鄧發(fā)軍，潘宇，常飛，房偉，方澤民，肖亞中

安徽大學 現代生物制造安徽省重點實驗室 安徽省微生物與生物催化工程研究中心，安徽 合肥　230601

β-葡萄糖苷酶 (E.C. 3.2.1.21) 能催化水解或轉移β-1,4-糖苷鍵，是糖苷水解酶類的重要成員[1-2]。早期研究表明，β-葡萄糖苷酶廣泛存在于生物體內，其在纖維素降解、生物燃料煉制中有廣泛的應用潛力[3-5]。隨著研究的深入，β-葡萄糖苷酶在食品加工及活性苷元制備等方面也逐步展現出巨大的應用潛力[6-8]。由于原核生物來源的β-葡萄糖苷酶具有較好的催化能力和較高的產量，近年來關于其表達及性質研究的報道越來越多[9-12]。與原始產酶菌株相比，利用大腸桿菌Escherichia coli作為宿主細胞誘導表達原核生物來源重組 β-葡萄糖苷酶，具有發(fā)酵周期更短、酶蛋白產量更高等優(yōu)勢，因此其在β-葡萄糖苷酶生產中有廣泛的應用[13-15]。然而，在大腸桿菌高密度發(fā)酵生產過程中，菌體生物量和異源蛋白表達量往往受到溶解氧不足的限制而難以達到較高的水平[16]。因此，改進大腸桿菌異源表達方法、提高大腸桿菌對低溶氧環(huán)境的適應能力，對于提高β-葡萄糖苷酶的產量、加快推進其工業(yè)化生產應用具有重要意義。

透明顫菌Vitreoscilla最早發(fā)現于湖泊等淡水沉積物中，是一種革蘭氏陰性細菌，屬于貝日阿托氏菌屬 (Beggiatoasp.)。為了適應其生存的厭氧環(huán)境，透明顫菌能夠合成一種類似于動物血紅蛋白的多肽，被稱為透明顫菌血紅蛋白(VitreoscillaHemoglobin，VHb)。研究發(fā)現 VHb在不同的胞內環(huán)境下可以呈現出不同的狀態(tài) (氧化態(tài)、氧合態(tài)和還原態(tài)) 并且可以互相轉化并具有氧結合性[17]。Wang等將VHb和耶羅維亞酵母脂肪酶在畢赤酵母中共表達，在10 L發(fā)酵罐微氧環(huán)境中脂肪酶的產量增加了約84%[18]。Pablos等在大腸桿菌菌株W3110中表達VHb后，微氧環(huán)境中菌體生物量提高了約33%，同時菌體比生長速率提高了約30%[19]。

本實驗室前期構建獲得β-葡萄糖苷酶突變體蛋白Bgl1A (A24S/F297Y)，其具有葡萄糖和乙醇雙耐受的特性，在大豆異黃酮苷元制備中表現出優(yōu)秀的應用潛力[20]。然而在使用大腸桿菌高密度發(fā)酵制備 Bgl1A (A24S/F297Y) 時，溶解氧不足阻礙了酶蛋白產量的進一步提高。為了緩解大腸桿菌菌體在高密度發(fā)酵中的溶解氧不足的限制，本研究將VHb和Bgl1A (A24S/F297Y) 在大腸桿菌中進行共表達，并在搖瓶水平和3 L發(fā)酵罐水平考察了 VHb的表達對菌體生物量和酶活變化的影響情況。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1　質粒、菌株和培養(yǎng)基

突變體蛋白 Bgl1A (A24S/F297Y) 表達菌株E. coliBL21 (DE3)/pET22b-bgl為本實驗室構建。質粒pET-22b為本實驗室保存。透明顫菌血紅蛋白基因序列 (vgb) 根據大腸桿菌密碼子偏好性進行密碼子優(yōu)化，并由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。表達菌株 BL21 (DE3) 購自北京全式金生物技術有限公司。

