曹凱航，楊玉曉，高克，夏珍珍，喬秀文，但建明，李洪玲，齊譽(yù)

（石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院/ 新疆兵團(tuán)化工綠色過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地/材料化工新疆維吾爾自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子832003）

癌癥的早期診斷在整個(gè)治療過程中具有重大的意義[1]。甲胎蛋白（AFP）作為一種功能性的癌胚糖蛋白[2]，廣泛應(yīng)用于篩查和診斷原發(fā)性肝癌的腫瘤標(biāo)志物，因此，對AFP 的檢測在診斷中具有重要的作用[3-4]。具有操作簡單、靈敏度高、測定時(shí)間較短及成本低等優(yōu)點(diǎn)的電化學(xué)免疫傳感器[5]可以作為癌癥早期診斷中一種理想的檢測分析方法。

多壁碳納米管（MWCNTs）[6]具有良好的力學(xué)、電學(xué)及化學(xué)性能，使其在電化學(xué)器件、燃料電池、催化劑載體等方面應(yīng)用廣泛。聚多巴胺（PDA）是一種環(huán)境友好型的生物大分子，它具有很好的親水性。在碳納米管分散液中，多巴胺能夠發(fā)生氧化自聚合反應(yīng)，生成聚多巴胺沉積在多壁碳納米管上[7]。另外，多巴胺（DA）在聚合過程中具有弱還原性，能夠?qū)y氨絡(luò)合物還原成銀納米粒子。銀納米粒子具有高導(dǎo)電性和活躍的電活性等特點(diǎn)，是常用在電化學(xué)傳感器中的電活性物質(zhì)之一，但是由于納米銀粒子本身的不穩(wěn)定性，在檢測過程中易造成銀流失而導(dǎo)致其電化學(xué)信號不穩(wěn)定，會(huì)出現(xiàn)氧化還原峰持續(xù)降低等情況。而聚多巴胺的成膜性較好和具有粘附等作用，可將還原生成的銀納米粒子包覆在聚多巴胺薄膜中[8-9]。

本文研究在MWCNTs 分散液中聚合多巴胺，并利用聚合產(chǎn)生的弱還原性將銀氨絡(luò)合物還原成銀納米粒子，制備出MWCNTs-PDA-Ag 納米復(fù)合材料。本實(shí)驗(yàn)方法綠色簡便，在不引入額外還原劑的情況下一步合成該納米復(fù)合材料，且該復(fù)合材料具備高導(dǎo)電性，并且因聚多巴胺的加入使得材料的分散性和穩(wěn)定性都大大加強(qiáng)，使得制備的免疫傳感器具有靈敏度高和穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

多壁碳納米管（MWCNTs）購于蘇州碳豐石墨烯科技有限公司，硝酸銀（AgNO3）購于北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司，多巴胺（DA）購于合肥博美生物科技有限責(zé)任公司，甲胎蛋白（AFP）購于鄭州人福博賽生物技術(shù)有限責(zé)任公司，牛血清蛋白（BSA）購于上海展云化工有限公司，無水乙醇（C2H5OH）購于天津水晟精細(xì)化工有限公司等。實(shí)驗(yàn)用水為超純水，試劑均為分析純。

電化學(xué)工作站為CHI760E 購于上海辰華儀器有限公司，pH 計(jì)購于上海雷磁儀器有限公司，電子天平為NewClassic（0.1mg）METTLER-TOLEDO，超聲波清洗儀購于深圳市鴻展自動(dòng)化設(shè)備有限公司，離心機(jī)購于常州市金壇高科儀器廠等。

1.2 納米復(fù)合材料的制備

MWCNTs-PDA-Ag 復(fù)合材料的制備方法[10-11]如下：

取10 mg 羧基化的 MWCNTs 通過超聲使其均勻分散到10 mL 蒸餾水中，并加入50 μL 氨水（28%，wt）混合均勻，然后在磁力攪拌下加入1 mL 10 mmol/L 的AgNO3溶液，并保持?jǐn)嚢? h；隨后將20 mL 含 有0.5 mg/mL DA 的Tris （10 mmol/L PH=8.5） 緩沖溶液逐滴加入到上述混合溶液中，并在60 ℃下攪拌過夜；最后將得到的產(chǎn)物離心水洗，并在60 ℃下真空干燥。

