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(淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,江蘇淮安 223001)

多糖是自然界廣泛存在的一類生物信息大分子。多糖不僅廣泛參與各種生命活動(dòng),而且具有多種生物活性功能。大多數(shù)動(dòng)植物多糖易溶于熱水,不易溶于冷水,遇到有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮等能沉淀。目前,常用的多糖化學(xué)提取方法有水提取法、堿提取法、酸提取法、酶解法等。其中,水提取法是最為常見的提取方法,此方法具有操作條件溫和、成本低、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[1]。近年來,國內(nèi)外研究人員從不同的生物體中提取了多種活性多糖,發(fā)現(xiàn)其具有增強(qiáng)免疫力[2]、抗腫瘤[3]和抗凝血[4]等生理調(diào)節(jié)功能,可作為保健食品和藥物中的功能性成分而被越來越廣泛的應(yīng)用于食品和醫(yī)藥工業(yè)。

櫛江珧?qū)佘涹w動(dòng)物門、雙殼綱、鶯蛤目、江珧蛤科、曲江珧蛤?qū)賉5]。櫛江珧是一種大型海洋底棲雙殼貝類,主要分布在溫帶和熱帶近海海域(主要是印度洋及太平洋海域)。櫛江珧在我國分布廣泛,北起遼東半島南至瓊州海峽,其中南海櫛江珧的種類及自然產(chǎn)量最多,山東北部沿海、福建及泉州等地也有豐富的野生櫛江珧資源[6-7]。櫛江珧是味道鮮美的海中珍品,其閉殼肌特別肥大,干品俗稱“珧柱”,民間及中醫(yī)均認(rèn)為其具有滋陰補(bǔ)腎和調(diào)中功效,并有抗癌作用[8]。海洋軟體動(dòng)物有顯著的藥理活性,而且其活性歸功于多糖的存在[10]。Li等[11]將提取的扁玉螺多糖,通過DEAE-52陰離子交換柱分離,得到3個(gè)多糖組分:GDPS-1、GDPS-2和GDPS-3,體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3個(gè)組分均能促進(jìn)脾細(xì)胞的增殖從而具有免疫活性。張艷軍等[10]采用水提法,在pH=6.75的條件下提取牡蠣多糖,得率為2.56%。Qiao等[12]從三角帆蚌中得到三個(gè)純化多糖組分HCPS-1、HCPS-2、HCPS-3,通過體外抗氧化模型評(píng)價(jià)證明該多糖在體外可清除羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基,并能還原鐵離子和螯合亞鐵離子。仲娜等[13]從櫛孔扇貝中得到多糖FAGP,通過紙層析的方法得出FAGP含有Glc、Man、Rha、Fuc、Gal。

目前對(duì)于櫛江珧的研究主要集中于人工育苗和養(yǎng)殖、優(yōu)良品種的篩選、遺傳多樣性的評(píng)價(jià)和活性蛋白的分離提取等方面。尚未有關(guān)于櫛江珧粗多糖(crudeAtrinapectinatapolysaccharides,CAPPS)提取和活性研究的相關(guān)報(bào)道。鑒于此,本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化櫛江珧粗多糖的提取工藝,為櫛江珧多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。同時(shí)進(jìn)一步對(duì)粗多糖進(jìn)行組成和紅外光譜等分析,并對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行了研究,為櫛江珧多糖的深入開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

表1　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素和水平Table 1　Factors and levels used for RSM

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

冷凍的櫛江珧閉殼肌采購自遼寧大連;無水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、硫酸、苯酚、肌醇、鹽酸羥胺、乙酸酐、吡啶均為國藥分析純;鼠李糖(純度99.0%)、阿拉伯糖(純度99.0%)、巖藻糖(純度99.0%)、木糖(純度99.1%)、甘露糖(純度99.5%)、葡萄糖(純度99.5%)和半乳糖(純度99.5%)德國Dr.Ehrenstorfer公司;氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)、還原性輔酶Ⅰ(NADH)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、菲洛嗪、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、氯化鐵、氯化亞鐵、硫酸亞鐵、水楊酸、維生素C和EDTA-2Na等上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

