齊衍超 陳燕 超海鵬 鞏峰賢

濰坊市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心 山東濰坊 261105

近年來，毛細(xì)管電泳在和各種檢測技術(shù)的融合運(yùn)用的過程中體現(xiàn)出良好的分析能力，可分析范圍較廣。但毛細(xì)管電泳也存在一些缺點(diǎn)，如它的進(jìn)樣量很小，需要檢測儀器具備很高的靈敏度，響應(yīng)速度以及空間分辨能力。因此，人們對檢測器進(jìn)行了持續(xù)研究，近年來，電化學(xué)（ECL）技術(shù)憑借其簡單、可以實(shí)現(xiàn)微型環(huán)境的高靈敏檢測的特點(diǎn)，被應(yīng)用于毛細(xì)管電泳分離檢測。1987年，Danielson等人提出Ru(bpy)32+和烷基胺的電化學(xué)技術(shù)，說明了電化學(xué)強(qiáng)度與胺結(jié)構(gòu)的關(guān)系[1]。從此Ru(bpy)32+ECL體系逐漸在應(yīng)含氮化合物分析中得到廣泛應(yīng)用。而毛細(xì)管電泳Ru(bpy)32+電化學(xué)發(fā)光聯(lián)用技術(shù)（CE-ECL）兼具高效電泳分離、靈敏電化學(xué)發(fā)光檢測的功能，在藥物、環(huán)境污染等方面的檢測中應(yīng)用越來越廣泛。

1 毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光CE-ECL在藥物檢測中的應(yīng)用

1.1 藥物部分

鹽酸硫利噠嗪，又成為鹽酸甲硫達(dá)嗪，其化學(xué)式為C21H26N2S2·HCl，顏色呈白色或類白色，形態(tài)為結(jié)晶性粉末，有輕微的臭味，能溶解于乙醇，是一種抗精神病藥。利用CE-ECL分析檢測鹽酸硫利噠嗪可以獲得更高的靈敏度，而且操作簡便，損耗較小。

1.2 試驗(yàn)部分

鹽酸硫利噠嗪購自中國藥品生物制品檢定所。試驗(yàn)所需的氯化三聯(lián)吡啶耔六水和物購自于J&K化學(xué)藥品公司。用Na2HP04、KH2P04配制成pH值不同的一組68mmol/L的磷酸緩沖溶液。試驗(yàn)所需的水均為蒸餾水，化學(xué)試劑的純度基本均在分析純以上，全部試驗(yàn)所需溶液在使用前都經(jīng)由水膜過濾處理。

1.3 試驗(yàn)儀器

電化學(xué)分析儀：EC6100型（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）

工作電極：直徑一毫米鉑電極

參比電極：Ag/AgCl電極。

毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測儀：RM02-MPI-A型（北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司），該檢測儀主要包括四個(gè)部分：數(shù)控采集分析儀、化學(xué)發(fā)光檢測器、高壓電源、恒電位儀。

電化學(xué)發(fā)光檢測池：該檢測池處于發(fā)光檢測器中，主要由三電極系統(tǒng)構(gòu)成，分別為工作電極：直徑300μm的鉑電極；參比電極：Ag/AgCl電極；鉑電極作為對電極。可以將Ru(bpy)32+溶液加入磷酸緩沖液中，但Ru(bpy)32+將吸附于毛細(xì)管上，降低毛細(xì)管電泳的分析效率。因此，一般情況下都是將Ru(bpy)32+溶液加入到電化學(xué)發(fā)光檢測池中，在施加制定電位，Ru(bpy)32+將在工作電極表明被氧化成Ru(bpy)32+毛細(xì)管末端和工作電極表面的距離應(yīng)設(shè)為100μm。待分析的藥物樣品從毛細(xì)管中轉(zhuǎn)移出來后與Ru(bpy)32+在工作電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成激發(fā)態(tài)Ru(bpy)32+，它在恢復(fù)到基態(tài)的過程中會(huì)釋放光子[2]。利用光電倍增管收集光信號。考慮到溶劑會(huì)蒸發(fā)以及毛細(xì)管內(nèi)部流出溶液的稀釋作用，需要每隔兩個(gè)小時(shí)更換一次Ru(bpy)32+，以免影響Ru(bpy)32+溶液濃度，大致分析過程受到干擾或產(chǎn)生損耗效應(yīng)。

未涂層熔融石英毛細(xì)管：(50μm×50cm，有效長度41cm)，第一次使用前需要使用將其置于0．1mol/L的NaOH溶液中浸泡二十四小時(shí)，取50cm長的未涂層熔融石英毛細(xì)管置于兩溶液池之間充當(dāng)分離通道，在進(jìn)樣端施加高壓，每次運(yùn)行前用NaOH沖洗十分鐘，再用緩沖溶液沖洗至CL基線平穩(wěn)。

