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        響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助酶解制備α-葡萄糖苷酶抑制活性肽工藝

        2018-04-13 01:01:40,,,,,,,,,,*
        食品工業(yè)科技 2018年4期
        關(guān)鍵詞:糖苷酶抑制率底物

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        (1.山東省花生研究所,山東青島 266100; 2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué),山東青島 266109)

        隨著人們生活水平的提高,糖尿病的發(fā)病率也在逐年上升,成為繼腫瘤、心血管疾病的第三大疾病[1]。其中,Ⅱ型糖尿病患者占所有糖尿病患者的90%以上。Ⅱ型糖尿病的發(fā)病原因是患者的胰島素分泌能力及身體對(duì)胰島素的敏感性逐漸降低,血糖升高,主要表現(xiàn)為餐后血糖高于正常值,從而導(dǎo)致糖尿病[2]。Ⅱ型糖尿病可以通過(guò)口服降糖藥如雙胍類、磺脲類、噻唑烷二酮類、苯甲酸衍生物類、α-葡萄糖苷酶抑制劑(阿卡波糖和伏格列波糖)來(lái)治療。其中,α-葡萄糖苷酶抑制劑是通過(guò)抑制α-葡萄糖苷酶的活性,減少碳水化合物水解成葡萄糖的量,從而減小小腸黏膜上皮吸收葡萄糖的速度,達(dá)到降低餐后高血糖的目的[3]。

        蛋白酶水解動(dòng)植物蛋白,將具有降血糖活性的肽段釋放出來(lái),能得到α-葡萄糖苷酶抑制肽,其天然、安全、無(wú)副作用,能替代阿卡波糖等人工合成的α-葡萄糖苷酶抑制劑用于Ⅱ型糖尿病的治療。包美麗等[4]以馬鹿茸為原料,用堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶順序水解,條件分別是:pH8.0、60 ℃、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%、加酶量5000 U/g、時(shí)間3 h和pH6.5、45 ℃、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、加酶量6000 U/g、時(shí)間1 h,得到的酶解產(chǎn)物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率達(dá)到94.09%。王林等[5]用胃蛋白酶水解魷魚(yú)肝臟蛋白,在底物濃度0.4%,酶與底物的質(zhì)量比3.0%,pH3.0,溫度37 ℃,反應(yīng)時(shí)間12 h條件下的酶解產(chǎn)物再經(jīng)Sephadex LH-20凝膠層析,獲得的組分Ⅲ對(duì)α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度IC50值為0.215 mg/mL。張燦等[6]在pH7.36、時(shí)間4.4 h、酶底比5%、溫度57.9 ℃條件下,用木瓜蛋白酶水解銀杏蛋白,獲得的3 kDa以下的肽對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率為50.43%。顧欣等[7]用Alcalase水解山杏仁蛋白,采用工藝料液比50 g/L、加酶量0.75%、pH9.0、溫度50 ℃、時(shí)間6 h獲得的酶解物經(jīng)分離和純化得到兩種α-葡萄糖苷酶抑制肽,它們對(duì)α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度IC50值分別為23.97和22.93 μmol/L。