1.3 免疫傳感器的組裝

分別用0.5 μm 和0.05 μm 的Al2O3粉末在麂皮上拋光金電極（GE，Φ= 4 mm）以形成光滑鏡面，拋光后的電極用去離子水沖洗，隨后再逐次用無水乙醇和去離子水超聲多次清洗，晾干備用；通過超聲震蕩配制2 mg/mL 的MWCNTs-PDA-Ag 復(fù)合材料均勻分散液，并用移液槍量取10 μL 分散液滴加到金電極表面，晾干備用，即得MWCNTs-PDA-Ag 修飾的電極；隨后將修飾好的電極依次anti-AFP 和BSA 中浸泡12 h 和1 h，并用蒸餾水洗去多余未連接的抗體和BSA，放置于4 ℃下儲(chǔ)存；最后將電極在不同濃度的AFP 中孵育檢測。

組裝過程如圖1所示。

圖1 免疫傳感器的示意圖Fig.1 The fabrication progress of the immunosensor

1.4 檢測方法與檢測原理

在實(shí)驗(yàn)中檢測方法采用三電極系統(tǒng)，將修飾好的工作電極使用循環(huán)伏安法（CV）對電極制備過程進(jìn)行表征以及探究優(yōu)化測試條件，用電化學(xué)交流阻抗譜（EIS）在含有5 mmol·L-1[Fe（CN）6]3-/4- 中表征組裝，在0.1 mol·L-1的緩沖液PBS 中（pH 7.0），對目標(biāo)分析物AFP 進(jìn)行檢測，CV 電位掃描區(qū)間為-0.2-0.3 V，掃速50 mV·s-1。

實(shí)驗(yàn)中對抗原含量的定量檢測原理是以抗體和抗原特異性結(jié)合的免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)，抗原與抗體特異性結(jié)合后會(huì)在電極表面形成一層免疫復(fù)合物，由于蛋白質(zhì)大分子會(huì)阻礙電極表面的電子轉(zhuǎn)移，進(jìn)而會(huì)使免疫傳感器的電流響應(yīng)值降低。結(jié)合抗原前后的電流響應(yīng)值改變量，可進(jìn)而轉(zhuǎn)化為對抗原濃度的定量檢測。

2 免疫傳感器的電化學(xué)表征

2.1 納米復(fù)合材料的形貌表征

在實(shí)驗(yàn)中將MWCNTs 和制備好的MWCNTs-PDAAg 納米復(fù)合材料通過掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）進(jìn)行形貌的表征對比分析，了解復(fù)合材料的形態(tài)和尺寸。

圖2A為MWCNTs的SEM圖像，圖2B、C為MWCNTs-PDA-Ag 納米復(fù)合材料的SEM 圖像。從圖2A-C 可見：與多壁碳納米管相比較，復(fù)合材料的表面呈粗糙狀，這是由于聚多巴胺包覆在碳納米管表面形成的，直徑約為50nm，也可觀察到銀納米顆粒附著在材料的表面。

圖2D為MWCNTs的TEM圖像，圖2E、F為MWCNTs-PDA-Ag 納米復(fù)合材料的TEM 圖像，從圖2D-F 可明顯看出：圖2E、F 中的碳納米管表面包覆著一層聚多巴胺，也可清晰觀察到納米銀顆粒點(diǎn)的存在，這進(jìn)一步驗(yàn)證了納米復(fù)合材料MWCNTs-PDAAg 的成功制備。

圖2 材料掃描電鏡SEM 和投射電鏡TEM 表征圖Fig.2 The SEM（A）/TEM（D） of MWCNTs and the SEM（B、C）/TEM（E、F） of MWCNTs-PDA-Ag

