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(1.錦州醫(yī)科大學(xué),遼寧錦州 121000; 2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,遼寧錦州 121000)

堿蓬(Suaedasalsa)又名翅堿蓬,俗稱黃須菜,屬黎科,為一年生葉肉質(zhì)化真鹽生草本植物,具有極強(qiáng)的生命力,屬于一種典型的鹽生結(jié)構(gòu)[1]。鹽地堿蓬的藥用價(jià)值早在《本草綱目拾遺》中就有記載,“鹽蓬,味咸性寒,清熱消積”[2]。常食用堿蓬有助于人體酸堿平衡,近年來(lái)一些研究表明,堿蓬提取物具有降低膽固醇、降血脂、抗免疫[3-5]、抗衰老、抗腫瘤等功效,對(duì)于保健及功能藥物的開(kāi)發(fā)具有重要意義[6-7]。多糖是一種廣泛存在于動(dòng)植物、微生物中的大分子物質(zhì),它不僅在生物體的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用,而且具有多方面的生物活性和功能。隨著科學(xué)研究的發(fā)展,多糖生物功效多樣性的研究正日益成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[8-9]。

由于堿蓬多糖本身結(jié)構(gòu)復(fù)雜,利用傳統(tǒng)工藝提取的堿蓬多糖顏色深,純度低,不利于堿蓬多糖成分的進(jìn)一步分離和產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。為了能夠更好的對(duì)堿蓬多糖進(jìn)行深入研究,需要對(duì)其進(jìn)行脫色處理。活性炭吸附法、大孔樹(shù)脂法以及雙氧水法等方法是目前最常用的多糖脫色方法。通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),已有趙肖通[10]等人利用大孔樹(shù)脂法對(duì)姬松茸多糖進(jìn)行脫色,汪榮斌[11]等人利用雙氧水法對(duì)青錢(qián)柳葉多糖進(jìn)行脫色,但大孔樹(shù)脂法操作較復(fù)雜,且樹(shù)脂價(jià)格較貴,樣品處理量有限,不利于大規(guī)模應(yīng)用,雙氧水是強(qiáng)氧化劑,容易破壞堿蓬多糖的結(jié)構(gòu),影響其活性[12-14]。與前兩種方法相比,活性炭是最常用的吸附劑,研究發(fā)現(xiàn),活性炭可吸附水解液中相對(duì)分子質(zhì)量為500和1000以內(nèi)的色素物質(zhì),并且可以吸附溶液中的某些雜質(zhì),從而達(dá)到分離提純的目的[15]。目前,已有單曉菊[16]、吳光杰[12]等人利用活性炭分別對(duì)苦豆子多糖、馬齒莧多糖進(jìn)行脫色。而B(niǎo)ox-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)作為一種基于統(tǒng)計(jì)技術(shù)的優(yōu)化方法,具有預(yù)測(cè)性好,便于觀察,精密度高等優(yōu)點(diǎn)[10]。

目前,對(duì)堿蓬多糖的分離純化已見(jiàn)報(bào)道,但對(duì)堿蓬多糖脫色工藝的研究未見(jiàn)報(bào)道。因此本文通過(guò)利用活性炭對(duì)堿蓬多糖進(jìn)行脫色處理,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)堿蓬多糖脫色工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

堿蓬遼寧省錦州市沿海灘涂濕地,經(jīng)錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院主任藥師郭斌鑒定為堿蓬屬堿蓬草;活性炭天津市瑞金特化學(xué)品有限公司,批號(hào):20150823;葡萄糖中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):110732-201406;95%乙醇、苯酚和濃硫酸等試劑均為分析純。

