馮　磊，常春紅，管曉卿，汪新宇，郭甜靜　

(涿州市醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北涿州　072750)

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率有逐年上升和年輕化發(fā)展的趨勢，已成為嚴(yán)重威脅女性生命健康的惡性腫瘤之一[1]。宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)是宮頸癌的癌前病變，早期診斷和治療CIN對于預(yù)防宮頸癌有著重要的意義。近年研究表明，微小核糖核酸(microRNA，miRNA)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起著重要的作用，其中miRNA- 10b與多種惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)，可能在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮癌基因的作用[2，3]。本研究通過檢測血漿miRNA- 10b在宮頸癌患者中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征間的關(guān)系，旨在為宮頸癌的早期診斷及靶向治療提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1研究對象選取2014年3月～2017年3月河北省涿州市醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的宮頸癌患者168例，年齡29～76(47.36±10.85)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)(FIGO)分類標(biāo)準(zhǔn)和WHO分級標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)病理確診為宮頸癌者；②術(shù)前均未接受放射治療、化療及生物免疫治療者；③能配合本次研究及病歷資料完整者。宮頸癌臨床分期：I期58例，Ⅱ期67例，Ⅲ期25例，Ⅳ期 18例；病理類型：鱗狀細(xì)胞癌140例，腺癌28例；病理分級：G1 34例，G2 56例，G3 78例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移123例。另取同期與宮頸癌患者年齡匹配的CIN患者68例(CIN Ⅱ 21例，CIN Ⅲ 47例)作為CIN組和正常健康女性45例作為對照組。宮頸癌組、CIN組和對照組間年齡、體質(zhì)指數(shù)、婚姻狀況、吸煙史、飲酒史、家族史及流產(chǎn)史比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。所有研究對象均于清晨空腹抽靜脈血5 ml，離心分離血漿后保存于-80℃冰箱待檢。

1.2方法

1.2.1主要試劑和儀器：RNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司，在ABI 7500型熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT- PCR)。

1.2.2miRNA的提?。喝?00 μl血漿樣本，加入1 ml總miRNA提取液，按照血液總miRNA快速提取試劑盒(miRNeasy血漿提取試劑盒)說明書從血漿中提取總RNA。

1.2.3miRNA逆轉(zhuǎn)錄及RT- PCR檢測：以U6為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參，miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：5 μl RNA模板，3 μl U6及miRNA特異性莖環(huán)引物，0.15 μl 100 mmol/L dNTPs(with dTTP)，1.00 μl逆轉(zhuǎn)錄酶(50 U/μl)，1.50 μl 10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液，0.19 μl RNase抑制劑(20 U/μl)，4.16 μl無菌三蒸水。反應(yīng)條件：16℃30 min，42℃30 min，85℃5 min，4℃保存，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以U6為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參，反應(yīng)體系為20 μl：1.00 μl TaqMan Small RNA Assay(20×)溶液，10.00 μl TaqMan⑧Universal PCR Master MixⅡ(2×)溶液，1.33 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，7．67 μl DEPC水。擴(kuò)增條件為：95℃10 min 1個(gè)循環(huán)，95℃15 s，60℃60 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。每個(gè)反應(yīng)體系中熒光信號達(dá)到所設(shè)定閾值的經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即為Ct值，以U6為內(nèi)參照，采用2- △△Ct法計(jì)算miRNA- 10b的相對表達(dá)水平，其中△Ct=Ct目的基因-CtU6。

1.2.4血漿鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCCA)和癌胚抗原(CEA)檢測：分別采用貝克曼和羅氏電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑盒，化學(xué)發(fā)光法測定SCCA和CEA水平，操作過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

2　結(jié)果

2.1各組血漿miRNA- 10b，SCCA及CEA表達(dá)水平比較見表1。宮頸癌組血漿miRNA- 10b，SCCA及CEA表達(dá)水平均明顯高于CIN組和對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.842，13.614，8.273，均P<0.01)；而CIN組與對照組血漿miRNA- 10b，SCCA及CEA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組血漿miRNA- 10b，SCCA及CEA表達(dá)水平比較