2.2 免疫傳感器組裝過程的CV 表征

電化學(xué)免疫傳感器的組裝過程循環(huán)伏安（CV）表征結(jié)果（圖3）顯示：

（1）在電極上修飾了MWCNTs-PDA-Ag 復(fù)合材料以后，由于電活性物質(zhì)Ag 的成功制備，呈現(xiàn)出可逆的氧化還原峰（曲線a）。

（2）當(dāng)成功固載上anti-AFP 在電極表面后，由于抗體阻礙了電子的轉(zhuǎn)移，CV 氧化還原的峰電流出現(xiàn)了明顯的降低（曲線b）。當(dāng)?shù)鞍追肿覤SA 封閉剩余活性位點(diǎn)后，進(jìn)一步阻礙了電子轉(zhuǎn)移，致使峰電流的又一步降低（曲線c）。

（3）將制備好的免疫傳感器在AFP 溶液中孵育后，循環(huán)伏安峰進(jìn)一步降低（曲線d），這是由于抗原抗體特異性結(jié)合后產(chǎn)生的免疫復(fù)合物進(jìn)一步阻礙了電極表面的電子轉(zhuǎn)移。

（4）上述結(jié)果表明該免疫傳感器組裝過程已完成。

圖3 免疫傳感器組裝過程的循環(huán)伏安圖Fig.3 Cyclic voltammetry curves for the immunosensor assembly process

2.3 免疫傳感器組裝過程的阻抗表征

該免疫傳感器組裝過程所對應(yīng)的交流阻抗譜（EIS）結(jié)果（圖4）顯示：在交流阻抗譜圖中高頻區(qū)內(nèi)半圓的直徑大小與阻抗之間存在著正比關(guān)系，直徑越大則說明表面阻抗值越大，電子遷移率越差。

圖4 免疫傳感器組裝過程的交流阻抗譜圖Fig.4 EIS for the immunos ensor assembly process

圖4中曲線a 為GE 裸電極的交流阻抗圖，其直徑小，所呈現(xiàn)出較小的阻抗，表明電子轉(zhuǎn)移在電極表面受擴(kuò)散影響。曲線b 為MWCNTs-PDA-Ag 修飾電極表面后的阻抗曲線，EIS 阻抗有略微減小，當(dāng)抗體修飾于電極表面后（曲線c），由于抗體作為生物大分子不利于表面電子的轉(zhuǎn)移，所以阻礙電子傳遞到電極表面，引起阻抗顯著的增加。BSA 同樣為不良導(dǎo)體，阻礙了電子轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步使阻抗值增大（曲線d），抗原作為生物蛋白大分子，伴隨著與抗體之間兩者的特異性結(jié)合，在電極表面形成免疫復(fù)合物，阻抗值再次變大（曲線e）。交流阻抗譜的結(jié)果與循環(huán)伏安圖表達(dá)一致，充分說明實(shí)驗(yàn)過程中各步驟的完成和免疫傳感器的成功制備。

2.4 免疫傳感器的掃描速度

為了探討該免疫傳感器的特性，通過對比不同的掃描速率對電化學(xué)免疫傳感器的影響得到了圖5，掃描速率范圍為：10-200 mV/s。從圖5可以看出：隨著掃描速率的增加，氧化還原峰值也在不斷增加，且峰電流響應(yīng)值與掃描速率的平方根成正比關(guān)系，呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。這說明該電化學(xué)免疫傳感器表面的氧化還原反應(yīng)受到擴(kuò)散控制。

圖5 電化學(xué)免疫傳感器的循環(huán)伏安掃速圖Fig.5 CV of the modified electrodes at different scan ra tes

3 免疫傳感器的性能檢測

3.1 條件的優(yōu)化

PBS 緩沖溶液的pH 值是影響蛋白質(zhì)大分子性質(zhì)和電子流動(dòng)速度的一個(gè)重要因素。本文通過實(shí)驗(yàn)分別檢測了pH 范圍為6.0-8.0 的PBS 緩沖溶液中電化學(xué)免疫傳感器的循環(huán)伏安譜圖，考察不同pH 值的PBS緩沖溶液對免疫傳感器性能的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 免疫傳感器的條件優(yōu)化Fig.6 Condition optimization of Immunosensors The optimization of detection conditions

