劉露露，徐溢，王人杰，崔飛云，劉海濤，陳李

1 重慶大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，重慶 400030

2 重慶大學(xué) 新型微納器件與系統(tǒng)技術(shù)重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，重慶 400030

3 重慶大學(xué) 光電技術(shù)與系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400044

4 重慶大學(xué) 微納系統(tǒng)與新材料國(guó)際聯(lián)合研發(fā)中心，重慶 400030

5 重慶大學(xué) 光電工程學(xué)院，重慶 400044

生物被膜是為適應(yīng)環(huán)境而在有生命或無生命的物體表面形成的有組織的微生物群落[1]。生物被膜可謂是細(xì)菌的天然保護(hù)屏障，為細(xì)菌提供了相對(duì)穩(wěn)定的生存環(huán)境[2]。生物被膜在自然界中廣泛存在[3]，對(duì)人類生產(chǎn)生活的各個(gè)方面都有重要影響。據(jù)統(tǒng)計(jì)，65%的醫(yī)源性感染與生物被膜相關(guān)[4]，生物被膜內(nèi)細(xì)菌的耐藥性是醫(yī)療行業(yè)所面臨的重大難題之一。此外，生物被膜會(huì)引發(fā)水污染影響飲用水質(zhì)[5]，導(dǎo)致食品污染[6]。

生物被膜的形成不是一蹴而就的，是一個(gè)細(xì)菌粘附到基質(zhì)表面，并不斷增殖分裂形成微菌落直至生物被膜發(fā)展成熟，最后生物被膜破裂細(xì)菌重新定植的多階段動(dòng)態(tài)過程[7]。生物被膜的形成既受外界環(huán)境的影響，又受細(xì)菌內(nèi)部基因的調(diào)控，群感效應(yīng)作為細(xì)菌進(jìn)行信息傳遞的重要機(jī)制，它在生物被膜的形成中起到了重要的調(diào)節(jié)作用[8]。

生物被膜是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，而生物被膜的檢測(cè)技術(shù)對(duì)于增進(jìn)人類對(duì)生物被膜的認(rèn)識(shí)及解決生物被膜帶來的難題是必不可少的。本文首先從生物被膜的特點(diǎn)、形成過程及群感效應(yīng)對(duì)生物被膜的調(diào)控作用等背景出發(fā)，在介紹目前常用的幾種生物被膜檢測(cè)方法基礎(chǔ)之上，重點(diǎn)綜述了電化學(xué)阻抗技術(shù)以及基于微流控芯片的電化學(xué)阻抗技術(shù)在生物被膜檢測(cè)及研究中的應(yīng)用和進(jìn)展。

1　生物被膜的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及形成過程

1.1　生物被膜的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

過去人們常認(rèn)為細(xì)菌傾向以游離的狀態(tài)存在，是以單細(xì)胞的方式生存，直到17世紀(jì)，Van Leeuwenhoek發(fā)現(xiàn)固著在牙齒上的細(xì)菌是以細(xì)菌群落的形式存在的，生物被膜的理論才逐漸被人們所認(rèn)可[9]。生物被膜研究之父Costerton將生物被膜定義為由粘附在有生命或無生命表面上并包裹在自分泌的胞外聚合物的細(xì)菌組成的微生物群落[4]。生物被膜廣泛存在于自然界中，其更傾向于形成在潮濕的物體表面，如食品加工設(shè)備、醫(yī)療器械等[10]。生物被膜可有效地保護(hù)其中的細(xì)菌，使得膜內(nèi)細(xì)菌具有更強(qiáng)地抵御過酸過堿、高溫、高滲透壓等不利生存環(huán)境的能力和更強(qiáng)的耐藥性，有利于細(xì)菌更好地適應(yīng)周圍環(huán)境[11-12]。

生物被膜由粘附在物體表面的細(xì)菌及胞外基質(zhì)組成。胞外基質(zhì)主要指的是胞外聚合物 (EPS)，它是生物被膜的主要化學(xué)成分，胞外基質(zhì)也包含蛋白質(zhì)、DNA等物質(zhì)[13]。例如，銅綠假單胞菌生物被膜胞外多糖主要是 Pel、Psl和海藻酸鹽，eDNA也是銅綠假單胞菌生物被膜的重要組成成分，其作用是維持生物被膜的穩(wěn)定性[14]。生物被膜不是細(xì)菌及胞外聚合物 (EPS) 的簡(jiǎn)單聚合，而具有復(fù)雜的架構(gòu)。例如，銅綠假單胞菌及枯草芽孢桿菌生物被膜中點(diǎn)綴有開放的水通道，這些水通道有利于生物被膜中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及代謝廢物的交換[15]。

1.2　生物被膜的形成過程

圖1　生物被膜形成過程示意圖[7]Fig. 1　Stages of biofilms development[7].

