譚 勁 岳金寶 羅玉姣 吳 丹 劉 尋 李 群

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南長沙 410208

口腔黏膜下纖維化是一種以膠原蛋白等細胞外基質(zhì)異常增多和過渡沉積為主要病變特征的慢性、隱匿性疾病[1]。研究發(fā)現(xiàn)中藥丹玄口康能影響TGFβ1的表達從而抑制ANE誘導(dǎo)的口腔黏膜成纖維細胞膠原蛋白的分泌[2]，TGFβ1調(diào)節(jié)膠原等細胞外基質(zhì)的信號傳遞，主要由Smad家族蛋白分子來完成[3]。Smad2/3的磷酸化是Smad通路激活的最重要一步，P-Smad2/3由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)入細胞核是信號通路的標志。本研究以體外培養(yǎng)的口腔黏膜成纖維細胞（fibroblast，F(xiàn)B）為研究對象，采用特異性TGF-β受體抑制劑LY2109761[4]阻斷TGF-β/Smad通路，運用免疫組化、分子生物學(xué)等方法，觀察ANE對口腔黏膜成纖維細胞表達膠原蛋白的影響及丹玄口康的干預(yù)作用，旨在為OSF的中醫(yī)藥臨床治療提供新的實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　口腔黏膜成纖維細胞（FB）

口腔黏膜成纖維細胞來自雄性SD大鼠（SPF級，體重220～250g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，合格證號：SCXK (湘）：20U-0005。飼養(yǎng)環(huán)境溫度25℃，相對濕度50%，自由飲食進水，分籠喂養(yǎng)），細胞分為4組：正常組、對照組、LY2109761組和丹玄口康組。

1.2　實驗藥物

1.2.1丹玄口康片 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科生產(chǎn)，由丹參、當歸、紅花、生地、玄參、白花蛇舌草、生黃芪、薄荷等藥組成，院制批號：20140208，規(guī)格：每片含生藥1g（相當于原藥材20g）。

1.2.2檳榔提取物（ANE） 食用檳榔150g，60℃烤箱烘干碾成粉，加乙醚500mL，10%氨水100mL，充分混合，強震蕩，靜置24h，4℃。抽濾去渣后，水浴餾去乙醚及氨，濃縮成膏狀，60℃烤箱拷干成粉末狀，粉溶于蒸餾水，濃度10mg/mL，用0.22μm過濾器過濾除菌后分裝，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3　主要試劑和設(shè)備

DMEM（高糖型）培養(yǎng)基；胎牛血清；10×多聚賴氨酸（北京索萊寶科技有限公司）；LY2109761（selleck）；兔 抗 Collagen I（Abcam）；小 鼠 抗p-Smad2/3（Abcam）；羊抗兔 IgG（美 Vector）；羊抗小鼠IgG（Vector）；ABC試劑盒；瓊脂糖；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京康為世紀）；EDTA（Sigma）；Tris（Sigma）；Trizol（Invitrogen）；Taq酶（Genstar）；引物（南 京 金 斯 瑞）；DEPC（Sigma）；DL2000 DNA Marker（Genstar）；dNTP（Genstar）；E.B.（Sigma）；SYBGREEN PCR Mix（Invitrogen）；CO2細胞培養(yǎng)箱（南京皓海儀器儀表有限公司）；超凈工作臺（蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司）；倒置顯微鏡（上海賴氏電子科技有限公司）；TGL-18R臺式冷凍離心機（eppendorf）；熒光定量 RCP儀（Thermo）；熒光PCR板（Thermo）；164-5050電泳儀（Bio-rad）；水平瓊脂糖電泳槽（北京六一）；電動玻璃勻漿器（新芝）。

1.4　方法

1.4.1藥物血清制備 大鼠分別以生理鹽水、丹玄口康8g/kg（按照體表面積藥物劑量換算公式計算，相當70kg成人劑量的2倍）灌胃，2次/d，連續(xù)5d。大鼠末次灌胃1h后，無菌條件下頸動脈采血，室溫靜置2h，1500rpm離心10min制備血清，56℃滅活30min，0.22μm濾器除菌后，用DMEM配制成含10%大鼠血清的培養(yǎng)液備用。