搖瓶培養(yǎng)基采用 LB培養(yǎng)基和 TB培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基 (1 L)：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g。TB培養(yǎng)基 (1 L)：酵母提取物24 g，胰蛋白胨12 g，甘油4 mL，使用時加入終濃度為17 mmol/L的 KH2PO4和 72 mmol/L K2HPO4緩沖液。發(fā)酵罐初始培養(yǎng)基為改良TB培養(yǎng)基 (增加甘油至終濃度15 g/L)。發(fā)酵罐補料培養(yǎng)基 (1 L)：酵母提取物45 g，胰蛋白胨45 g，甘油500 mL。

1.1.2　主要試劑和儀器

限制性核酸內切酶、T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶均購自TaKaRa公司；isopropy-β-D-thiogalactoside (IPTG) 購自生工生物工程 (上海)股份有限公司；p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside(pNPG) 購自Sigma公司；質粒抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自 Axygen公司；其他試劑均為國產或進口分析純試劑。大腸桿菌的高密度發(fā)酵使用Eppendorf BioFlo 115的3 L發(fā)酵罐。

1.2　方法

1.2.1　表達質粒的構建

以T7啟動子表達VHb的質粒pET22b-T7-vgb構建：以pUC57-vgb為模板，使用引物vgb-F和vgb-R克隆出vgb片段，使用內切酶NdeⅠ和XhoⅠ分別對vgb片段和 pET22b質粒進行雙酶切，并對酶切后的片段進行回收。使用T4 DNA連接酶將回收后的vgb片段和 pET22b片段進行連接，并轉化至表達菌株BL21 (DE3)。

以雙順反子形式共表達 VHb和 β-葡萄糖苷酶Bgl1A (A24S/F297Y) 的質粒pET22b-bgl-Bicvgb構建：以pET22b-bgl和pUC57-vgb為模板，使用引物 bgl-F、bgl-Bic-R和引物 vgb-Bic-F、vgb-Bic-R分別克隆出bgl和vgb片段，以獲得的bgl和vgb片段為模板，使用重疊延伸PCR進一步獲得bgl-Bic-vgb片段。使用內切酶NdeⅠ和XhoⅠ分別對bgl-Bic-vgb片段和pET22b質粒進行雙酶切，并對酶切后的片段進行回收。使用T4 DNA連接酶將回收后的bgl-Bic-vgb片段和pET22b片段進行連接，并轉化進入表達菌株BL21 (DE3)。雙順反子形式中，bgl和vgb的間隔序列為 GAAGGAGATAT ATAATG，其中 GAAGGAG為核糖體結合位點RBS，bgl終止密碼子TAA與vgb起始密碼子ATG重疊，保證VHb的表達。

表1　本研究所用的引物Table 1　Primers used in this research

以 T7啟動子形式共表達 VHb和 β-葡萄糖苷酶 Bgl1A (A24S/F297Y) 的共表達質粒 pET22bbgl-T7-vgb構建：以按上述方法構建獲得的pET22b-vgb為模板，使用引物T7-Pro-F和T7-Ter-R克隆獲得T7-vgb片段。使用內切酶Tth111Ⅰ分別對T7-vgb片段和pET22b-bgl質粒進行雙酶切，并對酶切后的片段進行回收。使用T4 DNA連接酶將回收后的T7-vgb片段和pET22b-bgl片段進行連接，并轉化進入表達菌株BL21 (DE3)。

1.2.2　發(fā)酵培養(yǎng)方法

挑取活化的表達菌株單克隆接種于含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min振蕩過夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)獲得的種子液以1%接種量 (V/V) 接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時添加氨芐青霉素至終濃度100 μg/mL，放置于37 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)。當發(fā)酵液菌體生物量OD600值達到0.6時，添加終濃度0.2 mmol/L的IPTG進行誘導表達，并將誘導溫度設置為28 ℃，在不同誘導時間進行取樣，并對樣品的生物量和發(fā)酵酶活進行測定。在搖瓶水平 (250 mL三角瓶)中模擬低溶氧環(huán)境進行誘導表達時設置裝液量為200 mL，搖床轉速為120 r/min；高溶氧誘導表達條件為裝液量50 mL，搖床轉速為220 r/min。