1.4 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液

在10ml的乙醇中溶解40.7mg的鹽酸硫利噠嗪制取0．01mol/L的鹽酸硫利噠嗪母液，將其放置于冰箱中，溫度控制在4℃。每次開始試驗(yàn)前，可以用乙醇稀釋鹽酸硫利噠嗪母液，以制得濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.5 結(jié)果和討論

在Ru(bpy)32+溶液中鹽酸硫利噠嗪的循環(huán)伏安如下圖所示：

圖1 鹽酸硫利噠嗪的循環(huán)伏安

如上圖所示，曲線a表示磷酸緩沖溶液中鉑電極的循環(huán)伏安圖，由圖可知其沒有氧化還原峰，但是鉑電極Ru(bpy)32+溶液中的循環(huán)伏安圖存在非常明顯的氧化還原峰，這個(gè)氧化還原峰是Ru(bpy)32+所獨(dú)有的。當(dāng)我們將100Lμ，摩爾濃度為O.01mol/L利用乙醇稀釋制成的鹽酸硫利噠嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液加入800Lμ、摩爾濃度為5mmol/LRu(bpy)32+溶液后，將得到如圖1中的曲線c所示與之前明顯不同的循環(huán)伏安圖。此時(shí)氧化峰的電流增大，而還原峰的電流減小。這是因?yàn)镽u(bpy)32+在工作電極的表面發(fā)生氧化反應(yīng)失去一個(gè)電子生成Ru(bpy)32+，Ru(bpy)32+從鹽酸硫利噠嗪溶液中得到一個(gè)電子恢復(fù)成二價(jià)態(tài)，但是卻呈現(xiàn)出激發(fā)態(tài)，當(dāng)處于激發(fā)態(tài)的Ru(bpy)32+回復(fù)到基態(tài)的過程中將釋放光子?？梢?，從某種意義上來說，Ru(bpy)32+濃度明顯增加，自然就會(huì)出現(xiàn)氧化峰電流增大、還原峰電流減小的現(xiàn)象，我們可以利用這一現(xiàn)象來檢測鹽酸硫利噠嗪。

1.6 分析條件的優(yōu)化

根據(jù)上述分析可知，當(dāng)鹽酸硫利噠嗪溶液經(jīng)由毛細(xì)管電泳至電化學(xué)發(fā)光檢測池中后，光電倍增管將會(huì)收集到光信號，根據(jù)此原理檢測鹽酸硫利噠嗪。為了增強(qiáng)試驗(yàn)效果，需要針對影響鹽酸硫利噠嗪電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度以及分離效果的各種因素進(jìn)行優(yōu)化，如應(yīng)用電壓、迸樣電壓、持續(xù)進(jìn)樣時(shí)間、磷酸緩沖溶液pH值等。

應(yīng)用電壓對電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。發(fā)光試劑氧化速率會(huì)影響電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，而，工作電極上的應(yīng)用電壓會(huì)影響光試劑氧化速率。應(yīng)用電壓過低，Ru(bpy)32+難以被氧化，應(yīng)用電壓上升時(shí)，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度也會(huì)提升，當(dāng)超過1.2v時(shí)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度又會(huì)降低。因此，1.2V就是最佳的應(yīng)用電壓。

進(jìn)樣電壓大小、進(jìn)樣持續(xù)時(shí)間長短對電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度有較大影響，因?yàn)榉治鑫锏牧坑蛇M(jìn)樣電壓、進(jìn)樣持續(xù)時(shí)間決定，分析物的量又決定了電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。當(dāng)進(jìn)樣持續(xù)10s，進(jìn)樣電壓為10kV，電化學(xué)強(qiáng)度將顯著增強(qiáng)。

（3）電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)和pH有直接關(guān)系，因此，磷酸緩沖溶液pH值會(huì)影響電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。在本次試驗(yàn)中pH值從6.5上升至8.0時(shí)，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度提升，當(dāng)pH值超過8．0，時(shí)，電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度減小。

2 結(jié)語

綜上所述，本文采用毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光CE-ECL方法構(gòu)建了操作簡便、結(jié)果可靠、復(fù)現(xiàn)性好的方法用于檢測鹽酸硫利噠嗪，并針對相關(guān)的試驗(yàn)儀器、試驗(yàn)條件進(jìn)行了分析優(yōu)化。試驗(yàn)證明該方法可以用于藥物檢測，生物活性的分析。