陳 楊,解麗麗,陳 誠,李嶄虹,潘 帥,朱志剛

(上海第二工業(yè)大學 環(huán)境與材料工程學院,上海201209)

0　引言

糖尿病是當前威脅全球人類健康最重要的慢性疾病之一,主要病因是負責分泌胰島素的胰腺β細胞發(fā)生故障,導致無法嚴格控制血液中的葡萄糖水平[1]。糖尿病會誘發(fā)高血壓、心血管、腎衰竭、手足壞死、神經(jīng)紊亂等多種病癥,對人的生命健康有極大危害[2-3]。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟(International Diabetes Federation,IDF)統(tǒng)計,預計到2030年,全球將近有5.5億人身患糖尿病,其中在我國I型糖尿病患者總數(shù)在700～1 000萬之間[4]。為了維持接近正常的血糖水平(70～120 mg/dL)[5],目前糖尿病患者廣泛使用的是手持式血糖儀,每天需要數(shù)次刺破手指以獲得血液樣品,這種方式會給患者帶來疼痛和不便,而且無法連續(xù)檢測體內葡萄糖水平[6-7]。

目前研究以及市場上出售的人體血糖檢測產品主要采用針形葡萄糖電極,因其易于制造和適合植入的特性而受到廣泛關注[8],如Koh等[9]設計的超微孔聚氨酯涂覆的針形植入式葡萄糖傳感器。但其缺點也較明顯:葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)擔載量過低導致其使用壽命較短。為了解決此類問題,螺旋式葡萄糖傳感器被陸續(xù)報道。例如,Yu等[10]所制作的螺旋型傳感器,在體外恒定極化3個月后仍能發(fā)揮較好的功能,但在植入體內后由于排異反應而很快失去敏感性。傳感器在植入后逐漸喪失功能,主要是因為植入后創(chuàng)口周圍組織所引起的身體異物反應(foreign body reaction,FBR),包括纖維包膜和炎癥反應[11]。為了提高植入式葡萄糖傳感器的壽命,具有生物相容性涂層的材料被廣泛選用,如二氧化硅復合材料、溶膠-凝膠法涂層、類金剛石碳薄膜、納米多孔陽極鋁膜等。研究表明,這些材料都有作為傳感器外膜的潛力。葡萄糖傳感器外膜必須在生物體中穩(wěn)定存在以保證葡萄糖能輸送到電極,減少蛋白質的淤積并盡量緩解纖維包膜。近年來,陸續(xù)有新材料被嘗試用來減少上述影響,其中包括水凝膠[12]、膠原[13]或者是聚乳酸[14]作為保護涂層,或使用皮質類固醇抑制免疫反應[15]。而在眾多生物材料中,水凝膠是一種類似于生命組織的材料,其表面不易黏附蛋白質和細胞,在與人體血液、細胞及組織接觸時,能表現(xiàn)出良好的生物相容性。近期研究表明,三維網(wǎng)絡互穿結構的水凝膠可滿足植入傳感器外膜的要求并在水中溶脹而不溶解[16],能極大地提高傳感器在人體內的使用壽命。聚乙烯醇(PVA)是一種用途相當普遍的水溶性高分子聚合物,具有良好的抗拉強度,耐磨、絕緣性好[17];聚乙二醇(PEG)水溶性好、無毒、生物相容性好,具有廣泛的應用。然而PEG基水凝膠的力學性能較差,為提高水凝膠的強度,本文將PEG接枝到PVA上,制備綜合性能優(yōu)良的水凝膠,從而提高傳感器植入后的壽命[18]。

選用螺旋形鉑銥合金電極來擔載GOD,以提高植入式葡萄糖生物傳感器的GOD擔載量并增大工作電極的電化學活性面積。本文主要研究PVA與PEG不同配比復合水凝膠的配比對力學性能、顯微結構的影響,重點考察涂覆該復合水凝膠涂層對螺旋形鉑銥合金電極傳感器性能的影響,并研究了傳感器的抗干擾性能和長期穩(wěn)定性。

1　實驗部分

1.1　試劑與儀器

主要試劑與原料包括:GOD、牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)、戊二醛 (glutaraldehyde,GA)、聚氨酯 (polyurethanes,PU)、抗壞血酸 (ascorbic acid,AA)、尿酸 (uric acid,UA)、多巴胺 (dopamine,DA)、果糖 (fructose,Fru)、四氫呋喃(tetrahydrofuran,THF)、十二烷基聚四氧乙烯醚(Brij30)、雙組份環(huán)氧膠粘劑(Epoxy)等化學試劑均從Sigma-aldrich公司購得;聚乙烯醇(PVA 1799)、聚乙烯醇(PEG 1000)購于國藥集團化學試劑有限公司;實驗用水為18 M?·cm超純水,磷酸鹽緩沖溶液(PBS)由0.1 mol/L NaH2PO4和Na2HPO4溶液混合配制,pH值調節(jié)至7.4。

