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(華北理工大學(xué)藥學(xué)院,河北唐山 063210)

人工合成色素雖然著色好且成本低,但有潛在毒副作用[1],而天然色素更安全健康,集著色、營養(yǎng)、保健等多種功能于一體?；ㄉ諡槎喾恿u基結(jié)構(gòu)[2],對(duì)生物體脂質(zhì)過氧化有顯著抑制作用,具有抗衰老、防治心血管疾病、抗菌消炎、抗腫瘤等作用[3-6],當(dāng)前主要用于飲料、乳制品、烘焙食品及保健品中[7],是潛在價(jià)值巨大的多功能性天然色素,但在食品熱加工處理過程中易受溫度、pH、黃酮及抗壞血酸等多種因素影響[8-11],極不穩(wěn)定,較易在存儲(chǔ)過程中發(fā)生降解,影響產(chǎn)品觀感及功用。

紫甘藍(lán)花色苷是從十字花科蕓薹屬紫色結(jié)球甘藍(lán)的外葉和葉球中提取分離得到的天然色素,廣泛應(yīng)用于食品著色[12],此外還具有測(cè)定土壤中鐵和鋁含量[13]、開發(fā)染料敏化太陽能電池[14]等工業(yè)用途。紫甘藍(lán)在我國種植廣泛,具有產(chǎn)量高、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn),黨婭等[15]以響應(yīng)面法優(yōu)化后紫甘藍(lán)花色苷提取量可達(dá)109.873 mg/g,提取成本相對(duì)較低,利于工業(yè)化生產(chǎn)。紫甘藍(lán)花色苷呈紫色,色澤鮮艷,但相關(guān)研究表明[16],紫甘藍(lán)花色苷含量隨溫度升高和時(shí)間延長(zhǎng)而降低,且伴隨顏色的變化,影響品質(zhì),因而掌握其熱降解動(dòng)力學(xué)規(guī)律,對(duì)紫甘藍(lán)花色苷的應(yīng)用極為重要。本文就此深入探討溫度和pH對(duì)紫甘藍(lán)花色苷的熱穩(wěn)定性和褐變反應(yīng)的影響,進(jìn)而建立紫甘藍(lán)花色苷熱降解動(dòng)力學(xué)模型,為推廣應(yīng)用提供理論支持。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

紫甘藍(lán)(BrassicaoleraceaL. var. capitata f. rubra)品種為早紅,產(chǎn)地為河北邯鄲,于2016年7月購自唐山市華盛超市;D-101大孔吸附樹脂西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司;無水乙醇分析純,天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠;鹽酸、氫氧化鈉、氯化鉀、檸檬酸、檸檬酸鈉、醋酸、醋酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉均為分析純,天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠。

Lambda 35型紫外可見分光光度計(jì)美國PerkinElmer公司;RV 8型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀德國IKA公司;CCA-20型低溫冷卻水循環(huán)泵鞏義予華儀器有限公司;ICC control eco 18型恒溫器德國IKA公司;ZD-85型氣浴恒溫振蕩器常州榮華儀器制造有限公司;S220型多參數(shù)測(cè)量?jī)xpH計(jì)梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司;AS10200T型超聲波清洗機(jī)天津奧特賽恩斯儀器有限公司;BT 125D型分析天平德國Sartorius公司。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1大孔吸附樹脂預(yù)處理參照文獻(xiàn)[17]方法,取適量D-101大孔吸附樹脂置于錐形瓶中,室溫下用無水乙醇浸泡24 h,然后用去離子水反復(fù)沖洗至無乙醇味。以1 mol/L鹽酸溶液浸泡上述樹脂8 h,去離子水反復(fù)沖洗至中性,最后用1 mol/L NaOH溶液浸泡樹脂8 h,去離子水反復(fù)沖洗至中性,抽濾后備用。

1.2.2紫甘藍(lán)花色苷提取與純化參照王忠博等[18]方法略加改動(dòng)。取新鮮紫甘藍(lán),切碎,以料液比為1∶10 (g∶mL)加入80%乙醇溶液,40 kHz超聲浸提1 h后過濾,取濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中,30 ℃水浴減壓蒸餾得濃縮液。稱取1 g預(yù)處理過的D-101大孔吸附樹脂于錐形瓶中,加入40 mL上述濃縮液后置于氣浴恒溫振蕩器中,在25 ℃下以120 r/min振蕩1 h吸附。之后將樹脂抽濾,用去離子水反復(fù)沖洗樹脂至濾液無色,再將樹脂置于80%乙醇溶液中,于氣浴恒溫振蕩器中,在30 ℃以120 r/min解吸1 h,抽濾并收集解吸液,濃縮后備用。