在3 L發(fā)酵罐中進行高密度發(fā)酵時，將過夜培養(yǎng)的種子液以 1%接種量 (V/V) 接種于 50 mL含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)擴大培養(yǎng)，當OD600達到1.5–2.5時，按5%接種量接種于3 L發(fā)酵罐中。發(fā)酵罐中的初始培養(yǎng)基為1 L的改良TB培養(yǎng)基。用25% (V/V) 氨水控制發(fā)酵過程中的發(fā)酵液pH在6.8–7.2之間，適當調節(jié)通氣量和攪拌速度來控制溶氧。采用三階段控制：第一階段為接種后至菌體生物量達到OD600=25時，調節(jié)攪拌轉速和通氣量控制溶氧在10%以上；當菌體生物量達到OD600=25時，進入第二階段，將空氣流速控制在3.5 L/min、攪拌轉速控制在500 r/min并維持6 h；第三階段提高轉速至1 000 r/min，并在通氣中加入0.5 L/min的氧氣直至發(fā)酵結束。發(fā)酵過程中溫度控制在 28 ℃，當發(fā)酵液溶氧 (DO) 上升幅度超過30%時，開始進行補料，補料速率設置為6 mL/(L·h)。當菌體生物量達到OD600=25時，添加IPTG至終濃度0.2 mmol/L進行誘導，在不同誘導時間進行取樣并對樣品的生物量和發(fā)酵酶活進行測定。

1.2.3　分析方法

將不同誘導條件下取得的樣品在4 000 r/min離心20 min獲得菌體，用適當體積50 mmol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液 (pH 6.5) 重懸菌體。隨后使用超聲破碎的方法對細胞壁進行破碎，超聲條件設置為：超聲4 s，靜置6 s，超聲時間設置為15 min。將超聲破碎后的破碎液在12 000 r/min離心10 min，分別收集上清和沉淀，并對樣品采用SDS-PAGE進行分析。

β-葡萄糖苷酶活力測定：pNPG溶液 (100 mmol/L)和緩沖液各取25 μL和450 μL并混勻。預熱3 min后，向反應液中加入適當稀釋的酶液25 μL開始反應。反應時間設置為10 min，終止反應方法為加入500 μL的碳酸鈉溶液 (母液濃度為1 mol/L)。在05 nm處測量終止反應后的反應液的OD值。依據pNP標準曲線公式計算pNP的濃度和酶的活性及相對活性。酶活單位 (U) 定義：即在酶最適作用條件下，每分鐘催化水解pNPG 生成 1 μmol NP所需要的酶量為1 U。

2　結果與分析

2.1　單獨表達VHb對大腸桿菌的影響

在高溶氧條件下，LB培養(yǎng)基中加入IPTG對VHb誘導表達8 h后，菌體生物量即可達到OD600值為4.44±0.19，無VHb表達的對照組OD600值僅為2.24±0.12 (圖1A)。在低溶氧條件下誘導VHb表達 24 h后，重組菌生物量比對照組提高了70.21% (圖 1B)。

高溶氧條件下，在營養(yǎng)更為豐富的 TB培養(yǎng)基誘導 VHb表達 8 h后的菌體生物量達到4.41±0.22，對照組為 2.9±0.15；隨誘導時間的延長，含 VHb的菌體OD600值達到 13.8±0.96，無VHb的對照組為11.4±0.79 (圖2A)。在低溶氧環(huán)境中TB培養(yǎng)基中誘導表達24 h后的菌體生物量OD600值為 2.99±0.32，比對照組的生物量提高了45.82 % (圖2B)。初步實驗結果表明，在大腸桿菌BL21 (DE3) 中誘導表達VHb能夠提高菌體的生物量。

2.2　搖瓶水平共表達β-葡萄糖苷酶和VHb

為了獲得不同的誘導表達強度，分別使用雙順反子形式和T7啟動子形式對VHb和β-葡萄糖苷酶在大腸桿菌中進行共表達，考察不同共表達形式對菌體生物量和β-葡萄糖苷酶酶活的影響。高溶氧條件下，在LB培養(yǎng)基中以兩種形式誘導表達VHb均能夠在誘導前期促進菌體生物量增加。

圖1　LB培養(yǎng)基中生物量隨誘導時間的變化情況 (A為高溶氧條件，B為低溶氧條件)Fig. 1　Changes of biomass in the LB medium with time under aerobic (A) and microaerobic (B) conditions.