生物被膜的形成是個(gè)動(dòng)態(tài)而復(fù)雜的過程。這一過程可劃分為幾個(gè)主要的階段：可逆粘附期、不可逆粘附期、微菌落的形成、生物被膜成熟期以及散播期[16-17](圖1)。在可逆粘附期，細(xì)菌通過鞭毛或菌毛可逆地粘附到物體表面，在這一時(shí)期細(xì)菌可以脫離表面重新回到浮游狀態(tài)；之后細(xì)菌表面蛋白和胞外聚合物 (EPS) 協(xié)助細(xì)菌粘附到固體表面，可逆粘附轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢赡嬲掣絒18]，粘附期是生物被膜形成的關(guān)鍵時(shí)期，它是細(xì)菌由浮游狀態(tài)到生物被膜形成的轉(zhuǎn)折點(diǎn)；隨后粘附的細(xì)菌不斷增殖分裂，胞外聚合物 (EPS) 逐漸增多，形成微菌落直到形成成熟的生物被膜，在成熟的生物被膜中胞外聚合物 (EPS) 占生物被膜干重的90%，胞外聚合物 (EPS) 把生物被膜中的細(xì)菌粘附在一起，維持著生物被膜的三維結(jié)構(gòu)，使得膜內(nèi)細(xì)菌具有更強(qiáng)的耐藥性，以及抵御不良環(huán)境的能力，如增強(qiáng)生物被膜內(nèi)細(xì)菌對(duì)環(huán)境中有害金屬離子的抗干擾能力[19-20]，同時(shí)胞外聚合物 (EPS)可積累群感效應(yīng)信號(hào)分子、胞外酶、細(xì)菌次級(jí)代謝產(chǎn)物，為細(xì)菌提供了信息交流的場(chǎng)所[21]；最后，生物被膜內(nèi)細(xì)菌從成熟的膜中逃離，成為浮游菌，重新定植到新的表面，到達(dá)散播期，散播期不僅是上一個(gè)生物被膜形成周期的結(jié)束，而且是下一個(gè)生物被膜周期的開始[22]。有趣的是，研究發(fā)現(xiàn)生物被膜的結(jié)構(gòu)隨外界環(huán)境的改變而改變，如銅綠假單胞菌在氧氣充足的條件下形成的生物被膜呈“蘑菇狀”，而在無氧條件下可形成三維“網(wǎng)狀”結(jié)構(gòu)的生物被膜[23]。

2　細(xì)菌群感效應(yīng)與生物被膜

1979年，Nealson等[24]在研究費(fèi)氏弧菌生物發(fā)光現(xiàn)象時(shí)，首次提出了群感效應(yīng)。群感效應(yīng)又稱細(xì)菌密度依賴型基因表達(dá)調(diào)控，它是細(xì)菌進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要機(jī)制。群感效應(yīng)信號(hào)分子又稱自誘導(dǎo)物，是細(xì)菌群感效應(yīng)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子，細(xì)菌具有產(chǎn)生、分泌、感知信號(hào)分子的能力，隨著細(xì)菌數(shù)量的不斷增加，信號(hào)分子的濃度逐漸增大，一旦外界環(huán)境中信號(hào)分子的濃度達(dá)到一定閾值時(shí)，細(xì)菌便啟動(dòng)其群感效應(yīng)系統(tǒng)從而調(diào)控下游相關(guān)基因的表達(dá)[25-26]。不同種類的細(xì)菌具有不同類型的群感效應(yīng)系統(tǒng)及信號(hào)分子。根據(jù)信號(hào)分子的結(jié)構(gòu)差異，主要將其分為三大類，即革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的高絲氨酸內(nèi)酯類信號(hào)分子 (AHLs)、革蘭氏陽(yáng)性菌產(chǎn)生的多肽類信號(hào)分子 (AIP)、部分革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌均會(huì)產(chǎn)生的呋喃酮二酯類信號(hào)分子 (AI-2)。其中高絲氨酸內(nèi)酯類信號(hào)分子 (AHLs) 用于革蘭氏陰性菌之間的信息傳遞，多肽類信號(hào)分子 (AIP) 用于革蘭氏陽(yáng)性菌之間的信息傳遞，而呋喃酮二酯類信號(hào)分子(AI-2) 是一種可用于革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽(yáng)性菌種間信息交流的群感效應(yīng)信號(hào)分子[27-28]。近年來，隨著人類對(duì)細(xì)菌群感效應(yīng)現(xiàn)象的不斷探索與深入研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的多種生物學(xué)過程都受到群感效應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，如細(xì)菌的生物發(fā)光、細(xì)菌次級(jí)代謝物的合成、病原菌毒力因子的分泌、孢子的形成、細(xì)菌群游現(xiàn)象、免疫逃逸、細(xì)菌抗藥性的產(chǎn)生以及生物被膜的形成等[29-30]。