AG R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀瑞士Buchi公司;HK-08B型流水式中藥粉碎機(jī)廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司;J-26 XP型冷凍離心機(jī)美國Beckman Coulter公司;TU-1810型紫外可見分光光度計(jì)北京普析;7890A氣相色譜儀美國Agilent公司;Nicolet 5700傅立葉變換紅外光譜儀美國賽默飛公司。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1櫛江珧多糖的提取工藝櫛江珧閉殼肌→勻漿→無水乙醇脫脂→離心→沉淀物烘干→櫛江珧粉→熱水浸提→離心→抽濾→濃縮→醇沉→離心→烘干→櫛江珧粗多糖。

1.2.1.1原料預(yù)處理冷凍的櫛江珧閉殼肌,冷藏解凍后破碎勻漿。向勻漿中加入無水乙醇至終濃度為75%,以脫去組織中的脂肪。之后將勻漿液5000 r/min離心20 min,保留沉淀物,60 ℃烘干后用中藥粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎,80目篩分,得櫛江珧粉。

1.2.1.2熱水浸提取適量櫛江珧粉,加一定體積的蒸餾水,在一定溫度下浸提。提取液于5000 r/min下離心20 min,上清液經(jīng)抽濾,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/10,放于4 ℃待用。濾渣相同條件下再提取1次。合并濃縮液,加入無水乙醇至體積分?jǐn)?shù)為75%,充分振蕩,4 ℃靜置12 h后,5000 r/min離心20 min,保留沉淀物,60 ℃烘干,即為櫛江珧多糖粗提物。

1.2.2脫蛋白采用Sevage法進(jìn)行脫蛋白處理[14]。按照粗提物溶液與Sevage試劑(氯仿∶正丁醇=5∶1 V/V)5∶1混合,劇烈振蕩30 min,靜置15 min,于2000 r/min離心10 min,保留上層清液,清液重復(fù)上述操作3次。所得的清液在50 ℃濃縮至適量。濃縮液按1∶9的比例加入90%的無水乙醇,劇烈振蕩,在4 ℃的冰箱中靜置12 h,7000 r/min離心20 min,保留沉淀物。將沉淀物在50 ℃烘干,得到去除蛋白后的櫛江珧粗多糖。

1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)置了提取溫度(55、65、75、85、95、100 ℃)、液固比(15∶1、25∶1、35∶1、45∶1、55∶1 mL/g)以及提取時(shí)間(120、180、240、300、360 min)三個(gè)單因子,固定因素水平為提取溫度75 ℃、液固比35∶1及提取時(shí)間4 h,分別考察這三個(gè)因素對(duì)櫛江珧粗多糖得率的影響。

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,選取合適的水平,通過中心組合實(shí)驗(yàn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)。

1.2.4櫛江珧粗多糖的測(cè)定與得率計(jì)算

式中:w1為櫛江珧多糖粗提物重量;w2為櫛江珧組織粉末重量。

1.2.5理化分析總糖含量采用苯酚-硫酸法測(cè)定[15];蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定[16];糖醛酸含量參照Terho等[17]的方法進(jìn)行測(cè)定;硫酸基含量采用氯化鋇-明膠法進(jìn)行測(cè)定[18]。

1.2.6紅外光譜分析烘干適量的KBr,稱取0.2～0.3 g的溴化鉀粉末,以及2～3 mg粗多糖樣品,在瑪瑙研缽中均勻研磨,用壓片機(jī)把混勻的粉末壓成半透明狀的薄片。設(shè)定傅立葉變換紅外光譜儀的掃描波長(zhǎng)為4000～500 cm-1,先單獨(dú)用KBr粉末壓成薄片做空白實(shí)驗(yàn),再用加過樣品的薄片進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7粗多糖的組成成分測(cè)定稱取粗多糖約5 mg,置于安瓿瓶中,加入2 mol/L的三氟乙酸5 mL,酒精噴燈封口,在120 ℃條件下水解反應(yīng)2 h。水解液在55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干,加入2.5 mL的甲醇,再次蒸干,如此反復(fù)5次,蒸干后備用。隨后按照YANG等的方法,使用氣相色譜儀進(jìn)行測(cè)定[19]。