2.2.1　搖瓶水平中雙順反子形式共表達β-葡萄糖苷酶和VHb

雙順反子情況下，在誘導8 h時生物量較對照組均能增加 33.33%左右；隨誘導時間延長到24 h，實驗組和對照組的生物量趨于一致(圖1A)。在TB培養(yǎng)基中，高溶氧條件下VHb的表達能夠持續(xù)促進生物量增加，以雙順反子形式表達VHb菌株的生物量在誘導24 h后達到OD600值為 16.25±0.98，比無 VHb表達的對照組提高25.09% (圖 2A)。

低溶氧條件下，在兩種培養(yǎng)基中誘導表達VHb后菌體的生物量均得到明顯提高。LB培養(yǎng)基中采用雙順反子共表達方法在誘導8 h后的生物量達到OD600值為1.89±0.34，持續(xù)誘導至24 h后的生物量增加到OD600值2.29±0.36，比對照組提高了21.12% (圖1B)。在TB培養(yǎng)基中使用雙順反子對VHb誘導表達24 h后，菌體生物量達到4.24±0.29，比對照組提高了35.03% (圖2B)。

以雙順反子形式共表達 VHb能夠提高 β-葡萄糖苷酶的發(fā)酵總酶活。圖3中的實驗結果顯示，在LB培養(yǎng)基中以雙順反子形式共表達VHb，高溶氧條件誘導8 h后β-葡萄糖苷酶的發(fā)酵酶活達到 (10.35±0.45) U/mL，比對照組提高 19.79%；低溶氧條件誘導24 h后酶活達到 (5.68±0.45) U/mL，比對照組提高15.92%。在TB培養(yǎng)基中以雙順反子形式共表達VHb后，高溶氧條件下β-葡萄糖苷酶的發(fā)酵酶活達到 (36.4±2.2) U/mL，比對照組提高20.93%；在低溶氧條件下發(fā)酵總酶活為(9.78±0.55) U/mL，比對照組提高25.38%。

2.2.2　搖瓶水平中 T7啟動子形式共表達 β-葡萄糖苷酶和VHb

LB培養(yǎng)基中采用 T7啟動子共表達方法，在誘導8 h后的生物量達到OD600值為1.86±0.33，持續(xù)誘導至 24 h后的生物量增加到OD600值為2.31±0.43，比對照組提高了 22.22% (圖 1B)。在TB培養(yǎng)基中使用T7啟動子對VHb誘導表達24 h后，菌體生物量OD600值為4.19±0.33，比對照組提高了31.85% (圖2B)。

以 T7啟動子表達VHb時 β-葡萄糖苷酶的總酶活均低于對照組，在高溶氧條件LB和TB培養(yǎng)基中僅為 (5.47±0.35) U/mL和 (21.14±1.31) U/mL；在低溶氧條件下的總酶活僅為 (2.91±0.29) U/mL和 (6.47±0.48) U/mL。SDS-PAGE結果顯示，以T7啟動子表達VHb時，有部分VHb以包涵體的形式存在 (圖4)。