細(xì)菌生存的外部環(huán)境因素，以及包含群感效應(yīng)系統(tǒng)、環(huán)二鳥苷酸 (c-di-GMP) 等在內(nèi)的細(xì)菌內(nèi)部調(diào)控系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)著生物被膜的形成。細(xì)菌會(huì)隨氧氣的濃度、溫度、培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)狀況、細(xì)菌代謝物以及細(xì)菌粘附的界面性質(zhì)等外部環(huán)境因素的改變而調(diào)節(jié)其形成的生物被膜結(jié)構(gòu)，從而更好地適應(yīng)周圍環(huán)境[7]。環(huán)二鳥苷酸 (c-di-GMP) 參與調(diào)控生物被膜形成的可逆粘附期、成熟期、散播期，決定著細(xì)菌是否會(huì)以生物被膜的方式生存[8]。細(xì)菌群感效應(yīng)也與生物被膜的形成密切相關(guān)[31]，在生物被膜形成過程中，可逆粘附期由于細(xì)菌在培養(yǎng)基中自由游動(dòng)，不適于群感效應(yīng)信號(hào)分子的累積，當(dāng)附著的細(xì)菌分裂形成微菌落時(shí)，細(xì)菌密度增加，群感效應(yīng)信號(hào)分子可逐漸達(dá)到足夠的水平，從而開始調(diào)節(jié)生物被膜的成熟和分解，因此，群感效應(yīng)主要在生物被膜的成熟期和散播期發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[32]。不同的細(xì)菌調(diào)節(jié)生物被膜形成的機(jī)制有差異，根據(jù)細(xì)菌各自產(chǎn)生群感效應(yīng)信號(hào)分子的類別主要可將其分為3類：以銅綠假單胞菌為代表的革蘭氏陰性菌，此類細(xì)菌產(chǎn)生的群感效應(yīng)信號(hào)分子為高絲氨酸內(nèi)酯類信號(hào)分子 (AHLs)，銅綠假單胞菌通過群感效應(yīng)信號(hào)分子調(diào)控鼠李糖脂的合成以及eDNA的分泌，鼠李糖脂在銅綠假單胞菌生物被膜形成后期發(fā)揮重要的作用，維持“蘑菇云”形狀生物被膜內(nèi)水通道的穩(wěn)定性[33]，eDNA可使銅綠假單胞菌生物被膜自我分解[34]；以金黃色葡萄球菌為代表的革蘭氏陽(yáng)性菌，這類細(xì)菌產(chǎn)生的群感效應(yīng)信號(hào)分子為多肽 (AIP)，金黃色葡萄球菌的群感效應(yīng)系統(tǒng)可促進(jìn)其蛋白酶和多肽酶的表達(dá)，加快生物被膜的分解[35]；沙門氏菌、大腸桿菌等細(xì)菌利用呋喃酮二酯類信號(hào)分子 (AI-2) 去參與調(diào)控生物被膜的形成，該類信號(hào)分子對(duì)細(xì)菌共生生物被膜的形成至關(guān)重要[36]，有文獻(xiàn)報(bào)道野生型的鏈霉菌與放線菌可以形成致密的生物被膜，LuxS突變鏈霉菌與放線菌不能形成致密的生物被膜，當(dāng)加入外源呋喃酮二酯類信號(hào)分子 (AI-2) 后恢復(fù)了鏈霉菌形成共生生物被膜的能力[37]。

近年來，抗生素的濫用使得細(xì)菌耐藥性問題日益嚴(yán)重，目前急需尋找抵制細(xì)菌感染的新型藥物[38]。研究表明，細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生與生物被膜的形成密切相關(guān)[39]，闡明群感效應(yīng)與細(xì)菌生物被膜形成之間的內(nèi)在聯(lián)系，對(duì)開發(fā)以抑制群感效應(yīng)為靶點(diǎn)的新型生物被膜抑制劑具有重要意義。而尋找抑制生物被膜的有效方法離不開生物被膜的分析檢測(cè)技術(shù)，它使觀測(cè)生物被膜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)及分析生物被膜內(nèi)細(xì)菌的生理狀態(tài)成為可能，而實(shí)現(xiàn)生物被膜動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)持續(xù)監(jiān)測(cè)及對(duì)生物被膜生理狀態(tài)進(jìn)行實(shí)時(shí)分析，則對(duì)細(xì)菌檢測(cè)方法和技術(shù)提出了新的需求和更高的要求。

3　生物被膜常見檢測(cè)方法

顯微成像技術(shù)、生物化學(xué)及分子生物學(xué)領(lǐng)域相關(guān)技術(shù)的發(fā)展加深了人類對(duì)生物被膜的認(rèn)識(shí)。目前，生物被膜檢測(cè)方法大致可分為化學(xué)法、顯微觀察法、生物法[40]。表1對(duì)生物被膜常用檢測(cè)方法的特點(diǎn)進(jìn)行了總結(jié)。

化學(xué)法主要是利用能與生物被膜結(jié)合的化學(xué)試劑進(jìn)行測(cè)定，可實(shí)現(xiàn)對(duì)生物被膜組分如胞外聚合物 (EPS) 的間接檢測(cè)。例如，微孔板結(jié)晶紫染色法可實(shí)現(xiàn)對(duì)生物被膜的定量檢測(cè)，不論是死菌、活菌、還是生物被膜基質(zhì)都會(huì)被結(jié)晶紫染色，是評(píng)估生物被膜總生物量的有效方法[41]。此方法的主要優(yōu)點(diǎn)是適用范圍廣，同一微孔板上可同時(shí)測(cè)定多組樣本，但操作步驟繁瑣、染色劑濃度、染色時(shí)間等因素都會(huì)對(duì)測(cè)試結(jié)果造成一定程度的影響，導(dǎo)致該方法重現(xiàn)性較差[42-43]。另外結(jié)晶紫是通用染色劑，不具有特異性，無法對(duì)細(xì)菌種類進(jìn)行區(qū)分[44]。微孔板結(jié)晶紫染色法還可用于初步評(píng)價(jià)抗菌劑對(duì)生物被膜的清除效果[45]。刃天青是一種穩(wěn)定的氧化還原指示劑，活細(xì)胞中的線粒體酶可將藍(lán)色的刃天青還原為紅色的異酚惡唑酮[46]，同時(shí)其熒光性質(zhì)也會(huì)發(fā)生變化，但死細(xì)胞卻不能還原刃天青，因此刃天青染色法可用于評(píng)估生物被膜內(nèi)細(xì)菌的活性[47]。刃天青水溶性好，對(duì)細(xì)菌細(xì)胞無毒，不影響細(xì)菌的正常代謝和基因表達(dá)，但此法檢測(cè)限較高，且不同的細(xì)菌還原刃天青的速率不同，該方法不適用于檢測(cè)混菌樣本[48]。