1.4.2FB的培養(yǎng)和干預(yù) 取健康SD大鼠口腔頰部粘膜組織塊，含雙抗（100μ/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素）的PBS充分漂洗3次，入DMEM中剪碎，種入到培養(yǎng)瓶中，置37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，組織貼附后，加適量20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)靜置培養(yǎng)，48h半量換液1次。待組織周圍爬出細胞占培養(yǎng)瓶底面積80%時即可進行傳代。棄培養(yǎng)液，Hanks液洗3次，0.25%胰蛋白酶消化3min，輔以吹打，倒置顯微鏡下觀察到細胞回縮、細胞漂浮在液體中后，加入含10%胎牛血清的DMEM終止反應(yīng)，移至離心管中，800r/min速度離心5min，去上清液，加入DMEM吹打，使細胞懸浮，移至培養(yǎng)瓶中，一般按照1∶2比例傳代，4d左右傳代一次。取第4代細胞，分組干預(yù)如下：正常組（10%正常大鼠血清）、對照組（100μg/mL ANE+ 10%正常大鼠血清）、LY2109761組（10μmol/L LY2109761+100μg/mL ANE+10%正常大鼠血清）丹玄口康組（10%丹玄口康含藥血清+100μg/mL ANE），細胞以5×104個/mL的密度接種于貼有蓋玻片的24孔板中，每組6孔，培養(yǎng)48h后，收集上清液，-80℃保存，用于ELISA檢測；培養(yǎng)細胞用4%多聚甲醛固定15min后進行免疫細胞化學(xué)染色。

1.4.3ELISA檢測上清液中Ⅰ型膠原含量 按試劑盒說明書操作，設(shè)置對照品組、樣品組及空白組，顯色后，以空白孔調(diào)零，在波長490nm處讀取OD值；以O(shè)D值為縱坐標，以對照品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，根據(jù)所測得的OD 值在標準曲線上計算出Ⅰ型膠原含量的相應(yīng)濃度。

1.4.4免疫細胞化學(xué)染色檢測Ⅰ型膠原及P-Smad2/3蛋白的表達 免疫細胞化學(xué)染色主要步驟依次為：0.01MPBS漂洗，1%過氧化氫溶液10min，0.01 MPBS漂洗，5%正常小牛白蛋白（BSA）+0.3%TritonX-100室溫下封閉lh，吸棄封閉液，直接滴加一抗Collagen I（1∶500）或P-Smad2/3（1∶ 200），4℃過夜，0.01 MPBS漂洗，加入二抗（1∶ 200），37℃孵育 lh；0.01 MPBS漂洗，加入ABC復(fù)合物，37℃孵育lh；0.01MPBS，DAB顯色試劑盒37℃顯色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。在高倍鏡下攝取圖像，采用圖像分析系統(tǒng)，測定免疫陽性細胞的灰度值，同時測量背底灰度值，計算其差值的絕對值，即得出免疫陽性細胞的相對灰度值。

1.4.5熒光定量PCR檢測Ⅰ型膠原mRNA的表達 提取組織總RNA，渦旋振蕩混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。42℃孵育30 ～ 50min，85℃孵育5min，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液，短暫離心，置于冰上冷卻，保存于-80℃待用；RT-qPCR引物設(shè)計：在NCBI上搜索目的基因的序列，運用primer5軟件設(shè)計引物，合成引物（actin-F：5’- CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3’actin-R：5’-TAATGTCACGCACGATTTCC-3’，product length：1 0 7 b p；C o l 1-F：5’-TGTGCGATGGCGTGCTATGC-3’Col1-R：5’-CGACTCCTATGACTTCTGCGTCTGGT-3’，product length：123bp）；每組實驗設(shè)6個復(fù)孔，獨立實驗重復(fù)3次，取平均值。以管家基因 β-actin 作為內(nèi)源性參照。待測基因的相對表達量以2-ΔΔCT表示。

1.5　統(tǒng)計學(xué)處理

本研究運用SPSS20.0統(tǒng)計軟件分析，實驗數(shù)據(jù)以（x±s） 表示，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間采用兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1?、裥湍z原蛋白ELISA檢測結(jié)果

ELISA結(jié)果顯示，正常組上清液中CollagenⅠ的含量約為133.7pg/mL，ANE刺激后，對照組Collagen Ⅰ的含量明顯增加（P＜0.05）；ANE刺激同時加入LY2109761后，培養(yǎng)液中Collagen I的含量明顯降低，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。丹玄口康組Collagen I的含量略高于正常組和LY2109761組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但與對照組相比含量明顯降低（P＜0.05）。見表1。

表1　丹玄口康對ANE刺激下的Collagen Ⅰ表達的影響（±s ）

表1　丹玄口康對ANE刺激下的Collagen Ⅰ表達的影響（±s ）

注：與正常組比較*P＜0.05；與對照組比較#P＜0.05

組別　　培養(yǎng)液（pg/mL）　　細胞（相對灰度值）正常組　133.7±14.5　38.8±4.3對照組　268.5±30.2*　58.4±6.8*LY2109761組　134.6±12.7#　41.7±5.3#丹玄口康組 　135.3±15.6#　42.4±5.6#F 70.48　15.15 P＜0.01　　＜0.05