2.3　3L發(fā)酵罐水平共表達β-葡萄糖苷酶和VHb

為了考察大腸桿菌高密度發(fā)酵中共表達VHb對菌體生物量和β-葡萄糖苷酶產量的影響，本實驗通過對攪拌槳轉速和通氣量進行調節(jié)，將高密度發(fā)酵過程分為三階段。在第一階段中，由于維持了較高的溶氧水平，發(fā)酵菌體能夠快速進入對數生長期，重組工程菌在發(fā)酵6 h后菌體密度均能夠達到OD600值為25左右，此時加入IPTG對目標蛋白進行誘導。誘導表達2 h后，調節(jié)攪拌轉速至500 r/min和降低通氣量至3.5 L/min使發(fā)酵溶氧水平降至5%以下。在第二階段中使用雙順反子形式和T7啟動子形式共表達 VHb的工程菌生物量均超過對照組。經過6 h的低溶氧發(fā)酵后，增大攪拌轉速至1 000 r/min并在通氣中增加氧氣0.5 L/min進行第三階段發(fā)酵。共表達VHb的工程菌對氧氣的利用能力均高于對照組。大腸桿菌生物量在第三階段增長迅速，其中以雙順反子形式共表達VHb的工程菌生物量在發(fā)酵20 h時達到最大生物量 (OD600值為67.14±2.98)，以T7啟動子共表達VHb的工程菌BL21(DE3)/pET22b-bgl-T7-vgb生物量達到最大 (OD600值為73.28±3.21)，無 VHb表達的對照菌株生物量僅為OD600值48.83±3.24 (圖5A)。以雙順反子形式共表達VHb能夠顯著提高β-葡萄糖苷酶的發(fā)酵酶活，誘導14 h后達到最大發(fā)酵酶活 (141.23±6.84) U/mL。而以T7啟動子表達 VHb的工程菌 β-葡萄糖苷酶發(fā)酵酶活為 (110.12±5.26) U/mL，無VHb表達的對照菌發(fā)酵酶活為 (104.45±6.98) U/mL (圖 5B)。

圖3　LB培養(yǎng)基和TB培養(yǎng)基中β-葡萄糖苷酶酶活的變化情況 (A為LB培養(yǎng)基，B為TB培養(yǎng)基)Fig. 3　Changes of β-glucosidase activity in LB medium (A) and TB medium (B) with time.

3　討論

圖4　SDS-PAGE分析三角瓶中低溶氧條件下β-葡萄糖苷酶和VHb的表達情況 (TB培養(yǎng)基)Fig. 4　SDS-PAGE assay for the expression of β-glucosidase and VHb in TB medium under microaerobic condition in triangular flask. M stands for molecular marker,super and precip denote the supernatant and precipitate components of broken cells.

圖5　3 L發(fā)酵罐中生物量和酶活變化情況Fig. 5　Changes of biomass and β-glucosidase activity in 3 L fermentor with time.

β-葡萄糖苷酶在生物能源、食品工業(yè)、保健品行業(yè)、農業(yè)、醫(yī)藥等領域有著廣泛的應用，但是在利用大腸桿菌高密度發(fā)酵生產β-葡萄糖苷酶時，溶解氧不足往往阻礙了酶蛋白產量的進一步提高。在供氧不足的情況下，大腸桿菌糖酵解代謝和三羧酸循環(huán)代謝不均衡引發(fā)的乙酰輔酶A積累，進而積累的乙酰輔酶A在?；D移酶和乙酸激酶等作用下生成乙酸等其他副產物[16,21-22]。本研究通過在大腸桿菌中共表達透明顫菌血紅蛋白VHb并對共表達方法進行優(yōu)化對比，提高了大腸桿菌對溶氧的利用和對低溶氧環(huán)境的耐受能力。Pablos等對 VHb影響大腸桿菌代謝進行研究發(fā)現，VHb能加快三羧酸循環(huán)進程，提高菌體對乙酰輔酶A的消耗速度，進而在一方面能夠促進菌體生物量的增加，另一方面可以抑制乙酸等代謝副產物的生成[16,23]。本研究在搖瓶水平中的實驗結果顯示，VHb與目標蛋白的共表達能夠在高溶氧環(huán)境中最大提高23.17%的生物量，在低溶氧環(huán)境中最大能夠提高35.03%的生物量。與我們的結果類似，Liu等在大腸桿菌中共表達VHb和eGFP，在搖瓶中的低溶氧條件下提高了 eGFP蛋白的表達量[24]。值得注意的是，在高溶氧條件下，IPTG對VHb誘導表達后的菌體生物量比無VHb表達的對照組高。此結果暗示VHb在搖瓶中模擬高溶氧環(huán)境時，也能夠提高大腸桿菌菌體對溶解氧的利用效率，并在一定程度上緩解了異源蛋白表達所帶來的代謝壓力。Li等將空腸彎曲桿菌Campylobacter jejuni中的血紅蛋白CBh在大腸桿菌BL21 (DE3) 中進行異源表達，在500 mL三角瓶中裝液量100 mL，200 r/min條件下，誘導表達CBh的菌株生物量 (OD600值) 在平臺期較對照組有22.2%的提高[25]。Kim等使用BL21 (DE3) 作為表達宿主，將VHb與目標蛋白進行共表達，最終在發(fā)酵罐中獲得了提高1.9倍的目標蛋白產量[26]。