表1　生物被膜檢測(cè)方法及其特色和用途Table 1　Methods of biofilms detection and its characteristics and application

顯微觀察法是利用激光共聚焦顯微鏡(CLSM)、電子顯微鏡 (EM)、原子力學(xué)顯微鏡(AFM) 等先進(jìn)的儀器設(shè)備對(duì)生物被膜組成和內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化的觀測(cè)方法。激光共聚焦顯微鏡 (CLSM) 可消除遠(yuǎn)離焦點(diǎn)的熒光信號(hào)，在焦平面上可達(dá)到單細(xì)胞水平的分辨率，通過專用的圖像分析軟件將從樣本不同深度焦平面上獲得的熒光信號(hào)進(jìn)行整合分析，從而獲得樣本信息的三維結(jié)構(gòu)[49]，其可用于研究生物被膜的空間結(jié)構(gòu)，提取生物被膜的厚度、粗糙程度、生物量等結(jié)構(gòu)參數(shù)[50]。激光共聚焦顯微鏡 (CLSM) 對(duì)生物被膜可視化觀測(cè)需結(jié)合各種熒光探針，如SYTO9和PI兩種熒光探針聯(lián)用可用于評(píng)價(jià)生物被膜內(nèi)細(xì)菌的死活情況[51]，其中 SYTO9能夠穿透所有細(xì)菌的細(xì)胞膜使細(xì)菌細(xì)胞染為綠色，而PI只能穿透受損細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞膜使細(xì)菌細(xì)胞染為紅色，因此，可利用激光共聚焦顯微鏡 (CLSM) 觀察染色后生物被膜內(nèi)細(xì)菌的顏色差異區(qū)別出死菌和活菌[52-53]。而 ConA-FITC及PI兩種熒光試劑聯(lián)用可用于分析生物被膜內(nèi)胞外聚合物 (EPS) 及細(xì)菌細(xì)胞的分布情況，其中ConA-FITC可標(biāo)記生物被膜內(nèi)的胞外聚合物(EPS)，PI可標(biāo)記生物被膜內(nèi)的細(xì)菌細(xì)胞[54-55]。除了激光共聚焦顯微鏡 (CLSM)外，掃描電子顯微鏡 (SEM) 也可用于生物被膜的可視化觀測(cè)。掃描電子顯微鏡 (SEM) 可探測(cè)生物被膜的空間結(jié)構(gòu)及胞外聚合物 (EPS) 的存在，廣泛應(yīng)用于生物被膜研究中[56]，還可評(píng)估抗菌劑對(duì)生物被膜形成的抑制效果[57]。SEM具有分辨率高、放大范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，但是進(jìn)行 SEM 觀測(cè)之前需要對(duì)生物被膜樣品進(jìn)行處理，包括固定、脫水、干燥以及噴金，制備過程可能破壞生物被膜的結(jié)構(gòu)[58]。原子力學(xué)顯微鏡 (ATM) 是在納米及微米尺度對(duì)生物樣品進(jìn)行無損可視化觀測(cè)的新興技術(shù)，可對(duì)生物被膜進(jìn)行可視化觀測(cè)及獲得生物被膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息[59-60]。

平板計(jì)數(shù)法及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 是生物被膜檢測(cè)主要采用的生物法。平板計(jì)數(shù)法可計(jì)算生物被膜樣本中細(xì)菌濃度，該方法簡(jiǎn)單易行，但耗時(shí)長(zhǎng)[61]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 是廣泛應(yīng)用的基因?qū)W方法，可用于檢測(cè)生物被膜內(nèi)細(xì)菌的基因序列及用于生物被膜內(nèi)細(xì)菌的定量檢測(cè)[62]。

上文述及的生物被膜檢測(cè)方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。但是，這些檢測(cè)方法存在一些共同的缺點(diǎn)，即只能對(duì)某個(gè)時(shí)刻形成的生物被膜進(jìn)行檢測(cè)及表征，未能對(duì)生物被膜形成過程進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)。另一方面，化學(xué)法及顯微觀察法在對(duì)生物被膜樣本檢測(cè)之前需要對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理，如標(biāo)記各種熒光試劑、利用染色劑對(duì)生物被膜進(jìn)行染色等。預(yù)處理過程在一定程度上會(huì)破壞生物被膜本身結(jié)構(gòu)，可能會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果與生物被膜的真實(shí)狀態(tài)有一定差距。從生物被膜顯微圖像上分析生物被膜結(jié)構(gòu)信息的觀察法需要借助經(jīng)驗(yàn)，具有一定的主觀性，很難客觀地對(duì)生物被膜進(jìn)行量化分析。因此，目前急需發(fā)展研究生物被膜形成過程的持續(xù)、無損、免標(biāo)記檢測(cè)方法，這將有助于加深人類對(duì)生物被膜形成的認(rèn)識(shí)，從而為尋找清除生物被膜的有效策略奠定基礎(chǔ)。