UV-2550型紫外分光光度計(jì)日本島津;LD4-2A(Ⅱ)離心機(jī)北京京力公司;真空干燥箱上海一恒科技儀器有限公司;BP 211D型電子分析天平德國(guó)Sartorius公司;PHSJ-4A實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司;恒溫水浴鍋上海騰方儀器有限公司。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1堿蓬多糖的制備取堿蓬的干燥葉300 g粉碎后,過(guò)20目篩,得堿蓬粗粉。稱取堿蓬粗粉以80%乙醇回流脫脂2次,每次2 h。提取完畢,過(guò)濾,殘?jiān)糜诤嫦鋬?nèi)烘干。殘?jiān)?0倍量水于80 ℃水浴鍋中加熱回流提取2次,每次3 h[6]。浸提后抽濾,離心(3000 r/min,15 min),取上清液濃縮,按Sevag法脫蛋白后,加3倍量的90%乙醇過(guò)夜沉淀,離心(2500 r/min,10 min),冷凍干燥24 h,即得堿蓬粗多糖。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在105 ℃干燥至恒重,精密稱取20 mg,加水溶解,定容至100 mL容量瓶中,搖勻,配成濃度0.2 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確吸取上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL分別置于具塞試管中,加蒸餾水補(bǔ)至1 mL,再加入6%苯酚溶液0.5 mL,搖勻,然后沿壁加入濃H2SO42.5 mL,立即搖勻。將6只具塞試管室溫放置15 min后,在490 nm處測(cè)定各管吸光度,進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn),取平均值。以葡萄糖質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=1.250C+0.009,r=0.9991。

1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)取1.2.1項(xiàng)下堿蓬多糖溶液,脫色條件為:固定反應(yīng)條件為脫色溫度45 ℃、脫色時(shí)間30 min、pH2,考察不同活性炭用量(1%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、5%)對(duì)多糖脫色率的影響;固定反應(yīng)條件為活性炭用量2.5%、脫色時(shí)間30 min、pH2,考察不同脫色溫度(35、40、45、50、55、60 ℃)對(duì)多糖脫色率的影響;固定反應(yīng)條件為活性炭用量2.5%、脫色溫度45 ℃、pH2,考察不同脫色時(shí)間(20、25、30、35、40、45、50、55 min)對(duì)多糖脫色率的影響;固定反應(yīng)條件為活性炭用量2.5%、脫色溫度45 ℃、脫色時(shí)間30 min,考察不同pH(1、2、4、6、8、10)對(duì)多糖脫色率的影響。以上每組單因素實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)取平均值,以考察各因素變量對(duì)堿蓬多糖溶液脫色率的影響。

1.2.4Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用中心組合實(shí)驗(yàn)Box-Behnken設(shè)計(jì)方案,選取活性炭用量、脫色溫度、脫色時(shí)間、pH四個(gè)因素,以堿蓬多糖溶液脫色率為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn),各因素的三個(gè)水平采用-1、0、1進(jìn)行編碼,如表1。

表1　響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1　Factors and their levels used in the response surface design

1.2.5堿蓬多糖脫色率的測(cè)定準(zhǔn)確稱取1.2.1項(xiàng)下堿蓬多糖5 g,加水溶解并定容至500 mL,得堿蓬多糖溶液,于450 nm[17]處測(cè)定堿蓬多糖溶液脫色前后的吸光度。計(jì)算公式為:

脫色率(%)=(A脫色前-A脫色后)/A脫色前×100

1.2.6堿蓬多糖糖損率的測(cè)定利用苯酚-硫酸法[18]測(cè)定堿蓬多糖溶液脫色前后的多糖含量。計(jì)算公式為:

糖損率(%)=(C脫色前-C脫色后)/C脫色前×100

1.3　數(shù)據(jù)處理

2　結(jié)果與討論

2.1　單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1活性炭用量對(duì)脫色效果的影響由圖1可知,多糖的脫色率呈先增加后降低的趨勢(shì),當(dāng)活性炭加入量為3%時(shí),多糖的脫色率增加幅度較大,當(dāng)活性炭加入量超過(guò)3%時(shí),多糖脫色率明顯下降,糖損率隨著活性炭用量的增加隨之增大,原因可能是由于活性炭加入量過(guò)大,過(guò)量的活性炭可能會(huì)對(duì)多糖產(chǎn)生少量吸附作用,并且會(huì)使脫碳不完全,反而影響多糖的脫色率,綜上所述,實(shí)驗(yàn)選擇活性炭的添加量為3%。

圖1　活性炭用量對(duì)脫色效果的影響Fig.1　Influence of amount of activated carbon addition on decolorization effect

圖2　脫色溫度對(duì)脫色效果的影響Fig.2　Influence of decolorization temperature on decolorization effect

2.1.2脫色溫度對(duì)脫色效果的影響由圖2可知,在35～50 ℃范圍內(nèi),多糖的脫色率隨著溫度的升高上升較快,50 ℃時(shí)脫色效果最好,當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí),脫色率反而下降,糖損率隨著溫度的升高而升高。原因可能是由于溫度升高,多糖溶液的黏度降低,色素分子運(yùn)動(dòng)速度加快,進(jìn)而加速吸附作用,當(dāng)達(dá)到平衡點(diǎn)時(shí),溫度過(guò)高反而造成了色素的解析[19]。因此50 ℃是比較適宜的脫色溫度。