圖6A 結(jié)果表明pH 為7.0 時(shí)最優(yōu)。

考察不同孵育時(shí)間對免疫傳感器性能的影響，結(jié)果（圖6B）顯示：抗原、抗體的孵育時(shí)間與抗原與抗體之間結(jié)合度有很大的關(guān)系，將已經(jīng)被修飾好的電極與一定濃度的AFP 進(jìn)行免疫反應(yīng)，在35 min 處峰電流已經(jīng)不再發(fā)生明顯升高或降低已趨于穩(wěn)定，表明免疫反應(yīng)已達(dá)到平衡，故把最佳孵育時(shí)間定為35 min。

3.2 電化學(xué)免疫傳感器的線性測試

將基于 MWCNTs-PDA-Ag 納米復(fù)合材料的免疫傳感器在上述最優(yōu)條件下對梯度濃度的AFP 進(jìn)行孵育并做循環(huán)伏安檢測，所檢測的濃度范圍為0.01-50 ng/mL，結(jié)果（圖7）顯示：

（1）AFP 濃度越大，其循環(huán)伏安峰電流響應(yīng)值越小。

（2）峰電流響應(yīng)值與AFP 濃度的對數(shù)之間呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。該免疫傳感器的線性方程為I=79.315-30.481×log CAFP，R2=0.990，檢出限為0.004 ng/mL （S/N=3）。

圖7 電化學(xué)免疫傳感器的檢測性能Fig.7 Detection performance chart of electrochemical immunos ensor

3.3 電化學(xué)免疫傳感器的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性

在相同條件下制備5 支免疫傳感器，并對1 ng·mL-1標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液進(jìn)行孵育檢測，其結(jié)果的響應(yīng)電流的標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.1%，這說明該免疫傳感器具有較好的重現(xiàn)性。

將制備好的免疫傳感器進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，連續(xù)掃描120 圈后的電流值仍為初始電流的95.3%，并將制備好的免疫傳感器置于4 ℃下保存，且每隔3 天檢測1 次，15 天后的電流響應(yīng)值為初始電流的94.8%，說明該免疫傳感器具有較好的穩(wěn)定性。

3.4 電化學(xué)免疫傳感器的選擇性

考慮到在檢測實(shí)際樣品時(shí)，在機(jī)體內(nèi)可能含有較多干擾物質(zhì)可能使檢測結(jié)果存在誤差，所以利用甲胎蛋白（AFP）、牛血清蛋白（BSA）、癌胚抗原（CEA）、多巴胺（DA）、過氧化氫酶（HRP）考察該電化學(xué)免疫傳感器的特異性和抵抗干擾的能力。將免疫傳感器分別去檢測干擾物質(zhì)和AFP 與干擾物質(zhì)混合液，其中AFP 的濃度為0.1 ng/mL，干擾物質(zhì)的濃度為1 ng/mL。

檢測結(jié)果（圖8）顯示：在不存在AFP 物質(zhì)的溶液中孵育檢測，其電流響應(yīng)基本無變化，而在檢測物中添加AFP 后，峰值有明顯的降低，這表明該免疫傳感器具有較強(qiáng)的抗干擾能力和優(yōu)異的選擇性。

圖8 免疫傳感器的選擇性Fig.8 The selectivity of Immunosensor

4 結(jié)論

（1） 本文實(shí)驗(yàn)成功制備MWCNTs/PDA/Ag 納米復(fù)合材料，并且基于該材料構(gòu)建了以甲胎蛋白為免疫模型的電化學(xué)免疫傳感器。

（2） PDA 的加入在很大程度上提高材料的分散性，防止MWCNTs 團(tuán)聚沉淀，利用PDA 的粘附作用和成膜性將銀納米粒子包覆在聚多巴胺膜內(nèi)，在進(jìn)一步提高復(fù)合材料導(dǎo)電性的同時(shí)也大大提高了該電化學(xué)免疫傳感器的穩(wěn)定性。

（3） 本實(shí)驗(yàn)方法具有制備成本低，制備過程綠色簡便，制備出的電化學(xué)免疫傳感器靈敏度、選擇性和穩(wěn)定性等性能良好。