1.2.3紫甘藍(lán)花色苷最大吸收波長(zhǎng)掃描在400～700 nm范圍內(nèi),將pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的紫甘藍(lán)花色苷樣品液,于紫外可見分光光度計(jì)中進(jìn)行光譜掃描并記錄數(shù)據(jù),繪制曲線,確定最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.4紫甘藍(lán)花色苷熱穩(wěn)定性研究取4份濃度為299.55 mg/L的花色苷溶液各25 mL置于旋蓋試管中,分別在50、60、70、80 ℃下恒溫水浴8 h,每隔1 h取樣1 mL測(cè)定其花色苷含量,研究溫度變化對(duì)花色苷熱穩(wěn)定性的影響。

配制pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的緩沖液各200 mL,于上述不同pH的緩沖溶液中各加入10 mL花色苷溶液,各取50 mL上述pH2.0的花色苷緩沖液于4個(gè)旋蓋試管中,分別在50、60、70、80 ℃條件下恒溫水浴8 h,每隔1 h取樣2.5 mL測(cè)定其在420、700 nm及最大吸收波長(zhǎng)下的吸光度,其余pH體系同此法操作,研究pH變化對(duì)花色苷熱穩(wěn)定性及褐變指數(shù)的影響。

1.2.5花色苷含量測(cè)定在最大吸收波長(zhǎng)及700 nm下,測(cè)其在pH1.0的KCl-HCl緩沖液和pH4.5的醋酸鈉-醋酸緩沖液中吸光度值,以pH示差法[19]測(cè)其含量,計(jì)算公式如下。

A=(Amax-A700)pH1.0-(Amax-A700)pH4.5

式中:C為待測(cè)紫甘藍(lán)溶液中花色苷含量,mg/L;Mw為主要花色苷成分矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量,Mw=449.2 g/mol;DF為稀釋因子,此處為40;ε為花色苷的摩爾吸收系數(shù),ε=26900 L/(mol·cm);L為1 cm的比色皿。

1.2.6降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定在最大吸收波長(zhǎng)及420、700 nm下測(cè)定其吸光度值,以阿侖尼烏斯方程進(jìn)行擬合[20]。以ln(Ct/C0)為縱坐標(biāo),時(shí)間t為橫坐標(biāo)作圖,圖線經(jīng)過原點(diǎn),則斜率為-K,由K可得半衰期t1/2。將323、333、343、353 K時(shí)模型的熱降解反應(yīng)常數(shù)K值取對(duì)數(shù),以lnK對(duì)1/T作圖,則斜率為Ea/R,縱截距為lnK0,相關(guān)公式如下:

t1/2=-ln0.5×K-1

式中:C為花色苷終濃度,mg/L;C0為花色苷初始濃度,mg/L;K為熱降解反應(yīng)常數(shù),h-1;K0為方程常數(shù),h-1;Ea為活化能,kJ/mol;T為反應(yīng)溫度,K;R為氣體常數(shù)8.314 J/(mol·K)。

1.2.7褐變指數(shù)測(cè)定不同溫度及pH下紫甘藍(lán)花色苷的褐變指數(shù)[21]計(jì)算方式如下:

式中:BI為褐變指數(shù),A420、A700為420、700 nm下的吸光度值,Amax為不同pH溶液中最大吸收波長(zhǎng)下的吸光度值。

1.3　數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件Origin 8.6分析并進(jìn)行線性回歸分析,計(jì)算相關(guān)系數(shù)R2,R2越接近1,表明線性關(guān)系越好。

2　結(jié)果與討論

2.1　花色苷在不同pH緩沖溶液中的最大吸收波長(zhǎng)

在可見光400～700 nm范圍內(nèi),對(duì)不同pH的紫甘藍(lán)花色苷樣品液進(jìn)行光譜掃描,如圖1所示,隨著pH的增大,紫甘藍(lán)花色苷吸收峰迅速降低。在pH2.0～6.0范圍內(nèi),花色苷最大吸收波長(zhǎng)依次為527、533、537、546、552 nm,顏色由紫紅色變成淺紅色,說明花色苷在溶劑的親核攻擊下由紅色的2-苯基苯并吡喃陽離子結(jié)構(gòu)變?yōu)闊o色的半縮醛結(jié)構(gòu)[22],使得最大吸收波長(zhǎng)隨之發(fā)生紅移。因此,在各pH的最大吸收波長(zhǎng)下研究紫甘藍(lán)花色苷的熱降解動(dòng)力學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn),測(cè)定并計(jì)算花色苷的熱降解參數(shù)及褐變指數(shù)。