        花生含有25%~36%的蛋白,而冷榨花生粕的蛋白含量超過(guò)45%,是一種優(yōu)質(zhì)的植物源蛋白[8]。花生蛋白含有人體必需的八種氨基酸,且不含抗?fàn)I養(yǎng)因子,可以制備成如磷酸化改性花生蛋白等高營(yíng)養(yǎng)、高功能性的蛋白產(chǎn)品[9]。此外,花生多肽具有抗氧化活性、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性、抗血栓活性等[10-12]。目前花生α-葡萄糖苷酶抑制活性肽的研究還沒(méi)有報(bào)道。微波輔助酶解是近年發(fā)展起來(lái)的一種新技術(shù),在微波能的作用下,蛋白大分子空間構(gòu)象發(fā)生變化,更多的酶切位點(diǎn)暴露出來(lái),增大了酶與底物的結(jié)合幾率,加快酶解速率,提高酶解效率,酶解反應(yīng)在很短的時(shí)間內(nèi)完成,有利于保持酶解產(chǎn)物活性,降低制備成本[13-15]。本研究利用微波輔助Alcalase酶解花生蛋白,以α-葡萄糖苷酶抑制率為考察指標(biāo),通過(guò)響應(yīng)面方法優(yōu)化了花生α-葡萄糖苷酶抑制活性肽的制備工藝,旨在為花生α-葡萄糖苷酶抑制活性肽的分離、純化、構(gòu)效關(guān)系、降血糖的應(yīng)用等方面的深入研究提供理論基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        冷榨花生蛋白粉青島長(zhǎng)壽食品有限公司;氫氧化鈉、NaH2PO4、Na2HPO4、Na2CO3均為分析純?cè)噭?上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;對(duì)硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)(純度≥99%)、α-葡萄糖苷酶(酶活750 UN)美國(guó)Sigma公司;Alcalase(2.4 L FG,標(biāo)稱酶活2.4 AU-A/g)諾維信(中國(guó))生物醫(yī)藥有限公司。

        FR223 CN型電子分析天平奧豪斯儀器(上海)有限公司;L 420型低速離心機(jī)湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;XH-100 A型電腦微波催化合成/萃取儀北京祥鵠科技發(fā)展有限公司;FE 20型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)梅特勒-托利多儀器有限公司;UV-4802型雙光束掃描型紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)尤尼柯上海儀器有限公司。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1微波輔助蛋白酶解制備花生α-葡萄糖苷酶抑制活性肽工藝取花生蛋白粉于三口燒瓶中,加入蒸餾水,輕輕搖動(dòng)使花生蛋白粉與水混勻,用1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH,再加入Alcalase酶,再加入蒸餾水至一定體積,在微波催化合成/萃取儀中,調(diào)節(jié)反應(yīng)液溫度、微波功率,微波輔助酶解一定時(shí)間,酶解結(jié)束后,將反應(yīng)液倒入塑料離心瓶中,蓋上蓋子,在沸水浴中滅酶5 min,立刻在冷水浴中冷卻,調(diào)平衡后,在4000 r/min離心10 min,上清液倒入100 mL容量瓶,用蒸餾水定容,最后將容量瓶?jī)?nèi)液體倒入100 mL三角瓶,測(cè)定α-葡萄糖苷酶抑制率。

        1.2.2單因素實(shí)驗(yàn)以α-葡萄糖苷酶抑制率為指標(biāo),研究底物濃度、pH、加酶量、溫度、時(shí)間、微波功率對(duì)微波輔助蛋白酶解制備的花生α-葡萄糖苷酶抑制活性肽的葡萄糖苷酶抑制率的影響。

        1.2.2.1底物濃度對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響采用微波輔助蛋白酶解制備花生α-葡萄糖苷酶抑制活性肽,在pH為9.5,加酶量為1.4%,溫度55 ℃,時(shí)間8 min,微波功率1000 W的條件下,研究底物濃度分別為2%、4%、6%、8%、10%、12%時(shí),花生α-葡萄糖苷酶抑制活性肽的α-葡萄糖苷酶抑制率。

        1.2.2.2pH對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響采用微波輔助蛋白酶解制備花生α-葡萄糖苷酶抑制活性肽,在底物濃度為10%,加酶量為1.4%,溫度55 ℃,時(shí)間8 min,微波功率1000 W的條件下,研究pH分別為7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0時(shí),花生α-葡萄糖苷酶抑制活性肽的α-葡萄糖苷酶抑制率。

        1.2.2.3加酶量對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響采用微波輔助蛋白酶解制備花生α-葡萄糖苷酶抑制活性肽,在底物濃度為10%,pH為9.5,溫度55 ℃,時(shí)間8 min,微波功率1000 W的條件下,研究加酶量分別為0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%時(shí),花生α-葡萄糖苷酶抑制活性肽的α-葡萄糖苷酶抑制率。

