郭亞萍，范樂之，汪家利，張海燕，孫仁寬，王航宇，黃健2，*，王金輝，

（1 沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧 沈陽110016；2 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150000；3 深圳弘?yún)R生物醫(yī)藥有限公司，廣東 深圳518118；4 石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子832000）

脾多肽注射液是健康小牛脾臟提取物制成的分子質(zhì)量小于 6000 的多肽、游離氨基酸、核酸、總糖的無菌水溶液。目前脾多肽注射液在臨床上主要是聯(lián)合其他藥物治療胰腺癌[1]、食管癌[2]、非小細(xì)胞肺癌[3,4]、卵巢上皮性癌[5,6]、原發(fā)性肝癌[7]、胃癌[8]、中晚期宮頸癌[9]、大腸癌[10]、直腸癌[11]、結(jié)腸癌[12]等；還可用于治療惡性腫瘤化療后引起的血小板減少[13,14]、糾正重度燒傷患者及肺癌患者肺部感染的T 淋巴細(xì)胞亞群紊亂[15,16]等。近年來，對脾多肽注射液聯(lián)合其他藥物治療各種腫瘤研究備受關(guān)注，而對其中的多肽成分鑒定分析及其多肽裂解規(guī)律未見報(bào)道。本文基于對其他多肽的質(zhì)譜裂解規(guī)律[17-21]的研究，根據(jù)已有的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)和表達(dá)量豐度排名選擇9種多肽作為研究對象。運(yùn)用Analyst 1.6.2 軟件中的Calculators 工具計(jì)算，得到各肽段加氫后帶不同電荷的準(zhǔn)分子離子；采用ChemBioDraw Ultra 14.0 軟件模擬多肽肽段的裂解，得到各肽段的碎片離子；然后準(zhǔn)分子離子和碎片離子組成離子對，優(yōu)化源參數(shù)和化合物參數(shù)后進(jìn)行MRM 掃描；再用合成的TD1進(jìn)行Q1 和MS2 掃描結(jié)果和脾多肽注射液MRM 的結(jié)果比對，對其數(shù)據(jù)進(jìn)行分析總結(jié)，推斷其裂解規(guī)律。在脾多肽注射液現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，本文首次利用質(zhì)譜檢測，為脾多肽注射液的后續(xù)研究提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑、儀器與藥品

試劑：甲醇、乙腈和甲酸，均為色譜級；美國賽默飛世爾科技有限公司。

主要儀器：API 3000 串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀，美國AB SCIEX ；QL-866 渦流儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；SPE 柱，BAKERBOND Octadecyl C18，美國J.T.Baker ；MS 105 電子天平，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；純水儀，英國ELGA PURELAB Classic。

藥品：脾多肽注射液（2 mL/ 支，一盒6 支；吉林豐生制藥有限公司），多肽EIAQDFKTDL（TD1）（純度99.06 %，強(qiáng)耀生物科技有限公司）

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI 源）；檢測模式：正離子模式監(jiān)測；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）（脾多肽注射液）、全掃描（Q1 Scan）（TD1）、產(chǎn)物離子掃描（Product Ion Scan （MS2））（TD1）；離子噴射電壓（IS）：5.0 kV；溫度（TEM）：0 ℃；霧化氣（NEB）：5；氣簾氣（CUR）：8；碰撞氣（CAD）：4（脾多肽注射液）、1（TD1） ；去簇電壓（DP）：30 V（脾多肽注射液）、80 V（TD1）；聚焦電壓（FP）：100 V（脾多肽注射液）、200 V（TD1）；入口電壓（EP）：10.00 V；碰撞能（CE）：30 V；碰撞室出口電壓（CXP）：15 V。

1.2.2 脾多肽注射液工作液的配制

先用2.0 mL 甲醇活化SPE 柱，待用。再取100 μL 脾多肽注射液于1.5 mL 離心管中，加入900 μL甲醇，渦流混勻后，移取至到SPE 柱上，用2.0 ml 甲醇洗脫至10.0 mL 容量瓶中，加入1.0 mL 1% 甲酸水，甲醇定容，混勻，即得脾多肽注射液的工作液。

1.2.3 多肽EIAQDFKTDL（TD1）工作液的配制

稱取約1.0 mg（實(shí)際稱樣量：0.98 mg）TD1，用33%乙腈-67%水溶劑定容至5.0 mL 容量瓶，即得濃度為196 μg/mL 的儲備液；用0.1%甲酸- 乙腈溶劑稀釋至1.96 μg/mL，即得TD1 的工作液。

1.2.4 測定

脾多肽注射液：運(yùn)用Analyst 1.6.2 軟件中的Calculators 工具計(jì)算，得到各肽段加氫后帶不同電荷的準(zhǔn)分子離子；采用ChemBioDraw Ultra 14.0 軟件模擬多肽肽段的裂解，得到各肽段的碎片離子；然后準(zhǔn)分子離子和碎片離子組成離子對，優(yōu)化源參數(shù)和化合物參數(shù)后進(jìn)行MRM 掃描。

TD1：先進(jìn)行Q1 scan 掃描，優(yōu)化NEB、CUR 等源參數(shù)和DP 等化合物參數(shù)，找到響應(yīng)最強(qiáng)的母離子比如590.6 [M+2H]2+；然后進(jìn)行Product Ion Scan（MS2）掃描，優(yōu)化CE 等化合物參數(shù)，找到目標(biāo)子離子。

