馬子玉，任亞輝，凌敏，王華巖

1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院 陜西省干細胞工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌　712100

2 西北農(nóng)林科技大學(xué) 創(chuàng)新實驗學(xué)院，陜西 楊凌　712100

將外源多能轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Klf4、cMyc導(dǎo)入成體細胞，經(jīng)過細胞重編程，能夠獲得一種具有自我更新和多向分化潛能的誘導(dǎo)性多能干細胞 (即iPS細胞)[1]，可以在體內(nèi)外分化為內(nèi)、中、外三個胚層細胞和各種組織、器官[2]。小鼠的iPS建系后，許多大動物的iPS細胞系也相繼獲得[3-5]。本實驗室在豬胚胎成纖維細胞中表達OSKM四因子，并在培養(yǎng)基中添加外源白血病抑制因子 LIF和堿性成纖維細胞生長因子 bFGF，獲得原始態(tài)(na?ve) 樣的豬 iPS細胞，能經(jīng)歷 30代次以上的傳代并保持多能性[6]。然而，豬 iPS細胞的建系仍然進展緩慢，目前未能獲得真正 na?ve狀態(tài)的細胞，缺少穩(wěn)定的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)體系，不能實現(xiàn)生殖系嵌合[7-8]，因此，優(yōu)化體外培養(yǎng)體系、獲得真正na?ve狀態(tài)的豬iPSCs具有十分重要的意義。m6A甲基化作為重要的表觀遺傳修飾方式，對小鼠和人的胚胎干細胞和誘導(dǎo)多能干細胞的干性維持與逆轉(zhuǎn)、細胞重編程以及胚胎發(fā)育等生物學(xué)過程均起著重要的調(diào)節(jié)作用。

m6A修飾是指腺嘌呤第6位N原子上的甲基化修飾，是真核生物mRNA中最常見的轉(zhuǎn)錄后修飾[9]，影響mRNA的剪接、出核轉(zhuǎn)運、翻譯和穩(wěn)定性等[10]。mRNA的m6A修飾由甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體(WTAP/METTL3/METTL14) 催化形成[11-12]，由去甲基化酶ALKBH5和FTO催化去甲基化[13-14]，并被 YTH結(jié)構(gòu)域家族識別[15-16]，結(jié)合蛋白YTHDF2招募CCR4-NOT復(fù)合體降解被m6A修飾的mRNA[17]。METTL3亞基是m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體中的核心組分[18]，定位于核散斑[19]，Mettl3失活使m6A水平降低后促進小鼠 ESC細胞自我更新，并阻礙分化[20]。有報道表明，Mettl3可以作為小鼠 na?ve狀態(tài)的分子開關(guān)，確保多能性因子正確下調(diào)，為細胞分化做準備[21]。m6A甲基轉(zhuǎn)移酶將甲基供體 S-腺苷甲硫氨酸 (SAM) 上的甲基轉(zhuǎn)移到mRNA腺嘌呤的第6位N原子上[22]，環(huán)亮氨酸是 SAM 轉(zhuǎn)移酶的競爭性抑制劑。有研究表明，在培養(yǎng)體系中添加環(huán)亮氨酸可以調(diào)控小鼠成纖維細胞的重編程進程[23]。由此可見，m6A修飾可以影響mRNA的穩(wěn)定性，調(diào)控多能因子的轉(zhuǎn)錄水平，以及調(diào)控小鼠多能干細胞的表觀遺傳狀態(tài)與細胞重編程。因此，我們推測METTL3能夠影響豬多能干細胞中多能因子 mRNA的穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)這些因子的表達水平，從而對豬多能干細胞的多能性產(chǎn)生影響。

我們克隆了豬 m6A甲基化修飾相關(guān)基因METTL3，構(gòu)建了過表達和干擾載體，并通過在豬多能干細胞培養(yǎng)體系中添加甲基化抑制劑環(huán)亮氨酸，研究其對豬多能干細胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變和多能基因的影響，為優(yōu)化豬iPSCs的誘導(dǎo)培養(yǎng)體系提供新的方向和理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

大腸桿菌Stellar感受態(tài)細胞、質(zhì)粒pEGFP-C1、pCDH、pSIH1、人胚腎細胞 (HEK293T)、小鼠胎兒成纖維細胞 (MEF)、豬胎兒成纖維細胞 (PEF)、豬腎上皮細胞 (PK-15)、豬誘導(dǎo)多能干細胞(DOX-iPS、PS11、PS23) 由陜西省干細胞工程技術(shù)研究中心保存。pGEM-T Easy購自Promega公司。豬各組織器官采集于陜西萬盛肉類加工有限公司的屠宰場。