采用掃描電子顯微電鏡(scan electran microscope,SEM)S-4800(Hitachi,日本)觀測水凝膠的形貌;采用TBR4100四通道自由基檢測系統(tǒng)(World Precision Instruments,美國)對制備的電極進行計時電流測試;采用AG22000A萬能測試儀(Shimadzu,日本)對水凝膠進行力學測試;計時電流測試需要在磁力攪拌(上海辰華儀器公司)的電解池中進行;配置的GOD需要在IKa搖床(IKa儀器公司,德國)上使其均勻混合。

1.2　實驗過程

1.2.1螺旋型鉑銥電極的制備

螺旋型鉑銥電極的傳感器結構示意圖如圖1所示。主要包括Pt-Ir螺旋型工作電極、GOD、半透膜、水凝膠等。取長約4～7 cm的醫(yī)用級鉑銥絲(Φ=0.125 mm,鉑:銥=9:1),剝離去除末端1 cm左右的特氟隆涂層,在超純水中超聲處理5 min。用無水乙醇擦拭的鑷子將上述鉑銥絲沿著皮下注射針頭(30 G)緊密盤旋纏繞5～8圈,獲得外徑為1 mm、內徑約為0.85 mm的Pt-Ir線圈。將一小股纖維材料嵌入線圈內以提高GOD擔載量。

圖1　螺旋電極結構圖Fig.1 Schematic diagram of the spiral-type Pt-Ir electrode

1.2.2GOD的制備與涂覆

采用經(jīng)典的化學交聯(lián)法,以GA做為交聯(lián)劑、GOD與BSA配制成氧化酶溶液,在搖床上使其均勻混合。將上述電極垂直懸掛在可移動膠帶上,用移液器取8μL酶溶液滴涂在電極上2次,滴涂時間間隔為30 min,然后將電極在室溫條件下干燥1 h。

1.2.3Epoxy-PU半透膜的制備與涂覆

將4 mL THF、26.7mg PU、1mg Brij30及Epoxy按比例配制成Epoxy-PU溶液。將制備好的螺旋線圈型酶電極垂直懸掛在可移動膠帶上,用移液器取適量Epoxy-PU溶液滴涂到酶電極上。將涂覆了Epoxy-PU溶液的酶電極放置在室溫下干燥30 min,然后放置在80?C恒溫干燥箱中固化20 min。課題組前期的工作表明PU的最佳涂覆量為2μL[19]。固化后的電極,置于0.15 mol/L PBS緩沖溶液中,并在4?C環(huán)境下冷藏備用。

1.2.4水凝膠的制備與包覆

首先制備含量w=10%,15%,20%的PVA水凝膠并考察其機械性能,研究發(fā)現(xiàn)w=10%的PVA水凝膠機械強度較弱,容易坍塌;w=20%的PVA水凝膠雖然機械強度高,但是韌性不佳;當PVA含量w=15%時,水凝膠機械性能表現(xiàn)最優(yōu)。因此,本文選用w=15%的PVA水凝膠作為研究對象,并在此基礎上設計出不同PVA和PEG配比的復合水凝膠。

將不同質量比的PVA和PEG在加熱攪拌的條件下溶于一定量的超純水,直至溶液呈透明的黏稠狀,將溶液在室溫下自熱冷卻,制備成復合水凝膠。采用4種不同的PVA和PEG的質量比,分別為2:1,3:1,4:1和5:1。利用醫(yī)用注射器(15 G針頭)將水凝膠溶液吸入,使針頭內腔充滿水凝膠,并將上述螺旋電極塞入填滿水凝膠針頭的內腔,然后放入冰箱冷凍12 h(?20?C低溫下),將電極取出并置于室溫下解凍1 h。將包覆水凝膠的螺旋電極,置于0.15 mol/L PBS緩沖溶液中并在4?C環(huán)境下冷藏備用。

1.2.5電化學測試

本實驗采用TBR 4100電化學工作站雙電極體系:其中自制的鉑銥螺旋線圈電極為工作電極,Ag/AgCl絲為參比電極。在自制的聚四氟乙烯電化學反應池中,以PBS緩沖液為支持電解質,加入適量葡萄糖溶液,采用計時電流法對電極進行測試,且計時電流測試的控制電位為0.7 V。

我們將傳感器的靈敏度S,μA/(mol·L?1),設定為:

其中 i1和 i2分別為 15 mmol·L?1和 5 mmol·L?1葡萄糖對應的響應電流值,c1和c2分別為15 mmol·L?1和 5 mmol·L?1葡萄糖溶液濃度值。

2　結果與討論

如前文所述,選定PEG1000,固定水凝膠總量為15%,調節(jié)PVA與PEG的質量比分別為2:1,3:1,4:1和5:1。如圖2(a)所示,當PVA與PEG質量比＜4時,共混凝膠的斷裂伸長率隨著PVA含量的增加而增大;當PVA與PEG質量比為4時,此時斷裂伸長率達到最大值259.2%;當PVA與PEG質量比＞4時,共混凝膠的斷裂伸長率隨著PVA用量的增加而急劇減小。根據(jù)李亞東等[20]的研究,這種現(xiàn)象可以解釋為:PVA的羥基與PEG的醚鍵可以形成氫鍵,當PVA與PEG質量比低于某一值時,單根的PEG分子鏈可同時與多根PVA分子鏈形成分子間氫鍵,共混凝膠可以形成相互交聯(lián)的網(wǎng)絡互穿結構;另外,PVA分子內氫鍵作用力的減弱可使PVA分子鏈間的空間增大并相應減少空間位阻,導致分子鏈柔順程度增加進而提高水凝膠斷裂伸長率。然而當PVA含量過高時,PEG和PVA的自聚力遠遠大于兩者之間的氫鍵作用,因而發(fā)生相分離,相分離的PVA在共混水凝膠間形成了相應的力學薄弱點,從而導致了斷裂伸長率下降。由圖2(b)可知,隨著PEG含量的增加,共混凝膠膜的拉伸強度呈下降趨勢。這是由于PVA分子間及分子內氫鍵作用被PVA與PEG分子間氫鍵的相互作用所替代,減少了PVA分子間的交聯(lián)點,使得PVA分子間的作用力減小。此外,PEG的分子量遠低于PVA,與PVA共混降低了體系的分子鏈長度,從而導致拉伸強度的降低。同理,PEG含量升高導致的相分離也是造成拉伸強度降低的一個重要原因。

圖2　 PVA與PEG不同配比水凝膠的機械性能Fig.2 Mechanical properties of different ratios of PVA/PEG hydrogels

水凝膠外膜的結構對葡萄糖分子輸運起到至關重要的作用,它可以起到篩分作用,將一些小分子(UA、AA等)過濾掉。圖3為不同配比水凝膠的SEM圖片,如圖3(a)所示,當PVA與PEG質量比為2時,孔的直徑在300～400 nm,孔徑較小但大小均勻,孔隙率僅為16%;隨著PVA含量的增加,孔的直徑逐漸增大,當PVA與PEG質量比為3時,如圖3(b)所示,孔徑增大至500 nm,同時孔隙率增加為33%,孔的均勻性較差;當PVA與PEG質量比增加至4時,孔徑達到最大,其尺寸在500 nm～1μm,孔徑較均勻,孔隙率最高達到67%;當PVA與PEG質量比為5時,孔的直徑減小至最小,僅為20 nm,孔隙率下降至18%。通過對比可知,當PVA與PEG質量比為4時,水凝膠外膜具有最合適葡萄糖分子通過的多孔結構,同時具有有效隔絕干擾物質參與反應的功效。

不同比例水凝膠涂覆前后螺旋電極的計時安培電流響應曲線如圖4所示。當PVA與PEG質量比為2時,包覆了水凝膠的電極的線性度由未包覆前的0.994減少為0.958,靈敏度和最大電流變化幅度較小,分別從 12.5 μA/(mol·L?1)和 390 nA 增大至 15.5 μA/(mol·L?1)和 411 nA,該比例的水凝膠對螺旋電極性能影響較大。當PVA與PEG質量比為3時,包覆過水凝膠的電極的線性度從未包覆前的0.958變化為0.962,變化幅度較小;但其靈敏度變化較大,從未包覆前的12.6μA/(mol·L?1)下降至9.3μA/(mol·L?1),且最大電流值也有較大幅度的變化,從353 nA減小至306 nA。由此可知,包覆了該比例的水凝膠,其性能仍有較大影響。然而,當PVA與PEG質量比為4時,包覆了該比例的水凝膠對電極的性能基本無影響,其線性度、靈敏度、最大電流值分別由 0.993、8.8 μA/(mol·L?1)和 280 nA,變化為 0.997、8.7 μA/(mol·L?1)和 281 nA,兩者的線性對比如圖5所示,所以該比例的水凝膠最適合作為電極的外層生物膜。當PVA與PEG質量比為5時,該比例的水凝膠又對電極的性能產生了一定程度的影響,尤其是包覆了水凝膠后,其最大電流由423 nA變化至388 nA,另外2個性能指標也有些許變化。綜上所述,最佳水凝膠配方為PVA與PEG質量比為4,包覆了該比例的水凝膠對螺旋電極的性能影響最小。