2 結(jié)果

2.1 脾多肽注射液MRM 結(jié)果分析

脾多肽注射液的MRM 結(jié)果見表1。以十個氨基酸的TD1 為例，a，b，c，x，y，z 型碎片離子結(jié)構(gòu)如圖1所示；9 種多肽均檢測到4 種可能的多電荷準(zhǔn)分子離子峰，而且都檢測到a，b，c，x，y，z 型碎片離子。在4 種可能的多電荷準(zhǔn)分子離子峰中，[M+2H]2+的碎片離子最多且大部分為小分子碎片離子；推測在低碰撞能的作用下，可能比較容易從多肽的兩端裂解，而不易從多肽的中間裂解。

圖1 TD1 的結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The structure of TD1

表1 脾多肽注射液中9 種多肽對應(yīng)的氨基酸序列、母離子及檢測到的碎片離子Tab.1 Nine polypeptide of Lienal Polypeptide Injection corresponding Amino acid sequence ，Parent ion （m/z） and detected product ions

2.2 TD1 的MS 譜圖分析

從圖2可知，TD1 中檢測到的準(zhǔn)分子離子峰m/z分別為591.0（[M+2H]2+）和1180.4（[M+H]+），最強(qiáng)的準(zhǔn)分子離子峰m/z 為591.0。

圖2 TD1 的質(zhì)譜圖Fig.2 MS spectra of TD1

2.3 TD1 的MS/MS 譜圖分析

從圖3可知，在碰撞能為35 V 時，母離子m/z 393.7（[M+3H]3+）幾乎被完全裂解，其特征碎片的離子峰少而且強(qiáng)度低，大部分為小分子碎片離子；母離子m/z 591.0（[M+2H]2+）的特征碎片離子峰多且強(qiáng)度較高；而母離子m/z 1180.1（[M+H]+）被裂解的很少，特征碎片離子峰少且強(qiáng)度低。以上結(jié)果表明，在相同碰撞能作用下，不同電荷的母離子，譜圖差異很大；且母離子帶的電荷越多，多肽越易被裂解，特征碎片離子越小。

圖3 TD1 不同母離子在35 V 碰撞能作用下的質(zhì)譜圖Fig.3 MS spectra of different parent ions of TD1 at 35 V of collision energy

當(dāng)碰撞能在20～35 V 時，TD1 母離子590.6（[M+2H]2+）的特征碎片離子峰為m/z 215.1，243.1，737.4，937.5 的強(qiáng)度隨碰撞能的增加而改變（圖4）。當(dāng)碰撞能為30 V 時，母離子大部分被裂解，產(chǎn)生較多的特征碎片離子峰，且特征峰m/z 215.1 最強(qiáng)，最適合于對TD1 進(jìn)行定性與定量分析。

圖4 TD1 最強(qiáng)母離子590.6（[M+2H]2+）在不同碰撞能作用下的MS2 譜圖Fig.4 MS2 spectra of 590.6 （[M+2H]2+）of TD1 at different collision energy

從圖5可知，TD1 的最強(qiáng)準(zhǔn)分子離子峰590.6（[M+2H]2+）在最優(yōu)碰撞能條件下，主要產(chǎn)生b 型和y型碎片離子。從其碎片離子的響應(yīng)強(qiáng)度來看，b2 和y8 碎片離子響應(yīng)都強(qiáng)，推測TD1 中異亮氨酸羧基端易裂解；其次是b3 和y7 碎片離子，推測TD1 中谷氨酰胺氨基端易被裂解。

圖5 TD1 在最優(yōu)碰撞能作用下的MS2 譜圖Fig.5 MS2 spectra of TD1 under the corresponding optimized collision energy

3 討論

采用三重四級桿質(zhì)譜技術(shù)可以對脾多肽注射液中的多肽成分進(jìn)行分析，而且可對TD1 的準(zhǔn)分子離子峰及其分布規(guī)律，研究其準(zhǔn)分子離子峰的裂解規(guī)律；在電噴霧離子化過程中，脾多肽注射液中的多肽很容易帶上多電荷，裂解時很容易產(chǎn)生小分子碎片離子，而且[M+2H]2+和[M+3H]3+母離子產(chǎn)生的碎片離子最多。

在TD1 的MS2 譜圖中，在相同碰撞能作用下，不同電荷的母離子，譜圖差異很大；且母離子帶的電荷越多，多肽越易被裂解，特征碎片離子越?。划?dāng)碰撞能在20～35 V 時，母離子590.6（[M+2H]2+）的特征碎片離子峰的強(qiáng)度隨碰撞能的增加而改變；當(dāng)碰撞能為30 V 時，母離子大部分被裂解，產(chǎn)生較多的特征碎片離子峰，且特征峰m/z 215.1 最強(qiáng)，最適合于對TD1 進(jìn)行定性與定量分析；在最優(yōu)碰撞能條件下，主要產(chǎn)生b 型和y 型碎片離子，根據(jù)碎片離子的響應(yīng)強(qiáng)度，推測異亮氨酸羧基端和谷氨酰胺氨基端易被裂解。

綜上，本研究運(yùn)用三重四極桿質(zhì)譜對脾多肽注射液中9 種多肽進(jìn)行了定性分析，并以TD1 為例推測了其可能的裂解規(guī)律，為后續(xù)TD1 的定量研究提供理論依據(jù)；也為脾多肽中其他多肽成分的定性及定量研究提供了一種靈敏度高的方法。