4　生物被膜的電化學(xué)阻抗檢測(cè)

4.1　生物被膜電化學(xué)阻抗檢測(cè)現(xiàn)狀

電化學(xué)阻抗是以小振幅的正弦波電勢(shì)或電流為擾動(dòng)信號(hào)，使電極系統(tǒng)產(chǎn)生近似線性的關(guān)系響應(yīng)，測(cè)量電極系統(tǒng)在很寬頻率范圍內(nèi)的阻抗譜，從而研究電極過程動(dòng)力學(xué)信息和電極界面結(jié)構(gòu)信息的方法，在材料、金屬腐蝕、電池性能研究等諸多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。電化學(xué)阻抗法所施加擾動(dòng)信號(hào)很小，避免對(duì)體系產(chǎn)生較大影響，可實(shí)現(xiàn)無損檢測(cè)。此外，電化學(xué)阻抗法無需樣品標(biāo)記，還可進(jìn)行原位實(shí)時(shí)分析[63]。生物被膜的形成不是一蹴而就的，而是個(gè)多階段的動(dòng)態(tài)過程，處于不同生長(zhǎng)時(shí)期的生物被膜，不僅在結(jié)構(gòu)上存在差異，而且膜內(nèi)細(xì)菌的代謝狀況也會(huì)有所差別。與生物被膜常規(guī)檢測(cè)方法相較，電化學(xué)阻抗無疑是檢測(cè)生物被膜動(dòng)態(tài)形成過程的選擇之一。同時(shí)，電化學(xué)阻抗在很寬的頻率范圍研究待測(cè)體系的信號(hào)響應(yīng)，可獲得更多電極表面粘附的生物被膜生長(zhǎng)發(fā)展過程的相關(guān)信息[64-65]。

等效電路模型的構(gòu)建是采用電化學(xué)阻抗法檢測(cè)生物被膜的關(guān)鍵，等效電路模型中生物被膜相關(guān)電阻及電容元件參數(shù)值的變化情況與生物被膜生長(zhǎng)狀態(tài)密切相關(guān)。生物被膜主要由細(xì)菌菌體及包裹在細(xì)菌外的胞外聚合物 (EPS) 組成，理想條件下可將生物被膜中的細(xì)菌看作是電容元件，而生物被膜中的胞外聚合物 (EPS) 看作是電阻元件，一旦細(xì)菌成功地粘附到電極表面并逐漸形成生物被膜后，會(huì)引起電極-溶液界面信息的改變，從而通過等效電路模型對(duì)電極表面粘附的生物被膜進(jìn)行分析[66-67]。在生物被膜電化學(xué)阻抗檢測(cè)中，電極表面粘附的生物被膜和細(xì)菌細(xì)胞的生長(zhǎng)變化是影響待測(cè)電極體系雙層電容及電阻改變的主要原因。此外，粘附在電極表面的蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)也會(huì)在一定程度上改變待測(cè)電極體系的雙層電容。細(xì)菌可能產(chǎn)生的具有電活性的次級(jí)代謝物、培養(yǎng)液中游離細(xì)菌的濃度變化、培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗等則是影響待測(cè)電極體系溶液電阻改變的重要因素 (圖2)。

圖2　生物被膜引起阻抗改變的因素Fig. 2　Scheme of the impedance response factors caused by microorganisms.

在采用電化學(xué)阻抗法檢測(cè)生物被膜形成過程中，電極表面粗糙程度、材質(zhì)等因素會(huì)影響細(xì)菌在電極表面處的粘附及生物被膜的形成[68]。近年來，人們利用電化學(xué)阻抗研究了各種電極表面處形成的生物被膜。例如，Kim等[69]將金電極插入含有銅綠假單胞菌 PA14培養(yǎng)液的電解池中進(jìn)行孵育，使該細(xì)菌粘附到金電極表面進(jìn)而形成生物被膜，為了消除細(xì)菌本身代謝物對(duì)阻抗信號(hào)的影響，又將粘附有生物被膜的金電極插入到新鮮配制的培養(yǎng)液中，進(jìn)行電化學(xué)阻抗測(cè)試，并采用等效電路模型對(duì)不同孵育時(shí)間獲得的阻抗值進(jìn)行擬合，發(fā)現(xiàn)金電極表面生物被膜的粘附會(huì)導(dǎo)致雙層電容值減少。Ward等[70]使用低成本的絲網(wǎng)印刷碳電極，利用電化學(xué)阻抗法分別對(duì)銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌以及這兩種細(xì)菌形成的生物被膜進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)3 d的持續(xù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在生物被膜生長(zhǎng)過程的不同時(shí)刻得到的阻抗信號(hào)存在差異，還發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌產(chǎn)生的綠膿菌素是造成阻抗信號(hào)差異的可能原因之一。