圖3　不同配比的PVA與PEG水凝膠的SEM圖片:(a)PVA/PEG=2;(b)PVA/PEG=3;(c)PVA/PEG=4;(d)PVA/PEG=5Fig.3 SEM images of different ratios of PVA/PEGhydrogels:(a)PVA/PEG=2;(b)PVA/PEG=3;(c)PVA/PEG=4;(d)PVA/PEG=5

圖4　不同比例水凝膠涂覆前后螺旋電極的計時安培電流響應曲線Fig.4 Amperometric response of uncoated and different ratios of PVA/PEG hydrogels coated glucose sensors

圖5　 未包覆水凝膠以及PVA/PEG=4水凝膠包覆過后的電極的線性圖Fig.5 Linear fi tting of amperometric responsefor uncoated and PVA/PEG=4 hydrogels coated glucose sensors

本文最終選用優(yōu)化后的配比和材料——2μL PU和PVA與PEG質量比為4的水凝膠涂覆螺旋電極,對其進行長期穩(wěn)定性和抗干擾性測試,如圖6所示。電極存放在4?C冰箱內,每隔3 d測試1次,共測試11次,圖6(a)為電極在11個周期中的計時電流響應圖,在經(jīng)過31 d后,響應電流仍可達到初始信號的90%以上,表明包覆的水凝膠對傳感器的性能影響較小,傳感器的重復性較好,可滿足長期植入的要求。圖6(b)為傳感器的靈敏度隨時間的變化,結果表明,在整個測試過程中,傳感器的靈敏度的變化范圍小于18%,傳感器靈敏度的變化在可接受的范圍。

圖6　 PVA/PEG=4:1時:(a)電極長期穩(wěn)定性測試;(b)電極的靈敏度隨時間的變化Fig.6 When PVA/PEG=4:1:(a)long term stability test;(b)response of sensitivity during experimental period

水凝膠作為傳感器的最外層膜起著高效選擇性滲透以及阻擋一些體內電化學活性干擾物(如UA、AA、DA)的作用。本傳感器的工作電位為0.7 V,在此電位下,UA、AA和DA容易被電化學氧化,產生干擾電流,從而影響傳感器測試結果。考慮到人體血糖內的葡萄糖濃度至少要高于干擾物濃度30倍,將抗干擾實驗設置為分別注入5 mmol/L葡萄糖、0.5 mmol/L AA、0.5 mmol/L UA、0.5 mmol/L DA以及0.5 mmol/L Fru。如圖7所示,正常生理濃度范圍內的AA(0.5 mmol/L),與5 mmol/L的葡萄糖相比僅僅產生較小的電流響應,值得注意的是0.5 mmol/L的DA產生的電流對傳感器響應有一定程度的影響,而UA和Fru產生的電流響應幾乎可以忽略不計。實驗結果表明,包裹了PVA與PEG質量比為4:1的水凝膠的電極對葡萄具有較好的選擇性。

圖7　 PVA/PEG=4:1時電極的抗干擾測試Fig.7 Anti-interference test of PVA/PEG=4:1

3　結 論

本文引入具有良好生物相容性的水凝膠作為鉑銥螺旋電極的最外層膜,考察不同比例PVA/PEG對復合水凝膠力學性能以及傳感器性能的影響。研究表明,當PVA與PEG質量比為4:1時,水凝膠的機械性能最佳、孔徑為500 nm～1μm、孔隙率高達67%,均勻的孔徑和高孔隙率在阻擋人體內電化學活性干擾物的同時,傳感器的靈敏度可以調控在10μA/(mol·L?1)左右。此外,涂覆最佳復合水凝膠的電極具有良好的重復性和長期穩(wěn)定性,表明所制備的傳感器滿足長期植入的要求。

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簡 訊

上海第二工業(yè)大學獲得2018年度上海市青年科技英才揚帆計劃資助

2018年度上海市青年科技英才揚帆計劃評選工作已經(jīng)結束。上海市科委組織,經(jīng)專家網(wǎng)上評審、見面會考評等程序,共遴選出300人擬予資助。我校電子廢棄物資源化協(xié)同創(chuàng)新中心王瑞雪的“分段加熱條件下廢棄LCD與電石渣制備復合型CMA環(huán)保型融雪劑的研究”獲得立項資助,項目研究期為3年,資助金額20萬元。