1.2　試劑

基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒、總RNA試劑盒、DNA marker購自天根生化科技 (北京) 有限公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo Fisher Scientific；高保真DNA聚合酶和CCK-8試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；Taq聚合酶購自康為世紀生物科技有限公司；熒光定量 PCR試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；DMEM 購自 Hyclone；Opti-MEM、DPBS、Trypsin、胎牛血清 (FBS) 購自Gibco；瓊脂糖、脂質(zhì)體 (Lipofectamine 2000)、非必需氨基酸 (NEAA)、谷氨酰胺 (GlutaMAX)、β-巰基乙醇 (β-ME)、購自 Invitrogen；SB431542、CHIR99021購自Stem RD；明膠、Doxycycline、DMSO、環(huán)亮氨酸、α-磷酸萘酚鈉、Fast Red TR購自Sigma-Aldrich；多聚甲醛、Tris-HCl購自北京索萊寶科技有限公司；引物由華大基因合成(表1)。

1.3　METT L3基因表達分析

登錄NCBI下載不同物種METTL3氨基酸序列，使用在線軟件phylogeny (http://www.phylogeny.fr/index.cgi) 構(gòu)建METTL3蛋白進化樹。使用Primer Blast設(shè)計引物，通過RT-PCR檢測METTL3在豬的不同器官 (肺、脾、腦、腎等)、不同細胞 (PEF、PK-15) 和不同多能干細胞(DOX-iPS、PS11、PS23) 中的表達情況。使用軟件ImageJ對DNA瓊脂糖電泳結(jié)果進行灰度分析。

1.4　豬METTL3的克隆和載體構(gòu)建

從 PEF細胞中提取總 RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。設(shè)計合成豬METTL3上下游引物，以得到的cDNA為模板克隆METTL3(CDS + polyA)片段，連接pGEM-T Easy載體，送華大基因測序鑒定，并將測序結(jié)果與 NCBI公布的豬METTL3序列進行對比。

用XhoⅠ和Hind Ⅲ將目的基因METTL3和載體pEGFP-C1進行酶切，電泳、回收后將METTL3連接到載體上，獲得過表達載體pEGFP-METTL3；重新設(shè)計帶XbaⅠ和BstbⅠ酶切位點的METTL3上下游引物，以構(gòu)建好的pEGFP-METTL3為模板進行PCR擴增，電泳、回收后重新酶切、連接，構(gòu)建慢病毒載體 pCDH-METTL3。設(shè)計并合成METTL3的shRNA序列 (表1)，用BamH Ⅰ和EcoRⅠ將pSIH1-copGFP、pSIH1-PURO進行酶切、電泳、回收，將退火后的干擾序列連接到載體上，獲得慢病毒干擾載體 pSIH1-copGFP-sh-METTL3和pSIH1-Puro-sh-METTL3。將以上構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，挑取陽性菌落，提取質(zhì)粒，進行酶切鑒定，選取鑒定正確的質(zhì)粒送華大基因測序鑒定。

1.5　細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和感染

HEK293T、PK-15細胞培養(yǎng)在 10% FBS的DMEM 中；MEF、PEF細胞培養(yǎng)在 15% FBS的DMEM中，并添加1% NEAA；DOX-iPS細胞培養(yǎng)在15% FBS的DMEM中，并添加1% NEAA、1%GlutaMAX、0.1 mmol/L β-ME、2 μmol/L SB431542、3 μmol/L CHIR99021、4 μg/mL Doxycycline。稱取不同重量的環(huán)亮氨酸溶解在 DOX-iPS培養(yǎng)基中，配制成不同濃度的環(huán)亮氨酸培養(yǎng)基，用于競爭性抑制豬piPS細胞內(nèi)源METTL3的活性。

進行細胞轉(zhuǎn)染時，將 HEK293T細胞接種于直徑為60 mm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，按照脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染說明書，將構(gòu)建的過表達和干擾載體分別轉(zhuǎn)染HEK293T細胞包裝病毒，48 h后收集上清毒液，經(jīng)0.45 μm濾器過濾后加入濃度為4 μg/mL的polybrene混勻，分別感染DOX-iPS，12 h后換液。重復(fù)感染2次。