本研究中對發(fā)酵罐獲得的發(fā)酵樣品進行SDS-PAGE檢測結果顯示，使用 T7啟動子表達VHb雖然比雙順反子形式能夠獲得更多的蛋白表達量，但有部分VHb形成了不可溶的包涵體，不能夠發(fā)揮其相應的氧傳遞功能 (圖 4，圖 7)。過量表達的 VHb雖然能夠幫助大腸桿菌對溶氧的利用 (圖5C)，但也在一定程度上消耗了大腸桿菌的資源，進而導致β-葡萄糖苷酶的表達受到限制。以雙順反子形式進行異源蛋白的共表達，所獲得的 VHb表達量較 T7啟動子獲得的表達量低，但均為可溶的活性形式存在于細胞中，這不僅有利于獲得較高的菌體生物量，β-葡萄糖苷酶的表達量也得到提高。以上結果表明，在大腸桿菌中以雙順反子形式共表達 VHb和 β-葡萄糖苷酶能夠提高低溶氧環(huán)境中的生物量水平和酶蛋白的表達水平，是有開發(fā)應用前景的一種蛋白表達方法。

圖6　3 L發(fā)酵罐中溶氧變化情況Fig. 6　Changes of solube oxygen in 3 L fermentor with time.

圖7　SDS-PAGE分析3 L發(fā)酵罐中β-葡萄糖苷酶和VHb的表達情況Fig. 7　SDS-PAGE assay for the expression of β-glucosidase and VHb in 3 L fermentor. M stands for molecular marker,super and precip denote the supernatant and precipitate components of broken cells.

[1]Leah R,Kigel J,Svendsen I,et al. Biochemical and molecular characterization of a barley seed β-glucosidase. J Biol Chem,1995,270:15789–15797.

[2]Chamoli S,Kumar P,Navani NK,et al. Secretory expression,characterization and docking study of glucose-tolerant β-glucosidase fromB. subtilis. Int J Biol Macromol 2016,85: 425–433.

[3]Youn SY,Park MS,Ji GE. Identification of the β-glucosidase gene fromBifidobacteriumanimalissubsp.lactisand its expression inB.bifidumBGN4.J Microbiol Biotechnol,2012,22(12): 1714–1723.

[4]Yao GS,Wu RM,Kan QB,et al. Production of a high-efficiency cellulase complex via β-glucosidase engineering inPenicillium oxalicum. Biotechnol Biofuels,2016,9: 78.

[5]Cripwell R,Favaro L,Rose SH,et al. Utilisation of wheat bran as a substrate for bioethanol production using recombinant cellulases and amylolytic yeast.Appl Energ,2015,160: 610–617.

[6]Gueguen Y,Chemardin P,Janbon G,et al. A very efficient β-glucosidase catalyst for the hydrolysis of flavor precursors of wines and fruit juices. J Agr Food Chem,1996,44(8): 2336–2340.

[7]Yan FY,Xia W,Zhang XX,et al. Characterization of β-glucosidase fromAspergillus terreusand its application in the hydrolysis of soybean isoflavones.J Zhejiang Univ Sci B,2016,17(6): 455–464.

[8]Kaya M,Ito J,Kotaka A,et al. Isoflavone aglycones production from isoflavone glycosides by display of β-glucosidase fromAspergillus oryzaeon yeast cell surface. Appl Microbiol Biotechnol,2008,79(1):51–60.

[9]Gu MZ,Wang JC,Liu WB,et al. Expression and displaying of β-glucosidase fromStreptomyces coelicolorA3 inEscherichia coli. Appl Biochem Biotechnol,2013,170(7): 1713–1723.