色譜條件:毛細(xì)管色譜柱(HP-1 MS,30 m×0.250 mm×0.25 μm),火焰離子檢測(cè)器(FID),色譜柱升溫程序?yàn)?20 ℃保持3 min,以3 ℃每分鐘的速度升溫至210 ℃,210 ℃保持10 min;N2流速為25 mL·min-1,H2流速為40 mL·min-1,空氣流速為400 mL·min-1。

1.2.8粗多糖的抗氧化活性測(cè)定以超氧自由基清除活性、羥基自由基清除活性和Fe2+離子螯合能力測(cè)定作為衡量櫛江珧粗多糖抗氧化能力的參考標(biāo)準(zhǔn)。以抗壞血酸VC作為對(duì)照,按照GUO等[20]的方法測(cè)定超氧自由基清除活性和羥基自由基清除活性;以EDTA-2Na作為對(duì)照,按照LIU等[21]的方法測(cè)定Fe2+離子螯合能力。

1.2.9數(shù)據(jù)處理采用Origin 8.0和Design-Expert 10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1浸提溫度對(duì)粗多糖得率的影響如圖1所示,在55～95 ℃時(shí),櫛江珧粗多糖的得率隨著溫度的提高而顯著增加,原因可能是隨著溫度的增加,分子運(yùn)動(dòng)的速率增加,分子擴(kuò)散速率增加,從而提高多糖的溶解性[22-23]。在95 ℃時(shí)粗多糖的得率達(dá)到最高值21.06%。在95～100 ℃時(shí),粗多糖得率開始呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),原因可能是在高溫條件下多糖分子會(huì)發(fā)生降解或者被破壞[24]。綜合考慮多糖提取的成本和能耗等,浸提溫度設(shè)置在85～95 ℃范圍內(nèi)較合適,因此選擇90 ℃作為中心實(shí)驗(yàn)點(diǎn)。

圖1　溫度對(duì)櫛江珧粗多糖提取得率的影響Fig.1　Effect of extraction temperature on CAPPS yield注:不同小寫字母代表有顯著差異(p<0.05),圖2、圖3同。

2.1.2液固比對(duì)多糖得率的影響當(dāng)液固比較小時(shí)會(huì)造成多糖溶解不完全而得率較低,如圖2所示,當(dāng)液固比從15∶1增加到45∶1時(shí),多糖得率逐漸提高,其中,液固比從15∶1到35∶1時(shí),多糖的得率遞增趨勢(shì)明顯,從35∶1增加到45∶1時(shí),多糖得率呈小幅增加。原因可能是當(dāng)水的比例增加時(shí),多糖分子的擴(kuò)散滲透能力持續(xù)提高,多糖得率也大幅提高;液固比到達(dá)一定值時(shí),隨著水的增多,多糖分子的溶解能力無法進(jìn)一步大幅提高,多糖得率增勢(shì)減緩[25]。當(dāng)水的比例由45∶1繼續(xù)增加時(shí),櫛江珧多糖的得率呈下降趨勢(shì),可能是在熱水提取后的離心、濃縮等操作中,水分過多導(dǎo)致多糖損失較大?？紤]到多糖得率及成本、能耗,選擇液固比在35∶1為宜。

圖2　液固比對(duì)櫛江珧粗多糖得率的影響Fig.2　Effect of solvent-to-solid on CAPPS yield

2.1.3提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響如圖3所示,當(dāng)提取時(shí)間在120～180 min的范圍內(nèi)時(shí),多糖得率隨時(shí)間的增加而增大;在180～240 min的范圍內(nèi)時(shí),多糖得率仍然呈上升趨勢(shì),但上升趨勢(shì)變緩;當(dāng)提取時(shí)間超過240 min時(shí)多糖得率呈明顯的下降趨勢(shì),其原因可能是在一定提取時(shí)間下,多糖隨溫度的升高逐漸溶出,但加熱時(shí)間過長(zhǎng),會(huì)導(dǎo)致多糖被包裹在加熱變性的蛋白質(zhì)內(nèi)部[26],多糖的得率降低。因此選擇210 min作為中心實(shí)驗(yàn)點(diǎn)。