表1　引物和干擾片段信息表Table 1　Primers and shRNAs used in this study

1.6　生長曲線測定

MEF feeder細胞接種于 0.1%明膠包被過的48孔板中，過夜培養(yǎng)后，每孔接種 2×103個DOX-iPS細胞，加入含有環(huán)亮氨酸的培養(yǎng)基200 μL，設(shè)置空白組 (未接種 DOX-iPS細胞) 和對照組 (0 mmol/L環(huán)亮氨酸培養(yǎng)基)。每組設(shè)3個重復(fù)。每孔加入 20 μL CCK-8 溶液，37 ℃孵育 1 h，取100 μL上清液轉(zhuǎn)移到96孔板中，測定450 nm各孔吸光值，連續(xù)測定7 d。

1.7　堿性磷酸酶 (AP) 染色

稱取5 mg Fast Red TR和2 mg α-磷酸萘酚鈉鹽，溶解于5 mL的0.1 mol/L Tris-HCl (pH 9.0)中，配制成AP染色液。吸去DOX-iPS細胞培養(yǎng)液，用PBS清洗1遍；加入適量的4%多聚甲醛，常溫固定20 min；吸去固定液，用PBS清洗3遍，加入AP染色液洗1遍，加入AP染色液常溫染色10?20 min，吸去染色液，用PBS清洗3遍之后，置于顯微鏡下進行觀察。

1.8　熒光定量RT-PCR

按照總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，提取 RNA并反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA，設(shè)計METTL3、OCT4、LIN28A、NANOG、β-ACTIN等引物 (表1)，按照熒光定量試劑盒說明書檢測基因的表達水平，并用2–ΔΔCt法計算表達變化倍數(shù)。

1.9　統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用平均值±標準差表示，并經(jīng)過t-test或ANOVA檢驗差異是否具有統(tǒng)計學(xué)意義。*表示P<0.05，**表示P<0.01。

2　結(jié)果與分析

2.1　豬METTL3的表達譜和分子克隆

比對不同物種METTL3蛋白序列，構(gòu)建出分子進化樹，由進化樹可以看出，豬METTL3蛋白與人、鼠的進化距離較遠，與牛、羊的進化距離較近 (圖1A)。通過RT-PCR對豬胃、皮膚、心臟、脂肪、肌肉、小腸、大腸、子宮、肝臟、肺、脾臟、腎臟、腦各組織和器官中的METTL3表達情況進行檢測，并對凝膠電泳結(jié)果進行了灰度分析，結(jié)果表明METTL3在不同組織中廣泛表達 (圖1B)。用RT-PCR檢測了豬體細胞PEF和PK-15、多能干細胞DOX-iPS、PS11和PS23中METTL3的表達情況，結(jié)果表明，METTL3在豬不同細胞中都有表達(圖 1C)。從豬的基因組中克隆獲得 1 859 bp的METTL3基因的編碼序列片段 (圖1D)，構(gòu)建了過表達載體 pEGFP-METTL3，經(jīng)酶切鑒定正確 (圖1E)。將質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染 HEK293T細胞，與對照組EGFP蛋白相比，綠色熒光和DAPI細胞核染色顯示了EGFP-METTL3融合蛋白定位在細胞核中，證明該融合蛋白具備核定位功能特性 (圖1F)。

圖1　豬METTL3表達譜和分子克隆Fig. 1　Porcine METTL3 expression profile and cloning. (A) Phylogenetic tree of METTL3. (B–C) RT-PCR and densitometry analysis of porcine METTL3 expression in different tissues (B) and cells (C). M3: METTL3. GAP:GAPDH. (D) Cloning of porcine METTL3 (1 859 bp). M: DNA marker. (E) Enzyme digestion analysis. 1: uncut pEGEP-METTL3. 2: pEGEP-METTL3 digested with XhoⅠ/Hind Ⅲ. 3: pEGEP-METTL3 digested with BglⅡ/NdeⅠ.(F) Translocalization of EGFP-METTL3 fusion protein in HEK293T cells. Scale bar=50 μm.