2.2?、裥湍z原蛋白免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果

免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果顯示Collagen Ⅰ免疫陽性物質(zhì)在胞漿中表達。正常組細胞中也存在Collagen Ⅰ的表達，但染色較淺。對照組與正常組相比，免疫陽性細胞相對灰度值明顯要大（P＜0.05），LY2109761組與對照組相比，免疫陽性細胞相對灰度值均有所減?。≒＜0.05），丹玄口康組與對照組相比，免疫陽性細胞相對灰度值均有所減?。≒＜0.05）。見1，圖1。

圖1　口腔黏膜成纖維細胞Collagen Ⅰ免疫細胞化學(xué)染色（A.正常組, B. 對照組, C. LY2109761組, D.丹玄口康組，200倍）

2.3　P-Smad2/3蛋白免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果

免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果顯示正常組胞漿和胞核中有P-Smad2/3表達，但染色較淺。對照組，細胞核免疫陽性顆粒的相對灰度值比正常組明顯要大（P＜0.05），LY2109761組與對照組相比，相對灰度值比ANE刺激組有所減小（P＜0.05），丹玄口康組與對照組相比，相對灰度值有所減?。≒＜0.05）。見表2，圖2。

表2　丹玄口康對ANE刺激下的 P-Smad2/3胞核轉(zhuǎn)位的影響（±s ）

表2　丹玄口康對ANE刺激下的 P-Smad2/3胞核轉(zhuǎn)位的影響（±s ）

注：與正常組比較*P＜0.05；與對照組比較#P＜0.05

組別　　相對灰度值正常組　25.3±3.1對照組　54.4±8.8*LY2109761組　26.5±3.4#丹玄口康組 　26.8±3.5#F 43.13 P＜0.01

2.4　熒光定量PCR結(jié)果

圖2　口腔黏膜成纖維細胞P-Smad2/3免疫細胞化學(xué)染色（A.正常組, B. 對照組, C. LY2109761組, D.丹玄口康組，200倍）

Collagen Ⅰ和β-actin擴增曲線顯示熒光信號指數(shù)擴增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系。Collagen Ⅰ和β-actin溶解峰呈單峰，結(jié)果為單一峰，說明無非特異性產(chǎn)物，定量準確。2-ΔΔCt反映各樣品相對于對照組樣品目的基因的表達水平，對照組Collagen I mRNA相對表達量高于正常（P＜0.05），LY2109761組Collagen I mRNA相對表達量比對照組明顯降低（P＜0.05），丹玄口康組Collagen I mRNA相對表達量比對照組明顯降低（P＜0.05）。見圖3 ～ 5。

圖3　 擴增曲線

圖4　溶解曲線

圖5　Collagen Ⅰ mRNA相對表達量(2-ΔΔCT)

3　討論

研究表明活化的口腔黏膜成纖維細胞（fibroblast，F(xiàn)B）是促進細胞外基質(zhì)異常增多和過渡沉積的主要細胞，是口腔黏膜膠原蛋白合成的主要來源[5]。TGFβ是一種具有多種生物學(xué)功能的蛋白多肽，是對細胞的增殖、分化等多種生理功能起重要調(diào)節(jié)的因子，也是多種器官和組織纖維化的關(guān)鍵因子[6]。TGF-β具有三種受體類型[7]：受體Ⅰ型（TGF-β receptorⅠ，TβRⅠ）、受體Ⅱ型（TGF-β receptor Ⅱ，TβR Ⅱ）、受體Ⅲ型（TGF-β receptorⅢ，TβRⅢ）。其中TβRⅠ、TβRⅡ具有膜結(jié)合絲氨酸／蘇氨酸結(jié)構(gòu)域，具有細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的活性。TβR Ⅱ可直接結(jié)合配體，隨后RⅠ與RⅡ受體結(jié)合，并磷酸化受體胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，進行信號的傳遞。Smads蛋白（Drosophila mothersagainst decapentaplegic protein，Smad）是近年發(fā)現(xiàn)的一種胞內(nèi)信號蛋白，是一種在真核細胞中高度保存的分子，由于Smad及所介導(dǎo)的生物學(xué)信號可能作為杠桿作用，參與多種纖維化疾病的過程而倍受關(guān)注。Smad 蛋白家族可分為3群[8]：受體激活型 Smads（R-Smads），包括 Smad1-3、Smad5、Smad8；通用配體型 Smads（Co-Smads）包括 Smad4、Smad10；抑制 型 Smads（I-Smads），包 括 Smad6、Smad7。 其中 Smad2、Smad3、Smad4、Smad7參與 TGF-βs的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。TGFβ1調(diào)節(jié)膠原等細胞外基質(zhì)的信號傳遞，主要由Smad家族蛋白分子來完成。TGFβ1信號由胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)入核內(nèi)的過程，是由磷酸化的R-Smads分子來完成的，即TGF-β家族成員與胞膜受體絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結(jié)合，形成異四聚體復(fù)合物TGF-βⅡ型受體并使其磷酸化，TβRⅡ繼而激活 TGF-βⅠ型受體。TGF-βⅠ型受體磷酸化下游 R-Smads（Smad2/3），p-Smad2/3與 Co-smad（smad4）結(jié)合，形成復(fù)合體后進入細胞核并在細胞核內(nèi)聚集。該復(fù)合體與其他轉(zhuǎn)錄因子一起共同與DNA雙鏈結(jié)合，通過和轉(zhuǎn)錄因子的相互作用從而調(diào)控靶基因的表達。而Smad2/3的磷酸化是Smad通路激活的最重要一步及標志，細胞內(nèi)p-Smad2/3表達的多少即意味著該通路激活的程度。