2.2宮頸癌患者血漿miRNA- 10b表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系見表2。隨著宮頸癌臨床分期的進(jìn)展，miRNA- 10b表達(dá)水平逐漸升高，Ⅲ～Ⅳ期宮頸癌患者中miRNA- 10b表達(dá)水平明顯高于Ⅰ～Ⅱ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t/F值=19.287，P<0.01)。血漿miRNA- 10b表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度及SCCA水平也相關(guān)(t/F值=21.528，5.672，5.284，均P<0.05)，而與年齡、病理類型、病理分級、腫瘤大小、絕經(jīng)狀態(tài)及CEA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t/F值=0.462，0.714，0.487，0.828，0.318，0.663，均P>0.05)。

表2宮頸癌患者血漿miRNA- 10b表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

　　組　別nnmiRNA?10b(2?△△Ct)t/F值P值年齡(歲)　<45　　　　　≥45臨床分期?、瘛蚱凇　　　　、蟆羝?98912543572±193594±177341±124827±3150462　192870513　<0001病理類型　鱗癌　　　　　腺癌14028604±185568±16207140426病理分級　G1　　　　　G2　　　　　G3345678595±182573±168586±17504870509腫瘤大小　≤4cm　　　　　>4cm9771571±165603±19408280314淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移　是　　　　　　否45123338±126841±31721528<0001絕經(jīng)　是　　　否56112580±176587±18203180627浸潤深度　≤1/2肌層　　　　　>1/2肌層65103415±134806±32656720012SCCA(ng/ml)　<60　　　　　　　≥607890426±137793±30852840018CEA(ng/ml)　<50　　　　　　　≥5010761576±173592±18506630482

2.3血漿miRNA- 10b，SCCA及CEA對宮頸癌的診斷價(jià)值見表3。血漿miRNA- 10b，SCCA，CEA及三項(xiàng)聯(lián)合診斷宮頸癌的曲線下面積(AUC)及95%CI分別為0.836(0.752～0.924)，0.795(0.722～0.875)，0.664(0.596～0.738)，0.882(0.794～0.958)，與對照組(AUC=0.5)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。miRNA- 10b，SCCA及CEA診斷宮頸癌的最佳截值分別為4.26，6.58 ng/ml，4.05 ng/ml。三項(xiàng)聯(lián)合診斷宮頸癌的敏感度和特異度較好，分別為84.7%和81.4%。

2.4多元Logistic回歸分析血漿miRNA- 10b，SCCA，CEA與宮頸癌的關(guān)系見表4。把宮頸癌組與對照組作為二分變量，以miRNA- 10b，SCCA及CEA作為自變量，應(yīng)用多元logistic回歸模型對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，血漿miRNA- 10b和SCCA水平升高是宮頸癌發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[OR(95%CI)=1.816(1.629～2.483)，OR(95%CI)=1.427(1.206～1.975)]。

表3 血漿miRNA- 10b，SCCA及CEA對宮頸癌的診斷價(jià)值

表4 多元Logistic回歸分析血漿miRNA- 10b，SCCA，CEA與宮頸癌的關(guān)系

2.5宮頸癌患者血漿miRNA- 10b與SCCA，CEA的相關(guān)性見圖1。

圖1　血漿miRNA- 10b與SCCA，CEA的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析顯示，血漿miRNA- 10b與SCCA呈正相關(guān)(r=0.637，P<0.01)；血漿miRNA- 10b與CEA無明顯相關(guān)(r=0.108，P>0.05)。

3　討論

宮頸癌的發(fā)生是多基因、多因素和多階段共同作用的過程，其病理機(jī)制目前尚不完全明確。微小核糖核酸(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼的小RNA，在腫瘤生理病理過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，有望成為一種新的疾病診斷、分類和預(yù)后判斷的工具[4]。已有研究證實(shí)，多種miRNA在宮頸癌中異常表達(dá)，與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，可作為宮頸癌早期診斷和預(yù)后判斷的新型標(biāo)記物[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，血漿miRNA- 10b在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，且不同組織來源的惡性腫瘤中表達(dá)水平存在明顯差異，是診斷惡性腫瘤患者的潛在生物學(xué)指標(biāo)[6，7]。然而，血漿miRNA- 10b能否作為宮頸癌早期診斷的分子標(biāo)志物，目前尚未明確。