        1.2.2.4溫度對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響采用微波輔助蛋白酶解制備花生α-葡萄糖苷酶抑制活性肽,在底物濃度為10%,pH為9.5,加酶量為1.4%,時(shí)間8 min,微波功率1000 W的條件下,研究溫度分別為40、45、50、55、60、65 ℃時(shí),花生α-葡萄糖苷酶抑制活性肽的α-葡萄糖苷酶抑制率。

        1.2.2.5時(shí)間對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響采用微波輔助蛋白酶解制備花生α-葡萄糖苷酶抑制活性肽,在底物濃度為10%,pH為9.5,加酶量為1.4%,溫度55 ℃,微波功率1000 W的條件下,研究時(shí)間分別為2、4、6、8、10、12 min時(shí),花生α-葡萄糖苷酶抑制活性肽的α-葡萄糖苷酶抑制率。

        1.2.2.6微波功率對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響采用微波輔助蛋白酶解制備花生α-葡萄糖苷酶抑制活性肽,在底物濃度為10%,pH為9.5,加酶量為1.4%,溫度55 ℃,時(shí)間8 min的條件下,研究微波功率分別為500、600、700、800、900、1000 W時(shí),花生α-葡萄糖苷酶抑制活性肽的α-葡萄糖苷酶抑制率。

        1.2.3響應(yīng)面(Response surface methodology,RSM)實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,以α-葡萄糖苷酶抑制率為考察指標(biāo),固定:pH9.0、微波功率1000 W,選取底物濃度(X1)、加酶量(X2)、溫度(X3)和時(shí)間(X4)4個(gè)因素為考察因素,每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平,進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

        表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

        1.2.4葡萄糖苷酶抑制率測(cè)定方法按照張玉等[16]的方法進(jìn)行測(cè)定,稍作改動(dòng)。將0.5 mL的0.1 mol/L(pH6.8)磷酸鹽緩沖溶液、0.5 mL樣品溶液和0.5 mL的3 mmol/L的PNPG溶液放入10 mL的帶刻度的塑料離心管內(nèi),在37 ℃水浴中恒溫水浴10 min;向離心管內(nèi)加入0.5 mL的0.1 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液,37 ℃水浴中恒溫水浴40 min;向離心管內(nèi)加入1.5 mL的0.2 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)。在波長(zhǎng)為405 nm處,以蒸餾水調(diào)節(jié)“0”點(diǎn),測(cè)定吸光值,得到樣品吸光值A(chǔ)樣品;同時(shí)做樣品空白,空白以緩沖液代替α-葡萄糖苷酶溶液,得到樣品吸光值A(chǔ)樣品空白。反應(yīng)體系中用0.5 mL蒸餾水代替0.5 mL樣品液作為對(duì)照實(shí)驗(yàn),其他操作步驟與樣品相同,405 nm處測(cè)定吸光值,得到對(duì)照吸光值A(chǔ)對(duì)照。抑制率計(jì)算公式:

        1.3 數(shù)據(jù)分析

        各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值作為結(jié)果。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析采用Design-expert軟件(Static Made Easy,Minneapolis,MN,USA. Version 8.0,2011)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

        2.1.1底物濃度對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響如圖1所示,隨著底物濃度的增大,抑制率呈現(xiàn)先減小后增大再緩慢減小的趨勢(shì),底物濃度為10%時(shí)的抑制率極顯著的大于其它濃度的抑制率(p<0.01)。在酶解反應(yīng)體系中,一定量的蛋白酶將一定數(shù)量的底物水解成活性產(chǎn)物,此時(shí)的酶解反應(yīng)剛好處于平衡狀態(tài),這時(shí)得到的產(chǎn)物抑制率最大[17]。當(dāng)?shù)孜餄舛仍?%~6%范圍內(nèi)時(shí),底物濃度相對(duì)于蛋白酶的量要少,所以,反應(yīng)體系中多余的蛋白酶有可能水解了有活性的酶解產(chǎn)物變成了無(wú)活性的更小的肽,導(dǎo)致抑制率減小。當(dāng)?shù)孜餄舛仍?%~10%范圍時(shí),酶解產(chǎn)生的活性產(chǎn)物逐漸增多,直到最大值,抑制率也逐漸增大到最大值。綜合考察底物濃度對(duì)抑制率的影響曲線,選擇8%~12%作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中底物濃度因素的水平范圍。