已有研究表明[9-10]：阻斷TGFβ1的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)就能有效抑制TGFβ1的生物學(xué)效應(yīng)。其方式有三種，一是從配體水平的阻斷，阻斷TGFβ的生成和激活，是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的起始，是胞外配體即處于活化狀態(tài)的TGFβ1分子，與胞膜上的TGFβ1受體結(jié)合。二是胞膜受體水平的阻斷，是胞外TGFβ1與胞膜上的TGFβ1受體相結(jié)合，通過磷酸化激活的形成將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)入胞內(nèi)。三是胞內(nèi)信號分子水平的阻斷，是TGFβ1的胞內(nèi)信號傳遞，主要由Smad家族蛋白分子來完成。阻斷TGFβ1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，下調(diào)Smad2和Smad3的表達并增加Smad7表達，對抑制許多疾病的纖維化有著重要的意義[11-12]。因此，如何阻斷TGFβ1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，尋找針對OSF發(fā)病機制環(huán)節(jié)的特異性治療，從而達到防治OSF的目的是本研究的主要目標。

LY2109761是一種TGF-β受體特異性抑制劑，研究表明LY2109761具有顯著增加卵巢癌細胞的凋亡和抗卵巢癌細胞增殖的作用[13]；LY2109761能抑制骨肉瘤MG-63細胞轉(zhuǎn)移和提高化療的敏感性[14]；LY2109761減輕鼠放射性肺損傷纖維化作用[15]。本研究采用體外培養(yǎng)大鼠頰黏膜的成纖維細胞為研究對象，用LY2109761阻斷TGFβ1/Smad通路，觀察了ANK對FB的Ⅰ型膠原蛋白合成的影響及丹玄口康藥物血清的干預(yù)作用。實驗首先發(fā)現(xiàn)，ANE刺激FB后，免疫細胞化學(xué)染色和上清液ELISA檢測結(jié)果顯示I型膠原蛋白合成增多（P＜0.05），熒光定量PCR檢測顯示Ⅰ型膠原蛋白mRNA的基因轉(zhuǎn)錄水平明顯提高（P＜0.05），說明ANE誘導(dǎo)可促進FB I型膠原蛋白的合成。進一步對FB磷酸化Smad2/3免疫染色顯示，ANE刺激FB后，細胞核磷酸化Smad2/3免疫陽性細胞數(shù)量增多（P＜ 0.05），表達明顯增強（P＜0.05），ANE誘導(dǎo)可促進FB Smad2/3的磷酸化胞核的轉(zhuǎn)位。以上結(jié)果顯示ANE作為一種較強刺激因素，通過激活TGFβ1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進FB的Ⅰ型膠原蛋白的合成。ANE刺激FB后，給予TGF-β受體抑制劑LY2109761干預(yù)，發(fā)現(xiàn)Ⅰ型膠原蛋白合成減少（P＜0.05），Ⅰ型膠原蛋白mRNA的表達減弱（P＜0.05），細胞核磷酸化Smad2/3免疫陽性細胞數(shù)量明顯減少（P＜0.05），表達明顯減弱（P＜0.05），抑制了ANE誘導(dǎo)的Smad2/3的磷酸化胞核的轉(zhuǎn)位，結(jié)果顯示LY2109761通過阻斷TGFβ1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制ANE刺激的FB的Ⅰ型膠原蛋白的合成。ANE刺激FB后，給予丹玄口康藥物血清的干預(yù)，Ⅰ型膠原蛋白及mRNA表達明顯減弱（P＜0.05）、Smad2/3的磷酸化胞核的轉(zhuǎn)位水平降低（P＜0.05），與LY2109761干預(yù)結(jié)果一致。以上實驗結(jié)果提示：丹玄口康可通過調(diào)控TGFβ1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而抑制ANE刺激的FB的I型膠原蛋白的合成，進而發(fā)揮其抗纖維化的作用。

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