相比金電極、絲網(wǎng)印刷碳電極等傳統(tǒng)電極，叉指微電極具有阻抗降低、可快速建立穩(wěn)態(tài)信號(hào)、信噪比高、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，并可在有限的空間里提供相對(duì)較大的電極檢測(cè)面積[71-72]。因此，將叉指微電極應(yīng)用于生物被膜的阻抗檢測(cè)中，檢測(cè)靈敏度可得到一定程度的提高。如Kim等[73]利用叉指微電極對(duì)銅綠假單胞菌 PAO1生物被膜形成過程的早期粘附期進(jìn)行了阻抗測(cè)試，發(fā)現(xiàn)早期細(xì)菌的粘附會(huì)導(dǎo)致雙層電容減少，通過等效電路模型計(jì)算得出細(xì)菌粘附1 h后，雙層電容值下降近15%，證實(shí)了雙層電容可作為檢測(cè)早期生物被膜粘附的關(guān)鍵參數(shù)。

綜上，電化學(xué)阻抗法檢測(cè)生物被膜無需標(biāo)記，且較小的擾動(dòng)電壓在檢測(cè)過程中不會(huì)影響生物被膜內(nèi)細(xì)菌的代謝和生長(zhǎng)，可實(shí)現(xiàn)生物被膜的原位在線無損檢測(cè)。在生物被膜原位連續(xù)阻抗監(jiān)測(cè)中，為了保證生物被膜生長(zhǎng)過程中所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，電解液通常都是未添加氧化還原探針的培養(yǎng)基，電極界面處生物被膜的發(fā)展變化主要引起的是體系雙層電容等參數(shù)的改變。

4.2　微流控芯片應(yīng)用于電化學(xué)阻抗生物被膜檢測(cè)新進(jìn)展

微流控芯片可集成不同的生化功能單元及實(shí)現(xiàn)高靈敏度、高通量檢測(cè)[74]，具有樣品需求量小、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)，提供比常規(guī)體系更加穩(wěn)定的微環(huán)境[75-76]，其用于生物被膜的檢測(cè)具有很大優(yōu)勢(shì)。將細(xì)菌引入到微流控芯片的微通道中，在微流控芯片電極檢測(cè)區(qū)形成生物被膜，可對(duì)其進(jìn)行原位阻抗檢測(cè)。此外，微流控芯片允許在人為可控的條件下研究生物被膜的生長(zhǎng)情況，為生物被膜研究及在線監(jiān)測(cè)提供了良好的平臺(tái)。在此，我們?cè)敿?xì)介紹了近幾年來文獻(xiàn)報(bào)道的利用電化學(xué)阻抗檢測(cè)生物被膜的微流控芯片。

Ben-Yoav等[77]設(shè)計(jì)了由2個(gè)上下平行放置的氧化銦錫涂層電極 (ITO) 組裝而成的微流控芯片裝置，利用多聚物加工出橢圓形電解槽，在電解槽的底部和頂部分別留有矩形凹槽便于放置氧化銦錫涂層電極，分別在電解槽兩側(cè)打孔，便于向電解槽注入細(xì)菌培養(yǎng)液以及排除廢液。將大腸桿菌菌液通入到該芯片中，完成細(xì)菌在氧化銦錫涂層電極上的粘附和形成生物被膜，再插入Ag/AgCl電極作為參比電極，與上下2個(gè)平行放置的氧化銦錫涂層電極構(gòu)成三電極體系進(jìn)行阻抗測(cè)試，利用等效電路模型分析了由大腸桿菌粘附及其生物被膜生長(zhǎng)引起的電容和電阻的變化情況，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)0–23 h電容值升高而電阻值下降，之后電容值下降而電阻值升高，電容及電阻值的變化情況與大腸桿菌生物被膜的生長(zhǎng)發(fā)展過程密切相關(guān) (圖3C)。

Zheng等[78]采用光刻技術(shù)在聚乙烯對(duì)苯二酸酯 (PET) 基質(zhì)上先后蒸發(fā)濺射一層鉻層和金層，制作出3個(gè)不同尺寸的金參比電極和5個(gè)不同尺寸的金工作電極，可通過改變工作電極和參比電極的尺寸大小和兩者之間的距離，對(duì)電化學(xué)阻抗測(cè)試操作條件進(jìn)行優(yōu)化；之后將生物相容性良好、穩(wěn)定性良好的聚吡咯 (ppy) 修飾到金電極表面，增強(qiáng)金電極對(duì)生物被膜粘附能力。將聚碳酸酯電化學(xué)流動(dòng)池和包含電極的基質(zhì)材料進(jìn)行組裝，實(shí)現(xiàn)外部培養(yǎng)基及菌液的注入，對(duì)銅綠假單胞菌的生物被膜進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)232 h的原位阻抗信號(hào)監(jiān)測(cè)，用等效電路模型進(jìn)行擬合計(jì)算，發(fā)現(xiàn)修飾聚吡咯的金電極與未修飾的金電極相比，對(duì)等效電路中的電荷轉(zhuǎn)移阻抗Rct具有更高的靈敏度 (圖3A)。

Pires等[79]設(shè)計(jì)了基于金電極陣列的多通道微流控芯片，該芯片由1條上游參比通道和1條下游測(cè)量通道構(gòu)成，測(cè)量通道中4個(gè)相同的金工作電極可同時(shí)監(jiān)測(cè)銅綠假單胞菌生物被膜的發(fā)展變化引起的阻抗信號(hào)，這既可減少因局部環(huán)境不同造成的實(shí)驗(yàn)誤差，又可實(shí)現(xiàn)多通道的并行檢測(cè)。他們利用此芯片對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜進(jìn)行了原位實(shí)時(shí)阻抗監(jiān)測(cè)，并通過測(cè)試通道內(nèi)電流隨著培養(yǎng)時(shí)間的變化情況評(píng)估生物被膜內(nèi)細(xì)菌的生活狀態(tài)。此外，還評(píng)價(jià)了殺菌劑疊氮化鈉的殺菌效果及對(duì)生物被膜的清除效果，由阻抗測(cè)試和電流測(cè)試結(jié)果，得出疊氮化鈉有一定的殺菌效果，但不能完全瓦解已形成的生物被膜 (圖3B)。