        圖1 底物濃度對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.1 Effect of substrate concentration on the α-glucosidase inhibitory rate注:不同字母代表具有顯著性差異p<0.01;圖2~圖6同。

        2.1.2pH對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響在不同的pH條件下,酶解反應(yīng)速率受到Alcalase的活性、蛋白大分子空間構(gòu)象變化以及酶與底物的相互作用的影響。由圖2可以看出,在pH7.5~9.0范圍內(nèi),抑制率緩慢增大,pH為9.0時(shí)出現(xiàn)最大值(p<0.01),當(dāng)pH大于9.0時(shí),抑制率減小。這主要是因?yàn)閜H由7.5增大到9.0時(shí),Alcalase酶活逐漸增大,花生蛋白的溶解度逐漸增大,蛋白分子結(jié)構(gòu)變得疏松,分子表面酶活位點(diǎn)增多,酶與底物結(jié)合幾率增大,生成的活性產(chǎn)物增多,抑制率增大[18]。pH繼續(xù)增大時(shí),Alcalase酶活降低,蛋白分子有可能變性,酶活位點(diǎn)減少,酶解速率降低,導(dǎo)致抑制率減小。因此,選擇pH9.0作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的pH固定水平。

        圖2 pH對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.2 Effect of pH value on the α-glucosidase inhibitory rate

        2.1.3加酶量對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響如圖3所示,隨著加酶量的增加,抑制率先增大后減小,加酶量為1.2%時(shí)的抑制率極顯著的大于其它加酶量(p<0.01)。酶解反應(yīng)體系中,底物濃度一定時(shí),增大蛋白酶的量有利于酶解反應(yīng)進(jìn)行,酶解得到的活性產(chǎn)物增多,則抑制率增大。當(dāng)加酶量超過(guò)一定數(shù)值時(shí),一定量的底物不能滿足逐漸增多的蛋白酶,有可能蛋白酶水解了體系中已有的活性產(chǎn)物,使其活性減小或失去活性,從而抑制率減小[19]。加酶量為0.6%時(shí)的抑制率極顯著大于加酶量為0.8%、1.4%和1.6%時(shí)的抑制率值(p<0.01),響應(yīng)面試驗(yàn)中的加酶量取值范圍定在0.6%~1.2%,將有利于加酶量因素的優(yōu)化。因此,選擇加酶量0.6%~1.2%為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中的加酶量因素水平范圍。

        圖3 加酶量對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on the α-glucosidase inhibitory rate

        2.1.4溫度對(duì)葡萄糖苷酶抑制率的影響在一定的溫度范圍條件下,蛋白酶才具有水解活性。如圖4所示,隨著反應(yīng)溫度的升高,抑制率先增大后減小,當(dāng)溫度為55 ℃時(shí),酶解產(chǎn)物的抑制率最大值(p<0.01)。反應(yīng)溫度升高,能夠增加反應(yīng)體系中底物蛋白大分子和蛋白酶相結(jié)合的幾率,使得酶解反應(yīng)速率增大,獲得更多的活性產(chǎn)物,抑制率隨之增大,直到達(dá)到一個(gè)峰值[20]。當(dāng)溫度高于55 ℃時(shí),花生蛋白開(kāi)始變性,分子空間構(gòu)象發(fā)生變化,不利于與蛋白酶的水解位點(diǎn)結(jié)合,則酶解的活性產(chǎn)物量逐漸減少,表現(xiàn)為抑制率減小[21]。溫度為65 ℃時(shí)的抑制率極顯著地大于溫度為40、45和50 ℃時(shí)的抑制率值,且較高的溫度能加速反應(yīng)進(jìn)程。因此,綜合考察溫度對(duì)抑制率的影響曲線,選擇55~65 ℃作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)溫度因素的水平范圍。