圖3　提取時(shí)間對(duì)櫛江珧粗多糖得率的影響Fig.3　Effect of extraction time on CAPPS yield

2.2　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

運(yùn)用響應(yīng)曲面法確定櫛江珧粗多糖提取工藝的最佳條件,本實(shí)驗(yàn)以提取溫度、提取時(shí)間和液固比作為變量因素,考察其對(duì)櫛江珧粗多糖得率的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2　響應(yīng)曲面法優(yōu)化設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2　Program and experimental results of RSM

2.2.1回歸模型統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)由Design expert 10.0軟件分析得到三元二次回歸方程:Y=18.08+0.052A+0.070B+0.1C+0.050AB-0.15AC+0.090BC-0.074A2-0.13B2-0.086C2。

表3　回歸方差分析結(jié)果Table 3　Analysis of variance of regression equation

注：a表示影響顯著(p<0.05)。

2.2.2響應(yīng)曲面圖分析及結(jié)果驗(yàn)證響應(yīng)曲面圖能形象地描述二次回歸方程,直觀地反映櫛江珧粗多糖提取工藝參數(shù)的交互作用對(duì)櫛江珧粗多糖得率的影響是否顯著,等高線為橢圓形表示兩因素交互作用顯著,而圓形則說明交互作用不顯著[27]。圖形的響應(yīng)曲度可以反映因素兩兩交互效應(yīng)的強(qiáng)弱,響應(yīng)曲面圖的拋物面開口向下,且具有極大值點(diǎn),說明所選因素水平里包括了最優(yōu)化的組合[28]。

圖4　各個(gè)因素交互作用對(duì)櫛江珧粗多糖得率影響的響應(yīng)面圖 Fig.4　Response surface plots of the interactive effects of three factors on CAPPS yield

如圖4a所示,提取溫度和提取時(shí)間交互作用的p值為0.2293,等高線近圓形,說明兩者差異不顯著,交互作用不大。溫度升高時(shí)雖然會(huì)加劇分子運(yùn)動(dòng)促進(jìn)溶解,但是高溫同樣會(huì)破壞多糖分子,造成最終多糖得率降低,因此溫度必須保持在一個(gè)合理的范圍內(nèi)。同樣過長(zhǎng)的浸提時(shí)間可能會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)而使得多糖得率下降。因此提取時(shí)間同樣必須保持在一個(gè)合理的范圍內(nèi)。如圖4b所示,提取溫度和液固比交互作用的p值為0.0036,等高線近橢圓形,說明兩者,交互作用顯著。在一定范圍內(nèi),多糖得率隨液固比和提取溫度的增加而升高,液固比在初始增加時(shí),會(huì)促進(jìn)多糖溶出,但溶劑量的持續(xù)增加會(huì)影響提取體系的傳熱和傳質(zhì),此時(shí)多糖的得率呈下降趨勢(shì);而液固比過低則無法完全溶解多糖,因此液固比也只能控制在一個(gè)合適的范圍內(nèi)。圖4c中,提取時(shí)間與液固比之間同樣存在相似的交互作用,提取時(shí)間和液固比交互作用的p值為0.0439,等高線近橢圓形,說明兩者交互作用顯著。

通過響應(yīng)面分析得出最佳條件:提取溫度94 ℃,提取時(shí)間215 min,液固比34∶1 (mL/g),在此條件下,模型預(yù)測(cè)的櫛江珧粗多糖的得率為18.21%。對(duì)此工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證,得到粗多糖得率為18.37%,基本與理論值一致。

2.3　粗多糖基本組成分析

如表4所示,櫛江珧粗多糖的基本組成成分中糖含量為94.39%。除此之外,還含有少量的蛋白質(zhì)(2.8%)、水分(2.1%)以及少量的糖醛酸(0.63%)和硫酸基(0.08%)。與櫛江粗多糖不同，翟呂平等[29]發(fā)現(xiàn)魷魚軟骨粗多糖中總糖含量為75.52%,糖醛酸含量為27.62%,硫酸基含量為23.08%。根據(jù)殷秀紅等[30]對(duì)紫貽貝粗多糖的研究,發(fā)現(xiàn)其總糖含量(59.60%)遠(yuǎn)低于櫛江粗多糖，但糖醛酸含量(4.20%)和硫酸基含量(2.09%)則高于櫛江珧粗多糖。

