何平有 ，劉 濤 ，楊保收 ，林 建 ，鄒立宏 ，邱貞娜 ，郁宏偉 、2，趙玉龍 ，劉 浩

（1.瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司，071000；2.天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司，300308；3.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，100097）

鴨坦布蘇病毒病(DTMUV)是鴨坦布蘇病毒病的病原，引起不同日齡的北京鴨、櫻桃谷鴨、金定鴨和麻鴨等發(fā)病，主要表現(xiàn)為精神沉郁、產(chǎn)蛋下降和死淘率增加，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。在DTMUV的疫苗研究中，近年來有利用禽胚及其成纖維細(xì)胞、傳代細(xì)胞等培養(yǎng)病毒的報(bào)道[1]，但受病毒株系差別、培養(yǎng)體系等因素影響，其增殖條件和疫苗效果差異比較大。筆者為提高DTMUV HB株疫苗的生產(chǎn)效率和產(chǎn)品品質(zhì)，對HB株細(xì)胞適應(yīng)毒在鴨胚成纖維細(xì)胞上的增殖條件進(jìn)行篩選，擬確定該疫苗的最佳生產(chǎn)工藝。

1　材料

1.1　毒種

鴨坦布蘇病毒HB株F4代細(xì)胞適應(yīng)毒由瑞普公司質(zhì)量管理部提供。

1.2　細(xì)胞

購自河北省未感染坦布蘇病毒健康鴨群所產(chǎn)種蛋，自行孵化至適宜日齡備用，制成成纖維單層細(xì)胞。

1.3　培養(yǎng)基

DMEM培養(yǎng)基和新生牛血清均購自Gibco公司。

2　方法

2.1　最佳接毒比例的確定

分別按0.25%、0.5%、1.0%和2.0%的比例將毒種接入致密鴨胚成纖維單層細(xì)胞，每個(gè)比例接種3瓶，補(bǔ)加含2%新生牛血清的DMEM液，置37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變（CPE），當(dāng)CPE達(dá)到75%～80%時(shí)收獲病毒懸液。將收獲的病毒液分別取3個(gè)適宜的稀釋度按中國獸藥典方法測定其病毒含量[2]。

2.2　最佳收獲時(shí)間的確定

按2.1優(yōu)選的接毒比例分別接種鴨胚成纖維單層數(shù)瓶，于接毒后72、78、84、90和96h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別隨機(jī)取出2瓶，重復(fù)3次。按2.1的方法測定病毒含量。

3　結(jié)果與討論

3.1　最佳接毒比例的確定

結(jié)果詳見表1。由表1可見，4個(gè)接毒比例以0.5%接毒比例收獲的病毒液病毒含量最高，均不低于106.7TCID50/0.1m l，1%接毒比例次之，0.25%和2%接比例量最差。因此，最佳接毒比例為0.5%。

3.2　最佳收獲時(shí)間的確定

結(jié)果詳見表2。由表2可見，隨著收獲時(shí)間的延長，收獲病毒液的病毒含量呈一個(gè)先上升后下降的趨勢；其中接毒后84小時(shí)病毒含量最高，三批次毒液病毒含量均不低于107.1TCID50/0.1m l；其次是接毒后78h收獲的病毒液，三批次病毒含量在106.5～106.9TCID50/0.1m l。

4　討論

本研究成功實(shí)現(xiàn)鴨坦布蘇病毒培養(yǎng)從組織培養(yǎng)向細(xì)胞培養(yǎng)的轉(zhuǎn)變，在實(shí)驗(yàn)室前期細(xì)胞適應(yīng)株DTMUV HB株的基礎(chǔ)上，對不同接毒比例和收獲時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，為進(jìn)一步完善該疫苗株的生產(chǎn)工藝提供技術(shù)支持。

從不同接毒比例看，當(dāng)接毒比例從0.25%提升至0.5%時(shí)收獲病毒液的病毒含量，從105.9～106.1TCID50/0.1ml提升到106.7TCID50/0.1ml以上，而后隨著接毒比例上升，出現(xiàn)病毒含量下降。因此，接毒比例并不是簡單的越高越好，它們之間存在一個(gè)最適合的比例，本研究的最佳接毒比例為0.5%。

從不同收獲時(shí)間看，當(dāng)收獲時(shí)間從接毒后72小時(shí)至84小時(shí)，收獲毒液的病毒含量從106.1～106.3TCID50/0.1ml提升到107.1TCID50/0.1ml以上，而后隨著收獲時(shí)間延長，出現(xiàn)病毒含量下降的情況。這可能與鴨坦布蘇病毒的特性相關(guān)，收獲時(shí)間早病毒增殖尚未達(dá)到繁殖高峰；隨著時(shí)間延長而增加，收獲高于84小時(shí)，病毒繁殖達(dá)高峰后大量病毒暴露在高溫環(huán)境中失活而導(dǎo)致病毒含量下降。

表1　不同接毒比例制備病毒液病毒含量測定結(jié)果單位：TCID50/0.1m l

表2　不同時(shí)間收獲病毒液病毒含量測定結(jié)果單位：TCID50/0.1m l

[1]張玥.鴨坦布蘇病毒的分離、致病性和細(xì)胞適應(yīng)性研究[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[2]中國獸藥典委員會.中華人民共和國藥典（2015年版,三部）[M].北京∶中國醫(yī)藥科技出版社,2016.