近年來，在微流控芯片微通道里利用叉指微電極開展了基于電化學(xué)阻抗檢測(cè)生物被膜的生長(zhǎng)情況。Settu等[80]采用微機(jī)電加工技術(shù)將4個(gè)相同的叉指微電極集成到玻璃基片上，再使用硅橡膠粘合劑將聚苯乙烯腔體整合到基片上部，實(shí)現(xiàn)外部培養(yǎng)液及菌液的引入，對(duì)含大腸桿菌尿液樣本進(jìn)行了12 h的監(jiān)測(cè)，利用等效電路模型分析了隨細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)所導(dǎo)致的阻抗信號(hào)的變化情況，發(fā)現(xiàn)Cdl隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)顯示出減少趨勢(shì)，大腸桿菌的粘附及其生物被膜的形成是造成其變化的主要原因 (圖3D)。Estrada-Leypon等[81]設(shè)計(jì)了用于金黃色葡萄球菌生物被膜原位實(shí)時(shí)檢測(cè)的微流控電化學(xué)阻抗芯片，該芯片基片包含兩種叉指微電極、參比電極、對(duì)電極以及測(cè)試 K+、Na+的PE電極，芯片蓋片由聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 材料制作，其中兩種叉指微電極用于金黃色葡萄球菌生物被膜的阻抗測(cè)試。他們利用有限元法對(duì)矩形叉指電極的幾何尺寸進(jìn)行了優(yōu)化，并將優(yōu)化后的矩形叉指微電極與圓形叉指微電極獲得的生物被膜阻抗信號(hào)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)矩形叉指微電極的檢測(cè)靈敏度得到了提高，并將顯微觀測(cè)技術(shù)與阻抗技術(shù)相結(jié)合，同時(shí)觀測(cè)和檢測(cè)金黃色葡萄球菌生物被膜的生長(zhǎng)情況 (圖3F)。

圖3　微流控芯片電化學(xué)阻抗檢測(cè)生物被膜實(shí)例Fig. 3　Examples of the microfluidic chips applied for biofilms detection based on electrochemical impedance spectroscopy. (A) Microfluidic impedance chip for Pseudomonas aeruginosa biofilms detection based on gold electrodes deposited polypyrrole and a modified Randles circuit with an additional adsorption CPE and coating CPE to analysis impedance spectroscopy of Pseudomonas aeruginosa biofilms. (B) Photograph of a cyclic olefin copolymer substrate with gold electrodes and contact pins for impedance detection of Pseudomonas aeruginosa biofilms. (C)Microfluidic impedance chip for E. coli biofilms detection based on indium-tin-oxide-coated electrodes and equivalent electrical circuit which described the electrochemical interactions between the biomaterial and the conducting surface.(D) Microfluidic impedance chip containing four interdigital microelectrodes for E. coli detection in urine samples and equivalent electrical circuit for impedance analysis. (E) Schematic layout of the microfluidic impedance chip for Pseudomonas fluorescens biofilms detection based on graphite electrodes and time series Nyquist curves of Pseudomonas fluorescens biofilms growth. (F) Microfluidic impedance chip containing reference electrode(RE),interdigital microelectrode(IDuE),punctual electrode(PE),counter electrode(CE),Ag/AgCl electrode,and working electrode(WE) for Staphylococcus aureus biofilms detection.

生物被膜的形成會(huì)受到周圍環(huán)境因素的影響，如培養(yǎng)基、溫度等，滿足生物被膜生長(zhǎng)所需培養(yǎng)基的流動(dòng)狀態(tài)也會(huì)影響生物被膜的結(jié)構(gòu)[82-83]，在流動(dòng)狀態(tài)下形成的生物被膜與生物被膜造成感染的環(huán)境更加接近。利用微流控技術(shù)在流動(dòng)狀態(tài)下研究生物被膜的形成更有價(jià)值。Zarabadi等[84]將石墨工作電極及石墨參比電極剪切成長(zhǎng)條狀，再通過電沉積法制作金工作電極，將3個(gè)電極用雙面膠粘合于硅基片上，將聚二甲基硅氧烷(PDMS) 澆筑到模具上制作出微通道再與含 3個(gè)電極的硅基片貼合，成功構(gòu)建實(shí)驗(yàn)所需微流控芯片裝置 (圖3E)。利用此微流控芯片裝置分別對(duì)流動(dòng)狀態(tài)下微通道拐角及中心處銅綠假單胞菌形成的生物被膜進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)65 h的在線監(jiān)測(cè)，并采用等效電路模型對(duì)微通道拐角及中心處獲得的生物被膜阻抗信號(hào)進(jìn)行擬合分析，發(fā)現(xiàn)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，微通道拐角及中心處擬合得到的生物被膜電容 Cb均先增加后減少，生物被膜電阻 Rb均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，但相比微通道中心，微通道拐角處擬合得到的生物被膜電阻Rb較大，可能是由于兩處形成的生物被膜結(jié)構(gòu)存在差異。

