab 3　Metabolism stability in human liver microsome of 0.25 μmol/L aspirin

A.CYP1A2；B.CYP2C9；C.CYP2C19；D.CYP2D6；E.CYP3A4 圖1　丹紅注射液對(duì)5種CYP亞酶的抑制作用Fig 1　Inhibitory effect of danhong injections on 5 CYP enzymes

實(shí)驗(yàn)組時(shí)間點(diǎn)/min母體剩余率/%T1/2/minCLint/[μl/(min·mg)]1%丹紅注射液+氯吡格雷+輔酶0100±49140143415104±25130453±10860280±06490260±038120380±337氯吡格雷+輔酶0100±28520584715433±22330657±53460341±06890223±028120286±141氯吡格雷0100±122不適用不適用120194±026

在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步探討了1%的丹紅注射液分別與阿司匹林和氯吡格雷的DDI。研究結(jié)果顯示，在體外孵育的條件下，阿司匹林不被人肝微粒體顯著代謝；但阿司匹林在有1%丹紅注射液的條件下在與人肝微粒體孵育120 min后的母體剩余率為93.9%，顯著高于無1%丹紅注射液的83.2%。因此，1%的丹紅注射液可能在一定程度上抑制了從阿司匹林直接轉(zhuǎn)化為2,5-二羥基苯甲酸過程中的CYP酶。而阿司匹林在相關(guān)酯酶的催化下生成乙酰水楊酸，再在CYP酶的作用下生成2,3-二羥基苯甲酸和2,5-二羥基苯甲酸可能是其代謝的主要途徑[5]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在臨床上約85%的氯吡格雷在酯酶的作用下水解為無活性的羧酸衍生物，另外15%在CYP450的氧化作用下產(chǎn)生活性物質(zhì)[6]，可能是本研究未觀察到氯吡格雷的母體代謝被明顯抑制的主要原因。

綜上所述，僅從母體剩余量評(píng)價(jià)，在肝微粒體中阿司匹林母體代謝不顯著，而氯吡格雷代謝過快(母體代謝量過大)。因此,1%的丹紅注射液對(duì)阿司匹林和氯吡格雷的母體代謝均無明顯抑制作用。為了精確地評(píng)價(jià)丹紅注射液對(duì)阿司匹林和氯吡格雷代謝的影響，還需進(jìn)一步通過對(duì)相關(guān)通路的代謝產(chǎn)物分析來研究DDI。

[1]譚樂俊，王萌，朱彥.中藥注射劑的不良反應(yīng)研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志，2014，39(20)：3889-3898.

[2]Wienkers LC，Heath TG.Predicting in vivo drug interactions from in vitro drug discovery data[J].Nat Rev Drug Discov，2005，4(10)：825-833.

[3]余小翠，黃麗軍，劉高峰，等.丹紅注射液對(duì)大鼠肝微粒體5種CYP亞型酶活性的影響[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，31(3)：277-281.

[4]Zanger UM，Schwab M.Cytochrome P450 enzymes in drug metabo-lism： regulation of gene expression, enzyme activities, and impact of genetic variation[J].Pharmacol Ther，2013，138(1)：103-141.

[6]Clarke TA，Waskell LA.The metabolism of clopidogrel is catalyzed by human cytochrome P450 3A and is inhibited by atorvastatin[J].Drug Metab Dispos，2003，31(1)：53-59.

[7]曹文杰，蘇李娜，樊官偉.丹紅注射液藥理作用及臨床應(yīng)用研究[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2015，24(3)：335-337.

[8]張倩，居文政，郭建明，等.基于臨床統(tǒng)計(jì)丹紅注射液常見聯(lián)合用藥的藥物相互作用文獻(xiàn)研究[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2016，36(9)：773-777.

[9]杜婧，楊薇，易丹輝，等.基于HIS“真實(shí)世界”的丹紅注射液治療冠心病患者合并用藥分析[J].中國(guó)中藥雜志，2011，36(20)：2821-2824.

[10]劉麗雅，韓永龍，余奇，等.10種心血管類中藥注射劑對(duì)人細(xì)胞色素P4507種亞型的體外抑制作用[J].中國(guó)藥房，2014，25(11)：990-993.