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        水貂阿留申病膠體金免疫層析試紙條與對流免疫電泳對比試驗

        2018-04-14 01:54:15任二軍劉進(jìn)軍韓學(xué)良
        今日畜牧獸醫(yī) 2018年1期
        關(guān)鍵詞:水貂膠體金紙條

        劉 潔,李 偉,任二軍,劉進(jìn)軍,韓學(xué)良

        (石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院,河北石家莊050041)

        水貂阿留申病(Aleutian disease of mink,AD)又稱漿細(xì)胞增多癥,是由細(xì)小病毒科的水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus,ADV)引起水貂的一種慢性、消耗性、免疫抑制性傳染病。成年水貂病理變化及臨床癥狀為高免疫球蛋白血癥、動脈炎及腎小球腎炎,水貂皮張質(zhì)量及繁殖能力下降,容易繼發(fā)其他疾病,幼貂常發(fā)生急性間質(zhì)性肺炎甚至死亡[1]。目前沒有有效的疫苗預(yù)防,也無特效藥治療,所以對貂群進(jìn)行快速高效靈敏的檢測從而消除AD抗體陽性水貂就成了控制該病最有效的方法。目前國內(nèi)外研究出診斷AD檢測方法主要有碘凝集實驗、對流免疫電泳(Counter Immunoelectrophoresis,CEP)、基因芯片法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)法、膠體金免疫層析試紙條(gold immunochromatography assay,GICA)、熒光定量PCR法等。本試驗利用GICA和CEP兩種方法對河北某貂場隨機(jī)采取的血清樣本進(jìn)行檢測,并對二者的符合情況及檢測成本進(jìn)行比較。

        1 材料

        1.1 試驗動物

        隨機(jī)選取河北某貂場籠養(yǎng)水貂192只。

        1.2 儀器

        電泳槽及電泳儀(北京六一廠)、微波爐、電子天平、移液器(eppendorf),打孔器、砂輪、注射器針頭、玻璃板(10cm×10cm×1mm)、100ml錐形瓶、肝素鈉抗凝毛細(xì)采血管(20ul)、毛細(xì)管盒、工業(yè)橡皮泥、剪指刀。

        1.3 試劑

        CEP診斷抗原和陽性血清來自丹麥進(jìn)口分裝;電泳緩沖液(Tris base 2.408g,巴比妥鈉 4.064g,巴比妥 1.024g,溶于 500mL蒸餾水,用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.4-8.6);1.0%瓊脂糖凝膠;ADV抗體膠體金快速檢測試紙條(貨號:9903)由北京納百景奕(NBGen)生物科技有限公司提供。

        2 方法

        2.1 血樣采集

        一人保定水貂,一人用剪指刀剪掉水貂趾甲,用毛細(xì)采血管采血,虹吸至2/3處,用工業(yè)橡皮泥封口,放入毛細(xì)管盒,并做好標(biāo)記。常溫或4℃冰箱過夜放置自然分離血清。

        2.2 試紙條檢測

        2.2.1 樣品準(zhǔn)備

        將采血梳用記號筆編號,寫清籠舍號,采血后,按標(biāo)記順序粘貼在標(biāo)記好的采血梳粘性凹槽內(nèi),并對齊下沿,以便后期操作。

        2.2.2 操作步驟

        根據(jù)待檢樣本數(shù)量,取出足量的反應(yīng)微孔,將其放置于微孔架上備用;用滴管向微孔中加入標(biāo)記刻度量的ADV快速檢測稀釋液 (約100ul),將下端對齊的采血梳按標(biāo)記順序插入反應(yīng)微孔,可稍微晃動,以保證血樣充分溶解;浸泡兩分鐘后,取出采血梳;插入待檢試紙條,計時5min;用剪刀剪掉吸水端,終止反應(yīng)。

        2.2.3 結(jié)果判定

        質(zhì)控線(C線)顯色,檢測線(T線)不顯色,結(jié)果為陰性;質(zhì)控線(C線)顯色,檢測線(T線)也顯色,結(jié)果為陽性。

        2.3 對流免疫電泳檢測

        實驗方法步驟及結(jié)果判定參考本課題組之前發(fā)表文章[2]。

        3 結(jié)果

        CEP和GICA兩種檢測方法的陽性檢出率見表1,符合率見表2。從表1可以看出,GICA的檢出率為57.81%,CEP檢出率為56.25%,GICA的檢出率比CEP高1.56%。從表2可以看出,CEP陽性的GICA檢測全部為陽性,CEP陰性、GICA陽性的為3只,不符合的數(shù)量為3只,GICA和CEP檢出都為陽性的108只,都為陰性的81只,符合數(shù)是189只,符合率是98.44%。