綜上所述，不同的細(xì)菌種類成膜能力及其形成時(shí)間會(huì)存在差異，電化學(xué)阻抗是通過獲取生物被膜響應(yīng)的阻抗信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，阻抗信號(hào)本身不具有特異性。但是，不同的細(xì)菌生物被膜響應(yīng)的阻抗信號(hào)有所不同，我們可通過控制及優(yōu)化阻抗檢測(cè)的相關(guān)參數(shù)，由阻抗相關(guān)參數(shù)對(duì)不同種細(xì)菌形成的生物被膜進(jìn)行區(qū)分。電極的材料構(gòu)型及等效電路分析模型是應(yīng)用電化學(xué)阻抗檢測(cè)生物被膜的關(guān)鍵。相同細(xì)菌在不同的電極表面處生物被膜的形成情況也可能存在差異，對(duì)生物被膜檢測(cè)具有高靈敏度且易于粘附細(xì)菌的電極材料及電極結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)有待進(jìn)一步研究。針對(duì)不同的生物被膜阻抗檢測(cè)體系，會(huì)有不同的等效電路分析模型，且模型選擇不同，擬合得到的生物被膜相關(guān)電容及電阻結(jié)果也存在差異。細(xì)菌生物被膜的形成過程分為可逆粘附期、不可逆粘附期、成熟期及散播期，處于不同時(shí)期的生物被膜具有不同的結(jié)構(gòu)，因此不同時(shí)刻獲得的生物被膜阻抗譜圖呈現(xiàn)出規(guī)律性的變化趨勢(shì)，等效電路擬合得到的生物被膜相關(guān)電容及電阻也會(huì)呈現(xiàn)出一定的變化規(guī)律，但目前的研究還未能清晰地由阻抗分析結(jié)果嚴(yán)格區(qū)分生物被膜所處的生長(zhǎng)周期。所以今后，深入解析生物被膜特征阻抗信號(hào)并建立生物被膜與阻抗分析結(jié)果的關(guān)聯(lián)模型是完善電化學(xué)阻抗檢測(cè)生物被膜研究的一個(gè)重點(diǎn)。微流控芯片具有便攜、易于功能化及集成化的特點(diǎn)，如何充分發(fā)揮微流控芯片本身的優(yōu)勢(shì)，并將其與電化學(xué)阻抗技術(shù)有機(jī)結(jié)合起來應(yīng)用到生物被膜的檢測(cè)及生物被膜形成機(jī)制的研究中，是今后具有特色的研究方向之一。

5　總結(jié)及展望

自人類認(rèn)識(shí)到細(xì)菌不單是以個(gè)體的形式存在，還會(huì)以群體的方式即生物被膜的形式存在以來，生物被膜的研究就一直備受關(guān)注。生物被膜的形成既受到周圍環(huán)境因素的影響，又受到細(xì)菌內(nèi)基因的調(diào)控。細(xì)菌群感效應(yīng)是一種調(diào)節(jié)生物被膜形成的重要機(jī)制。當(dāng)前，生物被膜的檢測(cè)方法顯得尤為重要，它是解決由生物被膜引發(fā)院內(nèi)感染及食品污染等問題的基礎(chǔ)。結(jié)晶紫染色、激光共聚焦 (CLSM) 顯微觀測(cè)等方法雖可對(duì)生物被膜的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，但不能滿足對(duì)生物被膜動(dòng)態(tài)形成過程的持續(xù)在線檢測(cè)。此時(shí)，電化學(xué)阻抗以其無標(biāo)、無損、原位持續(xù)在線檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用到生物被膜動(dòng)態(tài)形成過程的檢測(cè)中恰到好處。在生物被膜阻抗檢測(cè)中，電極的選擇是決定檢測(cè)靈敏度的關(guān)鍵，一方面，可對(duì)普通電極表面進(jìn)行化學(xué)修飾以提高生物被膜阻抗信號(hào)響應(yīng)靈敏度；另一方面，設(shè)計(jì)制作超靈敏微電極，并將微電極集成到微流控芯片中，合理布局微流控芯片功能區(qū)，即可提高生物被膜電化學(xué)阻抗檢測(cè)靈敏度，又可發(fā)揮出微流控芯片本身的優(yōu)勢(shì)，以實(shí)現(xiàn)生物被膜形成過程的高通量檢測(cè)。除此之外，微流控芯片微通道微環(huán)境中受外界干擾小，可對(duì)流體流速等條件進(jìn)行人為操縱，具有模擬人體內(nèi)環(huán)境的潛能,微流控芯片為電化學(xué)阻抗研究體內(nèi)生物被膜在肺部、腸道等部位的感染及生物被膜形成情況提供了良好的操作平臺(tái)?？傊?，將微流控芯片與電化學(xué)阻抗結(jié)合在生物被膜檢測(cè)方面較常規(guī)體系具有很大優(yōu)勢(shì)。今后，用于生物被膜阻抗檢測(cè)的高靈敏電極結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)及電極修飾、滿足生物被膜在不同環(huán)境下檢測(cè)的微流控芯片設(shè)計(jì)是極具前景和重大意義的研究方向。

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