[10]Mai ZM,Su HF,Zhang S. Characterization of a metagenome-derived β-glucosidase and its application in conversion of polydatin to resveratrol.Catalysts,2016,6(3): 35.

[11]Cui CH,Kim JK,Kim SC,et al. Characterization of a ginsenoside-transforming β-glucosidase fromPaenibacillus mucilaginosusand its application for enhanced production of minor ginsenoside F-2. PLoS ONE,2014,9(1): e85727.

[12]Maki ML,Armstrong L,Leung KT,et al. Increased expression of β-glucosidase A inClostridium thermocellum27405 significantly increases cellulase activity. Bioengineered 2013,4(1): 15–20.

[13]Naz S,Ikram N,Rajoka MI,et al. Enhanced production and characterization of a β-glucosidase fromBacillus haloduransexpressed inEscherichia coli. Biochemistry,2010,75(4): 513–518.

[14]Ohmiya K,Takano M,Shimizu S. Cloning of a β-glucosidase gene fromRuminococcus albusand its expression inEscherichia coli. Ann N Y Acad Sci,1991,646: 41–52.

[15]Shin KC,Lee HJ,Oh DK. Substrate specificity of β-glucosidase fromGordonia terraefor ginsenosides and its application in the production of ginsenosides Rg3,Rg2,and Rh1from ginseng root extract. J Biosci Bioeng,2015,119(5): 497–504.

[16]Pablos TE,Sigala JC,Le Borgne S,et al. Aerobic expression ofVitreoscillahemoglobin efficiently reduces overflow metabolism inEscherichia coli.Biotechnol J,2014,9(6): 791–799.

[17]Tyree B,Webster DA. Electron-accepting properties of cytochrome o purified fromVitreoscilla. J Biol Chem,1978,253(21): 7635–7637.

[18]Wang XF,Sun YC,Shen XG,et al. Intracellular expression ofVitreoscillahemoglobin improves production ofYarrowia lipolyticalipase LIP2 in a recombinantPichia pastoris. Enzyme Microb Technol,2012,50(1): 22–28.

[19]Pablos TE,Mora EM,Le Borgne S,et al.Vitreoscillahemoglobin expression in engineeredEscherichia coli: improved performance in high cell-density batch cultivations. Biotechnol J,2011,6(8):993–1002.

[20]Fang W,Yang Y,Zhang XX,et al. Improve ethanol tolerance of β-glucosidase Bgl1A by semi-rational engineering for the hydrolysis of soybean isoflavone glycosides. J Biotechnol,2016,227: 64–71.

[21]Stark BC,Dikshit KL,Pagilla KR. Recent advances in understanding the structure,function,and biotechnological usefulness of the hemoglobin from the bacteriumVitreoscilla. Biotechnol Lett,2011,33(9): 1705–1714.

[22]Khosla C,Curtis JE,DeModena J,et al. Expression of intracellular hemoglobin improves protein synthesis in oxygen-limitedEscherichia coli.Biotechnology,1990,8(9): 849–853.

[23]Khleifat KM,Abboud MM,Al-Mustafa AH,et al.Effects of carbon source andVitreoscillahemoglobin(VHb) on the production of β-galactosidase inEnterobacter aerogenes. Curr Microbiol,2006,53(4): 277–281.

[24]Liu T,Chen JY,Zheng Z,et al. Construction of highly efficientE. coliexpression systems containing low oxygen induced promoter and partition region.Appl Microbiol Biotechnol,2005,68(3): 346–354.

[25]Xu L,Xiong W,Yang JK,et al. RecombinantEscherichiacoliStrains with inducibleCampylobacter jejunisingle domain hemoglobin CHb expression exhibited improved cell growth in bioreactor culture.PLoS ONE,2015,10(3):e0116503.

[26]Kim D,Hwang DS,Kang DG,et al. Enhancement of mussel adhesive protein production inEscherichia coliby co-expression of bacterial hemoglobin.Biotechnol Prog,2008,24(3): 663–666.