表4　櫛江珧粗多糖組成成分Table 4　Composition of CAPPS

2.4　紅外分析譜圖

櫛江珧粗多糖的紅外圖譜如圖5所示,樣品在4000～400 cm-1區(qū)域具有多糖類物質(zhì)的特征吸收峰,在3401.72 cm-1處出現(xiàn)了寬而強(qiáng)的羥基的O-H的振動(dòng)的吸收峰[31];在2933.39 cm-1處出現(xiàn)了烷基的C-H伸縮振動(dòng)吸收峰;在1401.92 cm-1處出現(xiàn)了烷基的C-H邊角振動(dòng)的吸收峰;在1654.33 cm-1處出現(xiàn)了羧基的C=O非對(duì)稱的伸縮振動(dòng);在922.59 cm-1處出現(xiàn)吡喃糖中C-O-C非對(duì)稱環(huán)。在750 cm-1出現(xiàn)的吸收峰再次證明有吡喃糖[32]。

圖5　櫛江珧粗多糖紅外譜圖Fig.5　IR spectra of CAPPS

2.5　粗多糖的單糖組成分析

圖6為混合標(biāo)準(zhǔn)單糖糖腈衍生化后的氣相色譜圖,由圖6可知26.084 min是鼠李糖,26.497 min是阿拉伯糖,26.960 min是巖藻糖,27.033 min是木糖,34.042 min是甘露糖,34.383 min是葡萄糖,35.276 min是半乳糖,40.144 min是肌醇六乙酸酯。圖7為櫛江珧粗多糖水解后經(jīng)衍生化處理的氣相色譜圖。由圖7可知,樣品在34.279 min出峰,對(duì)照?qǐng)D6可知櫛江珧粗多糖主要是由葡萄糖組成。40.049 min處的肌醇六乙酸酯峰的峰面積較大,可能是由于作為內(nèi)標(biāo)物時(shí),其絕對(duì)量相對(duì)于樣品高而導(dǎo)致的。

圖6　標(biāo)準(zhǔn)單糖氣相色譜圖Fig.6　GC spectrum of monosaccharide reference

圖7　櫛江珧粗多糖的氣相色譜圖Fig.7　GC spectrum of CAPPS

2.6　櫛江珧粗多糖抗氧化活性

2.6.1超氧自由基清除活性由圖8得知,隨著多糖濃度的增加,超氧自由基清除活性呈上升趨勢(shì),在濃度范圍1.6～4.0 mg/mL時(shí)趨于穩(wěn)定。在濃度4.0 mg/mL時(shí),CAPPS對(duì)超氧自由基清除率為78.22%。CAPPS清除能力(IC50=0.599 mg/mL)顯著高于VC。

圖8　櫛江珧粗多糖的超氧自由基清除活性Fig.8　Scavenging effects of CAPPS on superoxide radical 注:不同小寫字母代表樣品和對(duì)照在相同濃度比較時(shí)有顯著差異,p<0.05,圖9、圖10同。

2.6.2羥基自由基清除活性由圖9可知,櫛江珧粗多糖具有羥基自由基清除能力。在濃度范圍0.4～3.2 mg/mL內(nèi),隨著多糖濃度的增加,羥基自由基清除活性呈上升趨勢(shì),在3.2～4.0 mg/mL內(nèi)羥基自由基清除率趨于穩(wěn)定。在4.0 mg/mL時(shí),對(duì)羥基自由基清除率達(dá)到86.78%。櫛江珧粗多糖對(duì)羥基自由基的清除率(IC50=1.01 mg/mL)顯著低于VC(IC50=0.39 mg/mL)。本研究提取的粗多糖對(duì)羥基自由基的清除活性與孫麗平等[33]研究的烏鱧粘多糖對(duì)羥基自由基的清除活性相當(dāng)。