2.1.3脫色時(shí)間對(duì)脫色效果的影響由圖3可知,在20～40 min內(nèi),隨著時(shí)間的延長(zhǎng),多糖的脫色率上升較快,糖損率上升緩慢,當(dāng)脫色時(shí)間超過(guò)40 min時(shí),多糖的脫色率緩慢降低,糖損率增長(zhǎng)迅速,可能是由于活性炭吸附已經(jīng)達(dá)到一定程度,吸附與解吸附處于相對(duì)平衡,繼續(xù)延長(zhǎng)脫色時(shí)間,反而會(huì)引起部分被吸附色素的解析,綜合考慮,脫色時(shí)間應(yīng)為40 min。

圖3　脫色時(shí)間對(duì)脫色效果的影響Fig.3　Influence of decolorization time on decolorization effect

2.1.4pH對(duì)脫色效果的影響由圖4可知,隨著pH的增加,多糖的脫色率呈先增高后降低的趨勢(shì),在酸性范圍內(nèi)多糖的脫色率較高,說(shuō)明活性炭在偏酸性條件下脫色效果好,但繼續(xù)降低pH,后期所需要的堿液以指數(shù)倍數(shù)的增加,增加了成本,同時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的鹽,為后續(xù)脫鹽帶來(lái)不便[15],并且糖損率也隨著pH的增大而增大,因此,為獲得較好的脫色效果,選擇pH4為較適宜。

圖4　初始pH對(duì)脫色效果的影響Fig.4　Influence of decolorization pH on decolorization effect

2.2　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.1響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果由Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)分析軟件的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)功能可知,以堿蓬多糖脫色率為響應(yīng)值,以活性炭添加量(A)、脫色溫度(B)、脫色時(shí)間(C)、pH(D)為自變量,建立四因素三水平的中心組合設(shè)計(jì)包括29個(gè)實(shí)驗(yàn)方案,每個(gè)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)取平均值,具體的實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2　RSM design and corresponding experimental data

表3　回歸模型及方差分析Table 3　The variance analysis of regression equation

注：**p<0.01為極顯著;*p<0.05為顯著。

2.2.2模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)利用Design-Expert 8.0.6軟件,通過(guò)回歸分析對(duì)表2中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合,得到活性炭添加量(A)、脫色溫度(B)、脫色時(shí)間(C)、pH(D)四個(gè)因素對(duì)堿蓬多糖脫色率(Y)的二次回歸方程為:Y=64.30+0.68A+2.30B+0.99C+0.57D+1.27AD-1.04BC+1.13CD-1.90A2-1.79B2-1.03C2-1.44D2

圖5　活性炭用量與pH交互作用對(duì)脫色率的響應(yīng)面分析Fig.5　RSM analysis for interactive effects of amount of activated carbon addition and pH

2.2.3響應(yīng)面圖分析響應(yīng)面分析法是利用合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),通過(guò)對(duì)響應(yīng)面等高線的分析尋求最優(yōu)工藝參數(shù),并且可以通過(guò)對(duì)3D曲面圖的分析,直觀地評(píng)價(jià)各因素間的交互作用[20-21]。在響應(yīng)面圖中,曲面的傾斜度表明該實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度,傾斜度越高,即坡度越陡峭,表明該實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著。響應(yīng)面等高線圖可以直觀地反映出兩個(gè)因素間交互效應(yīng)的強(qiáng)弱,等高線的形狀越接近橢圓形,表示兩個(gè)因素交互效應(yīng)越強(qiáng),而圓形則反之[22]。如圖5～7所示,各圖響應(yīng)曲面坡度較陡峭,說(shuō)明AD、BC和CD之間交互作用較強(qiáng)。

圖6　脫色溫度與脫色時(shí)間交互作用對(duì)脫色率的響應(yīng)面分析Fig.6　RSM analysis for interactive effects of decolorization temperature and decolorization time

圖7　脫色時(shí)間與pH交互作用對(duì)脫色率的響應(yīng)面分析Fig.7　RSM analysis for interactive effects of decolorization time and pH