2.2　過表達METTL3對多能基因表達的調(diào)控

將pCDH-METTL3過表達載體轉(zhuǎn)染HEK293T細胞包裝病毒，感染多能干細胞 DOX-iPS，設(shè)定感染了空載體pCDH的多能干細胞為對照組。在熒光顯微鏡下觀察到過表達載體pCDH-METTL3成功感染DOX-iPS (圖2A)。與對照組相比，RT-PCR檢測到METTL3在 DOX-iPS中表達量升高 (圖 2B)，經(jīng)qRT-PCR確認METTL3表達升高8.41倍 (圖2C)。顯微鏡觀察結(jié)果顯示，細胞形態(tài)未發(fā)生顯著變化，但是，AP染色結(jié)果顯示，實驗組細胞堿性磷酸酶活性比對照組低 (圖2D)。qRT-PCR結(jié)果顯示，實驗組OCT4和LIN28A的表達水平變化不顯著 (圖2E)。

圖2　過表達METTL3對多能基因表達的調(diào)控Fig. 2　Expression of pluripotent genes in piPS with METTL3 overexpression. (A) Infection of pCDH (Ctrl) and pCDH-METTL3 (OE) in HEK293T and DOX-iPS. RT-PCR (B) and qRT-PCR (C) analysis of METTL3 expression in DOX-iPS. (D) Morphology and AP staining of DOX-iPS. (E) qRT-PCR analysis of pluripotent genes expression in DOX-iPS. **P<0.01; n=3. Scale bar=100 μm.

2.3　干擾METTL3對多能基因表達的調(diào)控

將 pSIH1-copGFP-sh-METTL3干擾載體轉(zhuǎn)染HEK293T細胞包裝病毒，感染PEF細胞，設(shè)定感染了空載體pSIH1-copGFP的細胞為對照組。72 h時后觀察證明有較高的感染效率 (圖 3A)，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，72 h干擾效率達到49%，96 h干擾效率達到了72% (圖3B)。隨后，通過HEK293T細胞將 pSIH1-Puro、pSIH1-Puro-sh-METTL3包裝成病毒，感染DOX-iPS細胞。與感染空載體的對照組相比，RT-PCR結(jié)果顯示METTL3在 DOX-iPS中表達量降低 (圖 3C)，qRT-PCR結(jié)果顯示METTL3干擾效率達到 88%(圖3D)。顯微鏡觀察結(jié)果顯示，干擾METTL3后細胞形態(tài)變得更緊湊、立體，邊緣整齊，其堿性磷酸酶活性明顯高于對照組 (圖 3E)。qRT-PCR檢測干擾METTL3的 DOX-iPS中多能基因的表達，結(jié)果顯示，NANOG、OCT4和LIN28A的表達水平顯著高于對照組 (圖3F)。

圖3　干擾METTL3對多能基因表達的調(diào)控Fig. 3　Knockdown of METTL3 regulates the expression of pluripotent genes in piPS. (A) Infecting of PEF with pSIH1(Ctrl) and shRNA (KD) for 72 h. Scale bar=200 μm. (B) qRT-PCR analysis of METTL3 expression in PEF. (C–D) RT-PCR(C) and qRT-PCR (D) analysis of METTL3 expression in DOX-iPS. (E) Morphology and AP staining of DOX-iPS. Scale bar=100 μm. (F) qRT-PCR analysis of pluripotent genes expression in DOX-iPS. *P<0.05; **P<0.01; n=3.

2.4　添加環(huán)亮氨酸對豬干細胞多能基因表達的調(diào)控

參考甲基化抑制劑環(huán)亮氨酸在小鼠 ES細胞上的用量[23]，分別配制了10 mmol/L和20 mmol/L的環(huán)亮氨酸培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)DOX-iPS細胞，并觀察其在接種后1–4 d的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示，DOX-iPS在20 mmol/L環(huán)亮氨酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細胞克隆形態(tài)松散 (圖 4A)，并且生長速度緩慢(圖 4B)。因此，我們又配制了 2 mmol/L、4 mmol/L、10 mmol/L三個濃度的環(huán)亮氨酸培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)DOX-iPS 24 h和48 h，觀察細胞形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示，24 h和48 h的細胞克隆形態(tài)均未出現(xiàn)明顯改變，其中10 mmol/L實驗組的堿性磷酸酶活性強于其他組 (圖4C)。qRT-PCR檢測48 h處理組的多能基因表達結(jié)果顯示，在10 mmol/L培養(yǎng)基中NANOG、OCT4和LIN28A的表達量顯著升高于其他處理組 (圖 4D)。這一結(jié)果與干擾METTL3的實驗結(jié)果相印證，添加一定濃度(10 mmol/L) 環(huán)亮氨酸，使豬多能干細胞內(nèi)源性多能基因的表達水平顯著提高。

圖4　添加環(huán)亮氨酸對多能基因表達的調(diào)控Fig. 4　Expression of pluripotent genes in piPS treated with cycloleucine. (A) Morphology of DOX-iPS. (B) Growth curve of DOX-iPS. (C) Morphology and AP staining of DOX-iPS. (D) qRT-PCR analysis of pluripotent genes expression in DOX-iPS. **P<0.01,n=3. Scale bar=200 μm.