圖9　櫛江珧粗多糖的羥基自由基清除活性Fig.9　Scavenging effects of CAPPS on hydroxyl radical

2.6.3Fe2+螯合能力測(cè)定由圖10得知,櫛江珧粗多糖具有一定的金屬離子螯合能力。在濃度范圍0.025～0.8 mg/mL內(nèi),隨著多糖濃度的增加,金屬離子螯合能力呈上升趨勢(shì)(IC50=0.29 mg/mL),在0.8～4.0 mg/mL范圍內(nèi),金屬螯合能力趨向穩(wěn)定。在濃度為4.0 mg/mL時(shí),粗多糖金屬離子螯合能力為82.79%。由此可見,櫛江珧粗多糖是很好的金屬離子螯合劑。蔣長(zhǎng)興等[34]發(fā)現(xiàn)青蛤多糖高濃度時(shí)對(duì)金屬離子的鰲合能力較強(qiáng),當(dāng)粗多糖濃度為4.0 mg/mL時(shí),金屬離子的鰲合能力為95.1%。

圖10　櫛江珧粗多糖的Fe2+螯合能力Fig.10　Chelating effects of CAPPS on Fe2+ iron

3　結(jié)論

本研究通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),得出了提取櫛江珧粗多糖的最佳提取工藝:提取溫度94 ℃,提取時(shí)間215 min,液固比34∶1 (mL/g)。在此條件下,櫛江珧粗多糖的得率為18.37%。通過基本組成分析,發(fā)現(xiàn)櫛江珧粗多糖中總糖含量為94.39%、蛋白含量為2.8%,糖醛酸為0.63%,硫酸基含量0.08%。通過紅外光譜掃描分析和氣相色譜分析,表明該粗多糖主要單糖組分是葡萄糖?？寡趸詼y(cè)定結(jié)果表明櫛江珧粗多糖具有一定的超氧自由基清除活性、羥基自由基清除活性和金屬螯合能力。本文為櫛江珧多糖活性研究以及活性與成分、結(jié)構(gòu)的關(guān)系探討提供理論依據(jù)。

[1]李莉. 文蛤多糖的提取純化、結(jié)構(gòu)分析及抗氧化、免疫活性初步研究[D].無錫:江南大學(xué),2015.

[2]Sheu S C,Lyu Y,Lee M S,et al. Immunomodulatory effects of polysaccharides isolated fromHericiumerinaceuson dendritic cells[J]. Process Biochemistry,2013,48(9):1402-1408.

[3]林俊,李萍,陳靠山. 近5年多糖抗腫瘤活性研究進(jìn)展[J].中國中藥志,2013,38(8):1116-1125.

[4]梅天笑,王小鶯,萬根,等. 多糖的修飾及其抗凝血活性研究進(jìn)展[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,35(5):1108-1113.

[5]陳楨. 櫛江珧(Atrinapectinata),魁蚶(Scapharcabroughtonii)不同群體的遺傳多樣性研究[D]. 青島:中國海洋大學(xué),2011.

[6]董存有. 櫛江珧生態(tài)學(xué)的初步觀察[J]. 四川動(dòng)物,1993,12(4):29-30.

[7]王梅芳,余祥勇,王如才. 櫛江珧生殖細(xì)胞的發(fā)生[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2000,30(3):441-446.

[8]金貽郎,林乾良,竇昌貴,等. 舟山地區(qū)海產(chǎn)藥用動(dòng)物初步調(diào)查報(bào)告[J]. 浙江中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1980(3):22-29.

[9]Periyasamy N,Srinivasan M, Balakrishnan S. Antimicrobial activities of the tissue extracts of Babylonia spirata Linnaeus,1758(Mollusca:Gastropoda)from Thazhanguda southeast coast of India[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine,2012,2(1):36-40.

[10]Li X,Zhao L,Zhang Q H, et al. Purification,characterization and bioactivity of polysaccharides from Glossaulax didyma[J]. Carbohydrate Polymers,2014,102:912-919.

[11]張艷軍,李超柱,彭重威,等. 牡蠣多糖提取工藝的研究[J]. 食品研究與開發(fā),2012,33(1):26-28.

[12]Qiao D L,Ke C,Hu B,et al. Antioxidant activities of polysaccharides fromHyriopsiscumingii[J]. Carbohydrate Polymers,2009,78(2):199-204.