        圖4 溫度對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.4 Effect of temperature on the α-glucosidase inhibitory rate

        2.1.5時(shí)間對(duì)葡萄糖苷酶抑制率的影響隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),抑制率總體呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì),時(shí)間10 min出現(xiàn)最大值(p<0.01)(圖5)。酶解反應(yīng)體系中,底物與蛋白酶的結(jié)合以及蛋白酶酶切肽鍵都需要一定的反應(yīng)時(shí)間才能完成。在傳統(tǒng)的水浴加熱酶解反應(yīng)體系中,由外到里加熱,熱傳導(dǎo)慢,導(dǎo)致酶解反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng),一般都在3~12 h,酶解效率低[4-7]。微波輔助酶解時(shí),微波照射反應(yīng)體系,使電能轉(zhuǎn)換為高頻振動(dòng)能,從而使體系中的酶、蛋白大分子和介質(zhì)溶液的溫度均勻快速升高,提高了有效碰撞和反應(yīng)效率,反應(yīng)在幾分鐘內(nèi)即可完成,大幅減少了反應(yīng)時(shí)間[22]。時(shí)間為6 min時(shí)的抑制率極顯著地大于時(shí)間為2、4和8 min的抑制率,響應(yīng)面試驗(yàn)中時(shí)間因素的3個(gè)水平定在6、9和12 min,更有利于時(shí)間因素的優(yōu)化。因此,綜合分析時(shí)間對(duì)抑制率的影響曲線,選擇6~12 min作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)時(shí)間因素的水平范圍。

        圖5 時(shí)間對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.5 Effect of time on the α-glucosidase inhibitory rate

        2.1.6微波功率對(duì)葡萄糖苷酶抑制率的影響在微波功率500~1000 W范圍內(nèi),抑制率總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì),微波功率1000 W的抑制率極顯著的大于其它功率的抑制率數(shù)值(p<0.01)(圖6)。在微波輔助酶解過(guò)程中,高頻電磁波穿透介質(zhì)溶液,到達(dá)蛋白大分子的內(nèi)部,微波能迅速轉(zhuǎn)化為熱能,使蛋白分子空間構(gòu)象發(fā)生變化,酶解位點(diǎn)暴露于分子表面。另外,在微波的交變電磁場(chǎng)作用下,引起蛋白大分子強(qiáng)烈的極性振蕩,導(dǎo)致分子間氫鍵松弛,這也有利于酶與蛋白分子相結(jié)合,加速酶解反應(yīng)[23]。根據(jù)微波功率對(duì)葡萄糖苷酶抑制率的影響曲線,選擇1000 W作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)微波功率因素的固定值。

        圖6 微波功率對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.6 Effect of microwave power on the α-glucosidase inhibitory rate

        2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果分析

        2.2.1Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,pH和微波功率對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率影響不顯著,所以選定響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素為底物濃度(X1)、加酶量(X2)、溫度(X3)和時(shí)間(X4),α-葡萄糖苷酶抑制率為響應(yīng)值(Y),采用Design-expert軟件按照Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了29組實(shí)驗(yàn),24組為析因點(diǎn)實(shí)驗(yàn),5組為重復(fù)零點(diǎn)實(shí)驗(yàn),各實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3次,取平均值作為結(jié)果見(jiàn)表2。

        2.2.2擬合模型的建立及顯著性分析對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合,統(tǒng)計(jì)分析后獲得了α-葡萄糖苷酶抑制率預(yù)測(cè)值(Y)為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程:

        Y=84.44+0.28X1+0.44X2-0.4X3+1.79X4-2.57X1X2-0.35X1X3-3.79X1X4-2.92X2X3-2.02X2X4-4.53X3X4-5.01X12-4.14X22-3.57X32-5.14X42

        表2 響應(yīng)面Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of the response surface methodology(RSM)and Box-Behnken

        表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

        注:p≤0.05,影響顯著;p≤0.01,影響高度顯著;p≤0.001,影響極顯著;p>0.05,影響不顯著。

        圖7 各因素對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率影響的趨勢(shì)圖Fig.7 Effects of various factors on the α-glucosidase inhibitory rate

        2.2.3兩因素間的交互效應(yīng)分析圖7的響應(yīng)曲面圖和等高線圖可以反映出模型中任何兩個(gè)因素交互作用對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響程度,等高線的形狀越接近于橢圓形,則兩個(gè)因素交互作用越顯著;反之,等高線的形狀越接近于圓形,則兩個(gè)因素交互作用越不顯著;此外,橢圓形排列得越緊密,則兩個(gè)因素交互作用越顯著。由圖7可知,底物濃度(X1)和加酶量(X2)、加酶量(X2)和溫度(X3)的交互作用對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響顯著,底物濃度(X1)和時(shí)間(X4)的交互作用對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響高度顯著,溫度(X3)和時(shí)間(X4)的交互作用對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響極顯著。圖7的6個(gè)響應(yīng)面均為凸型曲面,說(shuō)明α-葡萄糖苷酶抑制率存在極高值,且極值出現(xiàn)在橢圓形的圓心處。

        2.2.4制備工藝條件優(yōu)化回歸模型預(yù)測(cè)的微波輔助蛋白酶制備花生α-葡萄糖苷酶抑制活性肽的最佳工藝條件為:底物濃度9.77%、加酶量0.94%、溫度58.47 ℃、時(shí)間9.99 min,在此條件下α-葡萄糖苷酶抑制率模型預(yù)測(cè)值為84.80%。為檢驗(yàn)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性,并綜合考慮實(shí)際操作的便利性,將工藝參數(shù)修正為:底物濃度9.77%、加酶量0.94%、溫度59 ℃、時(shí)間10 min,進(jìn)行微波輔助蛋白酶解制備花生α-葡萄糖苷酶抑制活性肽的實(shí)驗(yàn)。3次平行實(shí)驗(yàn)得到的平均α-葡萄糖苷酶抑制率為90.21%±0.93%,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)值與模型預(yù)測(cè)值的差值為6.38%,說(shuō)明模型與實(shí)際情況擬合較好,驗(yàn)證了所預(yù)測(cè)模型的正確性。因此,響應(yīng)面法對(duì)微波輔助蛋白酶解制備花生α-葡萄糖苷酶抑制活性肽工藝條件的參數(shù)優(yōu)化是可行的,得到的工藝條件具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

        3 結(jié)論

        以微波能替代傳統(tǒng)的水浴加熱,通過(guò)響應(yīng)面的Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了微波輔助Alcalase酶解制備花生α-葡萄糖苷酶抑制活性肽的工藝條件。獲得的最佳工藝為:底物濃度9.77%、pH9.0、加酶量0.94%、溫度59 ℃、時(shí)間10 min、微波功率1000 W,該最佳工藝條件下制備的水解產(chǎn)物對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率為90.21%±0.93%。該工藝技術(shù)極大地縮短了酶解反應(yīng)時(shí)間,將酶解時(shí)間由傳統(tǒng)的3 h以上縮短為10 min,提高了酶解效率,酶解產(chǎn)物活性高?;ㄉ?葡萄糖苷酶抑制活性肽的研究和開(kāi)發(fā)為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用花生蛋白這一優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源提供了一條新途徑;并對(duì)花生α-葡萄糖苷酶抑制活性肽的分離、純化、結(jié)構(gòu)鑒定、構(gòu)效關(guān)系的研究提供了理論基礎(chǔ)。

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