圖5表示固定脫色溫度和脫色時(shí)間為零水平,活性炭用量和pH對(duì)多糖脫色率的影響和兩者之間的交互作用?；钚蕴坑昧枯^低時(shí),脫色率隨pH增加呈先上升后下降的趨勢(shì),活性炭用量較高時(shí),脫色率隨溫度增加先上升后下降;固定pH不變時(shí),多糖脫色率隨活性炭用量增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。通過(guò)圖5可以看出,活性炭用量上升的幅度較pH稍陡峭,說(shuō)明活性炭用量對(duì)多糖脫色率的影響較pH稍大。

圖6表示固定活性炭用量和pH為零水平,脫色溫度和脫色時(shí)間對(duì)多糖脫色率的影響和兩者之間的交互作用。由該圖可知,脫色溫度和脫色時(shí)間對(duì)多糖脫色率的影響是明顯的,因?yàn)轫憫?yīng)曲面坡度陡峭,等高線圖接近圓形,同時(shí)也說(shuō)明它們的交互作用并不明顯。多糖脫色率隨脫色溫度和脫色時(shí)間的增加,先上升后緩慢下降,脫色溫度的上升幅度明顯比脫色時(shí)間的上升幅度陡峭,說(shuō)明脫色溫度對(duì)多糖脫色率的影響較大。

圖7表示固定活性炭用量和脫色溫度為零水平,脫色時(shí)間和pH對(duì)多糖脫色率的影響和兩者之間的交互作用。脫色時(shí)間和pH對(duì)脫色率的影響都是明顯的,因?yàn)榍姹容^陡峭,等高線圖是橢圓形,所以證明它們的交互作用也是明顯的。固定pH不變時(shí),多糖脫色率隨脫色時(shí)間的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。綜合圖7分析可知,脫色時(shí)間上升的幅度較pH稍陡峭,說(shuō)明脫色時(shí)間對(duì)多糖脫色率的影響較大。

2.2.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)以堿蓬多糖脫色率為最終考察指標(biāo),根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)所得回歸方程的最優(yōu)預(yù)測(cè)值求解,可得活性炭對(duì)堿蓬多糖脫色的最佳工藝條件為:活性炭用量3.25%,脫色溫度52.72 ℃,脫色時(shí)間43.18 min,pH5.39,活性炭脫色率的理論預(yù)測(cè)值為68.52%?？紤]實(shí)際條件,調(diào)整為活性炭用量3.3%,脫色溫度53 ℃,脫色時(shí)間43 min,pH5.4。在上述最優(yōu)條件下進(jìn)行重復(fù)3次平行實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所得平均脫色率為65.38%,RSD為1.74%。結(jié)果表明,經(jīng)過(guò)響應(yīng)回歸方程擬合出的理論值與實(shí)際值相吻合,證明本實(shí)驗(yàn)建立的二次多項(xiàng)回歸方程模型能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)各因素與效應(yīng)面之間的關(guān)系。

3　結(jié)論

多糖溶液中色素成分大部分為天然產(chǎn)物中已存在的物質(zhì),對(duì)多糖溶液進(jìn)行脫色有利于提高多糖的純度,優(yōu)良的脫色劑應(yīng)具有較理想的脫色效果、較低糖損率,同時(shí)又容易在多糖中清除,但是要保證脫色前后多糖的結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變。活性炭為黑色多孔顆粒,無(wú)臭、無(wú)味、無(wú)毒,具有孔隙結(jié)構(gòu)發(fā)達(dá)、比表面積大和吸附能力強(qiáng)的特點(diǎn),活性炭對(duì)水溶性色素具有穩(wěn)定可靠地脫色效果[12],因此常常被用來(lái)做吸附劑。

本實(shí)驗(yàn)利用活性炭對(duì)堿蓬多糖溶液進(jìn)行脫色處理,降低了色素含量,在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行分析,對(duì)堿蓬多糖的脫色工藝進(jìn)行優(yōu)化,建立了多糖脫色率的回歸模型,由該模型優(yōu)化的堿蓬多糖脫色的最佳工藝條件為:活性炭添加量3.3%,脫色溫度53 ℃,脫色時(shí)間43 min,pH5.4。此條件下,堿蓬多糖的平均脫色率為65.38%,與模型預(yù)測(cè)結(jié)果相近,表明該響應(yīng)面法優(yōu)化的工藝條件具有實(shí)用價(jià)值,有利于堿蓬多糖的進(jìn)一步研究和產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。

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