圖1　不同pH下紫甘藍(lán)花色苷吸收波長(zhǎng)掃描曲線Fig.1　Visible absorption wavelength of anthocyanins from red cabbage at different pH

2.2　紫甘藍(lán)花色苷的熱穩(wěn)定性及降解動(dòng)力學(xué)

2.2.1熱處理溫度對(duì)紫甘藍(lán)花色苷含量的影響溫度對(duì)紫甘藍(lán)花色苷穩(wěn)定性的影響如圖2所示。紫甘藍(lán)花色苷含量隨著時(shí)間延長(zhǎng)呈明顯下降趨勢(shì),在熱處理8 h后,50～80 ℃下的花色苷殘留率依次為81.92%、52.43%、33.52%、16.15%,表明溫度對(duì)紫甘藍(lán)花色苷的穩(wěn)定性有極大影響,這一結(jié)果與在紅肉桃[23]、黑米糠[24]、瑪瑙櫻桃[25]、藍(lán)莓[26]中花色苷的熱穩(wěn)定性研究相一致,即升溫會(huì)使花色苷降解量增大?；ㄉ盏臒岱€(wěn)定性與糖基結(jié)構(gòu)密切相關(guān),其糖基化程度越大穩(wěn)定性越高,高溫下花色苷結(jié)構(gòu)C3位上的糖基丟失導(dǎo)致其對(duì)熱不穩(wěn)定[27]。

圖2　不同溫度下花色苷含量隨時(shí)間的變化Fig.2　Changes of anthocyanins contents with time at different temperatures

2.2.2紫甘藍(lán)花色苷的降解動(dòng)力學(xué)在50、60、70、80 ℃溫度下測(cè)得的紫甘藍(lán)花色苷含量,經(jīng)阿侖尼烏斯公式計(jì)算擬合得圖3,各溫度下回歸曲線所得相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99,表明其線性良好,符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。此外,由曲線方程可得紫甘藍(lán)花色苷的熱降解反應(yīng)常數(shù)K,據(jù)此求得熱降解參數(shù)如表1所示。隨溫度升高,熱降解反應(yīng)常數(shù)K隨之增大,而半衰期t1/2隨之減小,即花色苷熱降解隨溫度升高而加快。

圖3　不同溫度下ln(C/C0)隨時(shí)間的變化Fig.3　Change of ln(C/C0)with time at different temperatures

表1　不同溫度下紫甘藍(lán)花色苷的熱降解參數(shù)Table 1　The thermal degradation kinetic parameters of anthocyanins from red cabbage at different temperatures

2.3　不同pH和溫度下紫甘藍(lán)花色苷的熱降解動(dòng)力學(xué)研究

研究在50～80 ℃范圍內(nèi),不同pH緩沖溶液中紫甘藍(lán)花色苷熱降解的動(dòng)力學(xué)過程,經(jīng)擬合得到不同pH與溫度下紫甘藍(lán)花色苷的熱降解變化圖(圖4),后分析得到降解參數(shù)見表2。不同pH、不同熱處理溫度條件下,紫甘藍(lán)花色苷的ln(C/C0)與時(shí)間作圖,線性關(guān)系良好(R2>0.99),符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)。

表2　不同pH下的紫甘藍(lán)花色苷熱降解參數(shù)Table 2　The thermal degradation kinetic parameters of anthocyanins from red cabbage at different pH

圖4　不同pH與溫度下紫甘藍(lán)花色苷的熱降解Fig.4　Thermal degradation of anthocyanins from red cabbage at different pH and temperatures