        表1 對流免疫電泳與試紙條的陽性檢出率

        表2 對流免疫電泳與試紙條的符合率

        4 討論

        1972-1974年Cho等在加拿大首次應(yīng)用CEP診斷AD,該方法原理是利用ADV抗體(被檢水貂血清)和抗原(臟器或細(xì)胞抗原)在電場作用下進(jìn)行反應(yīng),抗原由陰極向陽極移動,而抗體則由陽極向陰極運動,二者在兩孔之間接觸,在瓊脂凝膠中形成肉眼可見的灰白色沉淀線[3]。CEP法重復(fù)性好,與病理剖檢結(jié)果的符合率達(dá)到100%;特異性強(qiáng),達(dá)到97%;特異性高則敏感性低,敏感性僅75%,因此當(dāng)水貂在感染ADV初期或轉(zhuǎn)歸期時由于抗體水平較低則可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果,這也是每年在11月份左右只檢疫1次而不能檢測出所有陽性水貂的重要原因[4]。在AD的各種診斷方法中,CEP是世界公認(rèn)的并且應(yīng)用最為廣泛的。但該法仍存在一些弊端,結(jié)果判定的誤差較大,抗原多是細(xì)胞抗原或臟器抗原等全病毒抗原,存在著散毒的危險,耗時較長,需要特殊儀器設(shè)備和較高的技術(shù)支持,不適合于現(xiàn)場診斷。GICA是以硝酸纖維素膜為固相載體,通過毛細(xì)管作用原理,以膠體金為標(biāo)記物來顯示結(jié)果的一種新型的檢測技術(shù)[5]。該方法操作簡便、快捷,一般只要5~10min便可得到檢測結(jié)果,且需要血量少,只需一滴血即可,減少了感染的機(jī)會。結(jié)果清楚、易于判斷、誤差小,不需要任何儀器、成本低廉,對操作人員技術(shù)要求不高,不受外界環(huán)境的影響等,非常適用于現(xiàn)場及自動化檢測,缺點是由于采血后需要按標(biāo)記順序?qū)⒉裳堈迟N在標(biāo)記好的采血梳凹槽內(nèi),且檢測試劑試紙條取出后應(yīng)盡快使用,必須同時采血同時檢測,增加現(xiàn)場工作勞動量。

        本研究共檢測水貂血清樣品192個,采用GICA和CEP進(jìn)行檢測,結(jié)果GICA的陽性檢出率為57.81%,CEP檢出率為56.25%,二者符合率是98.44%。CEP檢測陽性的GICA檢測全部為陽性,CEP陰性、GICA陽性的為3只,不符合的數(shù)量為3只,而在檢測中發(fā)現(xiàn)不符合的這3份血清T線顯色條帶相對較淺,推測可能是由于血清中AD抗體含量較低,而GICA敏感性比CEP相對較高,造成CEP未檢出。徐磊等用PBS對AD陽性血清進(jìn)行倍比稀釋,用GICA分別進(jìn)行檢測,結(jié)果當(dāng)血清稀釋倍數(shù)至8倍時,仍能用GICA檢測出,而傳統(tǒng)的CEP法在血清稀釋到4倍就不能檢出,推測GICA的敏感性是CEP的至少2倍。他們同時用GICA和CEP分別檢測了45只水貂,結(jié)果GICA陽性率為71.1%,CEP陽性率為62.2%,說明GICA法檢出率較高,敏感性較好[6]。在檢測成本方面,CEP法1只份抗原成本為2.00元,加上凝膠、緩沖液、陽性血清等每只的檢測成本至少為2.50元,而GICA一只份成本也在2.50元左右,成本相當(dāng)。

        5 結(jié)論

        膠體金免疫層析試紙條檢測阿留申病有快速、簡單、敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點,檢測成本和對流免疫相當(dāng),還可進(jìn)行現(xiàn)場檢測,可以代替對流免疫電泳檢測方法。

        [1]閆喜軍,肖家美,籍玉林.我國水貂阿留申病流行現(xiàn)狀、特點及防治技術(shù)[J].特種經(jīng)濟(jì)動植物,2004,(05):44.

        [2]任二軍,劉潔,劉進(jìn)軍,等.水貂阿留申病碘凝集與對流免疫電泳檢測方法比較[J].經(jīng)濟(jì)動物學(xué)報,2017,(3):134-136.

        [3]Cho Hj Fau-Ingram D G,Ingram D G.Antigen and antibody in Aleutian disease in mink.II.The reaction of antibody with the Aleutian disease agent using immunodiffusion and immunoelectroosmophoresis[J].(0008-4050(Print)).

        [4]于凱,倪佳,馮二凱,等.水貂阿留申病診斷抗原研究概述[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2017,(4):116-119.

        [5]莊金秋,梅建國,沈志強(qiáng).膠體金免疫層析技術(shù)在獸醫(yī)臨床診斷中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國動物檢疫,2012,(9):70-75.

        [6]徐磊.水貂阿留申膠體金免疫層析診斷方法的初步建立[D].City:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2010.

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