3　討論

目前，發(fā)現(xiàn)真核生物 mRNA的 m6A修飾是由甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體催化形成的，其中，甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3廣泛分布于各種組織中，與METTL14/WTAP共定位于細胞核中的核散斑，甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3、METTL14和WTAP的表達降低都會導(dǎo)致m6A水平的下降[11-12,24]。

在小鼠 (或人) 的胚胎干細胞中，干擾Mettl3基因后，m6A水平降低，干細胞多能性相關(guān)基因Nanog、Sox2、Myc等的半衰期延長，促進干性維持[20]。Mettl3基因敲除小鼠的胚胎干細胞會始終維持在na?ve階段，na?ve狀態(tài)的多能因子表達水平顯著升高，維持超多能的狀態(tài)，在體外雖然能形成類胚體，但在隨后發(fā)育過程中的分化潛力受到限制[21]。METTL3蛋白在物種之間有很強的保守性，本實驗通過序列比對，也證實了這種保守性。有文獻報道，在豬的細胞中，METTL3和環(huán)亮氨酸引起的m6A水平變化，與在小鼠和人的細胞中是一致的，即過表達METTL3使m6A水平升高，敲低METTL3或者添加環(huán)亮氨酸，使m6A水平下降[25]。本研究中，用構(gòu)建的METTL3過表達載體和干擾載體感染 piPSCs，發(fā)現(xiàn)過表達METTL3后，對細胞形態(tài)和多能基因 (OCT4和LIN28A) 表達無顯著影響，我們推測，可能是由于目前獲得的豬 iPSCs多能基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與小鼠和人有所不同，多能基因的表達水平本身較低[26]。敲低METTL3表達后，出現(xiàn)類似na?ve樣克隆，堿性磷酸酶活性升高，多能基因NANOG、OCT4、LIN28A的表達顯著升高。此結(jié)果表明，降低METTL3表達有助于維持piPSCs細胞的多能性狀態(tài)。

環(huán)亮氨酸是 SAM 轉(zhuǎn)移酶的競爭性抑制劑，豬脂肪細胞經(jīng)環(huán)亮氨酸處理后顯著降低mRNA的m6A甲基化水平，從而顯著提高了成脂分化相關(guān)基因和脂肪酸從頭合成相關(guān)基因的表達[27]。環(huán)亮氨酸還能通過降低m6A水平調(diào)控小鼠成纖維細胞的重編程過程[23]。本實驗中，piPSCs在10 mmol/L環(huán)亮氨酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，堿性磷酸酶活性升高，多能基因NANOG、OCT4和LIN28A的表達顯著升高。此結(jié)果表明，環(huán)亮氨酸可以作為輔助成分添加到培養(yǎng)基中，促進和維持piPSCs細胞的多能性狀態(tài)。

為研究METTL3對豬干細胞中重要多能基因表達的影響，我們建立了一套表達調(diào)控檢測體系。首先，克隆了豬METTL3編碼區(qū)序列，設(shè)計合成了METTL3干擾片段；將上述序列和片段構(gòu)建相應(yīng)的慢病毒過表達載體和干擾載體，并通過PCR鑒定和測序進行確認；利用 HEK293T細胞制備慢病毒顆粒，并感染多能干細胞；最后，通過過表達和敲低METTL3，觀察其對多能基因表達和干細胞多能狀態(tài)的影響。本研究建立的這一體系為進一步探索METTL3及m6A甲基化對豬多能干細胞的調(diào)控作用提供了基礎(chǔ)研究手段。

綜上所述，本研究表明降低METTL3表達或添加環(huán)亮氨酸能夠顯著提高豬干細胞內(nèi)源性多能基因的表達水平，為優(yōu)化豬多能干細胞培養(yǎng)體系提供了新的方向和實驗依據(jù)，為進一步研究m6A修飾對表觀遺傳狀態(tài)的影響建立了基礎(chǔ)。

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