在不同pH體系下,紫甘藍(lán)花色苷的熱降解速率均隨溫度升高而加快,其熱降解反應(yīng)常數(shù)K隨之增大,半衰期t1/2隨之減小。當(dāng)溫度為50 ℃時(shí),各pH下的半衰期值依次為61.89、83.51、29.12、14.59、11.57 h,隨著溫度升高,當(dāng)溫度達(dá)80 ℃時(shí)各pH下的半衰期值依次為15.40、18.15、8.25、6.29、4.43 h,說明pH2.0及pH3.0的穩(wěn)定性優(yōu)于pH4.0～6.0,且pH3.0穩(wěn)定性最好。此外,體系活化能越高則穩(wěn)定性越好,pH2.0～6.0體系的活化能Ea依次為42.30、45.31、38.85、26.83、31.20 kJ/mol,也說明在pH3.0時(shí)紫甘藍(lán)花色苷穩(wěn)定性最好。與本結(jié)果相似,蔣新龍[28]在黑米花色苷中研究發(fā)現(xiàn),高溫?zé)崽幚頃r(shí),無論較低酸度(pH4.5)或是較高酸度(pH1.0),皆會(huì)加速花色苷熱降解,應(yīng)控制pH在3.0為宜。石雙妮等[29]研究發(fā)現(xiàn)在溫度高于80 ℃時(shí),紫薯花色苷在pH3.0的緩沖溶液中熱穩(wěn)定性最好。紫甘藍(lán)花色苷的穩(wěn)定性受pH的影響,究其原因,可能為紫甘藍(lán)花色苷在溶液中的黃烊鹽陽離子、醌型和甲醇假堿、查耳酮等結(jié)構(gòu)形式隨著溫度升高及pH的增大而發(fā)生互變,在水合作用下使黃烊鹽陽離子結(jié)構(gòu)的共軛體系被破壞,生成甲醇?jí)A式,后環(huán)鏈異構(gòu)為查耳酮及α-二酮,引起吸光度的降低,穩(wěn)定性變差[30-32]。

2.4　紫甘藍(lán)花色苷的褐變指數(shù)

圖5　不同溫度和pH處理8 h對(duì)紫甘藍(lán)花色苷褐變指數(shù)的影響Fig.5　Effects of different temperatures and pH on browning index of anthocyanins from red cabbage after 8 h

pH的增大使花色苷的結(jié)構(gòu)由吡喃陽離子(紅色)轉(zhuǎn)變?yōu)榧賶A式(無色)結(jié)構(gòu),引起最大吸收波長(zhǎng)處吸光度的減小,最終由其查爾酮式的分解產(chǎn)生褐變,致使420 nm處吸光度的增加[33],可作為花色苷降解考察依據(jù)。不同溫度和pH條件下紫甘藍(lán)花色苷褐變指數(shù)的變化如圖5所示,相同pH條件下褐變指數(shù)隨溫度的升高而增大,如pH6.0時(shí)50～80 ℃的褐變指數(shù)依次為0.5654、0.6881、0.8393、1.5207。Cisse等[34]在玫瑰茄中同樣研究發(fā)現(xiàn)隨著溫度升高,其花色苷的褐變指數(shù)隨之增大且色澤變差。由圖6可知,在相同溫度條件下,熱處理時(shí)間越長(zhǎng)褐變指數(shù)也越大,且相較而言,pH較低(pH2.0～4.0)的體系褐變指數(shù)小于較高(pH5.0～6.0)的體系,其中當(dāng)pH3.0時(shí)褐變指數(shù)最低(最小值為0.3186,最大值為0.4034),pH6.0時(shí)褐變指數(shù)最高(最小值為0.4034,最大值為1.5207)。Sadilova等[35]鑒定矢車菊素-3-葡萄糖苷在pH1.0和pH3.5時(shí)的熱降解產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)僅在pH3.5時(shí)可檢測(cè)到中間產(chǎn)物查爾酮,認(rèn)為可能是pH為1.0時(shí)查爾酮不穩(wěn)定。查爾酮的分解產(chǎn)生褐變,就此推測(cè)可能是pH2.0時(shí)查爾酮穩(wěn)定性不如pH3.0,使得pH3.0時(shí)的褐變指數(shù)低于pH2.0。

圖6　紫甘藍(lán)花色苷在80 ℃時(shí)不同pH下的褐變指數(shù)Fig.6　Browning index of anthocyanins from red cabbage at 80 ℃ and different pH

3　結(jié)論

紫甘藍(lán)花色苷對(duì)熱較不穩(wěn)定,其含量隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)、溫度的升高而降低,在水溶液中熱降解反應(yīng)活化能為55.09 kJ/mol。在實(shí)驗(yàn)溫度(50～60 ℃)及pH(2.0～6.0)范圍內(nèi),紫甘藍(lán)花色苷的降解率ln(C/C0)與熱處理時(shí)間呈良好線性關(guān)系(R2>0.99),符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程。此外,花色苷的熱穩(wěn)定性和褐變反應(yīng)受溫度和pH共同影響,溫度小于70 ℃且pH低于4.0時(shí)穩(wěn)定性較好,在較高溫度(80 ℃)條件下,pH為3.0時(shí)花色苷較其他pH條件下的降解速率低、半衰期長(zhǎng)、褐變指數(shù)低,故而在較高溫度時(shí),pH3.0條件下最穩(wěn)定。

因此,在實(shí)際生產(chǎn)及應(yīng)用過程中,需盡可能使溫度低于70 ℃或者控制pH在3.0左右以使其穩(wěn)定性增強(qiáng)。

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