本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組血漿miRNA- 10b，SCCA及CEA表達(dá)水平均明顯高于CIN組和對照組，而CIN組與對照組無顯著差異。在宮頸癌患者臨床病理分期中，Ⅲ～Ⅳ期患者血漿miRNA- 10b的表達(dá)水平明顯高于Ⅰ～Ⅱ期。說明血漿miRNA- 10b在宮頸癌患者中異常表達(dá)，可能通過發(fā)揮癌基因的作用來調(diào)節(jié)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程。Hou等[8]研究認(rèn)為，miRNA- 10b作為miRNA家族中的一員，在宮頸癌患者中存在異常表達(dá)，并且與腫瘤的侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。另有研究表明，異常表達(dá)的miRNA參與了宮頸癌的發(fā)病和進(jìn)展，可以將miRNA作為宮頸癌新的診斷標(biāo)志物和生物治療新的靶點(diǎn)[9]。此外，進(jìn)一步分析miRNA- 10b表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系，顯示miRNA- 10b表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤深度有關(guān)，提示miRNA- 10b在腫瘤預(yù)測方面有一定的作用，分析其原因可能是存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者腫瘤負(fù)荷往往較大，腫瘤組織可釋放更多的具有原癌基因作用的miRNA進(jìn)入血液，同時(shí)可抑制機(jī)體原有的具有抑癌作用的miRNA水平表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體miRNA表達(dá)水平異常升高；浸潤越深的患者病情進(jìn)展越快，腫瘤組織miRNA表達(dá)水平升高越明顯。Zou等[10]研究也顯示，miRNA- 10b在宮頸癌患者的發(fā)生發(fā)展過程中具有一定的作用，可能促進(jìn)宮頸癌患者的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。

應(yīng)用ROC曲線分析，結(jié)果顯示血漿miRNA- 10b對宮頸癌患者的診斷效能明顯優(yōu)于傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物SCCA和CEA，其最佳截值為4.26，敏感度和特異度分別為82.6%和80.2%；三項(xiàng)聯(lián)合診斷宮頸癌的敏感度和特異度最好，分別為84.7%和81.4%。相關(guān)性分析顯示，血漿miRNA- 10b與SCCA呈正相關(guān)。說明血漿miRNA- 10b可作為宮頸癌輔助診斷的新型腫瘤標(biāo)志物，三項(xiàng)聯(lián)合檢測有助于提高宮頸癌早期診斷的準(zhǔn)確性。既往研究表明，血漿miRNA- 10b在腫瘤患者中表達(dá)升高，是腫瘤預(yù)后監(jiān)測的獨(dú)立指標(biāo)，有可能成為腫瘤早期診斷的生物標(biāo)志物[11]。Parrella等[12]研究也表明，血漿miRNA- 10b在腫瘤預(yù)后方面具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值，可作為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。本研究中，血漿miRNA- 10b和SCCA水平升高是宮頸癌發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而與年齡、病理類型、病理分級、腫瘤大小、絕經(jīng)狀態(tài)及CEA水平無關(guān)。提示miRNA- 10b可獨(dú)立作為宮頸癌早期診斷的分子標(biāo)志物。Saldanha等[13]研究認(rèn)為，miRNA- 10b在腫瘤患者中異常表達(dá)，能成為臨床實(shí)踐中一項(xiàng)新的診斷和預(yù)后標(biāo)志物。Eissa等[14]研究也發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中miRNA- 10b的表達(dá)變化有助于調(diào)控細(xì)胞周期調(diào)節(jié)通路，而細(xì)胞通路的激活又抑制其他靶基因，故miRNA的表達(dá)模式可作為腫瘤的潛在標(biāo)志物。另有研究表明，循環(huán)miRNA- 10b是檢測乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的潛在生物標(biāo)志物[15]。

綜上所述，血漿miRNA- 10b在宮頸癌患者中異常表達(dá)，有望作為早期診斷宮頸癌的分子標(biāo)志物，與SCCA和CEA聯(lián)合應(yīng)用可提高宮頸癌診斷的準(zhǔn)確性。但本研究為單中心的臨床研究，其結(jié)果可能存在一定的偏差，尚需多中心、大樣本的前瞻性研究來進(jìn)一步驗(yàn)證。

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