[13]仲娜,羅曉濱. 扇貝糖蛋白中蛋白及多糖的組成[J]. 海峽藥學(xué),2005,17(4):45-48.

[14]Zhang S P,Du X X,Zhou Q S,et al. Study on deproteinization and decoloration in fucoidan[J]. Advanced Materials Research,2011,354-355:62-66.

[15]Dubois M,Gilles K A,Hamilton J K,et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J]. Analytical Chemistry,1956,28(3):350-356.

[16]劉小華,張美霞,于春梅,等. 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定殼聚糖中蛋白的含量[J]. 中國交通醫(yī)學(xué)雜志,2006,20(2):159-160.

[17]Terho T T,Hartiala K. Method for determination of the sulfate content of glycosaminoglycans[J]. Analytical Biochemistry,1971,41(2):471-476.

[18]Dodgson K S,Price R G. A note on the determination of the ester sulphate content of sulphated polysaccharides[J]. Biochemical Journal,1962,84(1):106.

[19]Yang W,Pei F,Shi Y,et al. Purification,characterization and anti-proliferation activity of polysaccharides fromFlammulinavelutipes[J]. Carbohydrate Polymers,2012,88(2):474-480.

[20]Guo L,Zhu W,Xu F,et al. Optimized ultrasonic-assisted extraction of polysaccharides fromCyclinasinensisand evaluation of antioxidant activitiesinvitro[J]. CyTA-Journal of Food,2013,12(1):32-39.

[21]ZhangY,Wang H X,Wang P,et al. Optimization of PEG-based extraction of polysaccharides fromDendrobiumnobileLindl. and bioactivity study[J]. International Journal of Biological Macromolec,2016,92:1057-1066.

[22]Li W,Cui S W,Kakuda Y. Extraction,fractionation,structural and physical characterization of wheat glucans[J]. Carbohydrate polymers,2006,63(3):408-416

[23]李雪梅. 海灣扇貝多糖的提取純化及抗腫瘤活性研究[D]. 保定:河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.

[24]Qu Y,Li C,Zhang C,et al. Optimization of infrared-assisted extraction ofBletillastriata,polysaccharides based on response surface methodology and their antioxidant activities[J]. Carbohydrate Polymers,2016,148:345-353.

[25]蔣長(zhǎng)興. 青蛤多糖分離鑒定,硫酸酯化及其生物活性研究[D]. 南京:南京農(nóng)業(yè)學(xué),2011.

[26]董航. 幾種中藥多糖的組成及抗氧化活性研究[D]. 長(zhǎng)春:長(zhǎng)春師范學(xué)院,2012.

[27]李恒,李莉梅,何春梅,等. 野生仙人掌多糖提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究[J]. 食品工業(yè)科技,2015,36(4):210-214.

[28]祁小妮,林楠楠,李振亮,等. 生地黃多糖提取工藝的優(yōu)化及抗氧化活性研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2016,42(2):231-235.

[29]翟呂平,楊京梅. 魷魚軟骨粗多糖提取方法的研究[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2016,26(7):947-961.

[30]殷秀紅,趙峽,張紫恒,等. 紫貽貝多糖的提取、分離和基本理化性質(zhì)分析[J].中國海洋藥物雜志,2011,30(2):12-18.

[31]趙巧靈. 紫貽貝多糖提取分離、結(jié)構(gòu)鑒定及其生物活性的初步研究[D]. 杭州:浙江工商大學(xué),2010.

[32]馬明華,易楊華,湯海峰. 厚殼貽貝多糖MA的分離純化、理化性質(zhì)及活性研究(Ⅰ)[J]. 中國海洋藥物,2004,23(4):14-18.

[33]孫麗平,鮑長(zhǎng)俊,柳建華,等. 烏鱧分泌多糖和黏多糖的提取及其抗氧化活性研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2015,41(7):81-85.

[34]Jiang C X,Xiong Q P,Gan D,et al. Antioxidant activity and potential hepatoprotective effect of polysaccharides from Cyclina sinensis[J]. Carbohydrate Polymers,2013,91(1):262-268.