周永順, 龔 劍, 楊可欣, 林粲源, 吳翠琴, 張舒寒

(廣州大學環(huán)境科學與工程學院, 珠江三角洲水質安全與保護教育部重點實驗室, 廣東省放射性核素污染控制與資源化重點實驗室, 廣東 廣州 510006)

皮質類固醇激素(corticosteroids, CSs)是一類由腎上腺皮質所合成的重要激素,幾乎參與了人類和動物的所有生命活動[1,2]。人工合成的CSs類藥物被廣泛應用于炎癥、免疫類疾病治療[3,4],但長期使用可能導致人體免疫力下降、肥胖等疾病[5]。CSs可通過人體和動物的排泄、污水處理廠的不完全處理排放,并最終進入天然水環(huán)境中。相關研究表明多種CSs普遍存在于環(huán)境水體中,可能已對水生系統造成不利影響[6,7]。與其他有機污染物一樣,CSs可通過吸附作用附著于懸浮顆粒上并隨之遷移,最終沉積到水底,富集于沉積物中;也可在水動力或其他理化條件變化時重新釋放到水體,并通過生物富集和食物鏈的傳遞作用進而危害生態(tài)系統和人類健康[8]。迄今為止,關于環(huán)境中CSs污染現狀的研究主要集中在地表水和污水處理廠上[9,10],而對于其在沉積物等天然固相介質中的賦存狀況則鮮有報道[11]。

環(huán)境中CSs的殘留水平不高(μg/L至ng/L級),沉積物樣品基質組成復雜,前處理難度較大,因此,目前關于沉積物中CSs的殘留分析方法仍十分有限。有關CSs在天然環(huán)境中的含量水平、污染特征等研究剛起步[9-11],對該類污染物環(huán)境地球化學行為的認識亦非常有限。這主要受制于缺少相關的分析方法,特別是缺少針對基質復雜的環(huán)境介質中CSs多殘留的痕量分析方法。Zhang等[12]測定了基質較為復雜的市政污水中3種糖皮質激素,然而該方法回收率較低,檢出限和定量限較高,且實際樣品中未能檢測出目標物;Liu等[13]和Chen等[14]分析了水體顆粒物和沉積物中4～5種糖皮質激素,僅有皮質醇被檢出。雖然之前Liu等[15]、楊雷等[16]、Fan等[17]、Weizel等[18]開展了沉積物和污泥中數十種類固醇激素的監(jiān)測,但就CSs而言該類分析方法缺乏針對性和系統性。而且其目標物僅包含5～12種糖皮質激素,不僅未涉及鹽皮質激素,也未能覆蓋大多常見常用的CSs。水環(huán)境中沉積物既是污染物的“匯”也是“源”,因此,有必要針對性地發(fā)展一套簡便、靈敏的沉積物中CSs多殘留的痕量分析方法,并將其應用到實際的環(huán)境監(jiān)測中,為更系統地研究CSs在環(huán)境多介質中的賦存狀況和環(huán)境行為提供技術保障。

針對基質更為復雜的環(huán)境沉積物,本研究在水樣分析方法[19]的基礎上,進一步采用超聲波輔助提取聯合固相萃取(SPE)技術對樣品進行前處理,并對提取液開展二次深度凈化降低基質干擾;重新對質譜條件進行優(yōu)化,兼顧信號響應和儀器耐受性。最終建立了一套利用超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)同時檢測沉積物中24種CSs的定量分析方法,并應用于珠江沉積物的CSs測定。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

1260 Infinity-6460 QQQ超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用系統(UPLC-MS/MS, Agilent公司)及Agilent MassHunter定量分析軟件;Autotrace280全自動固相萃取儀(美國Thermo公司); Rotavapor R-120旋轉蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司); EFAA-DC12氮吹儀(上海安譜公司); Oasis HLB SPE柱(500 mg, 6 mL, Waters公司); Silica SPE柱(500 mg, 6 mL, Waters公司); LC-NH2SPE柱(500 mg, 3 mL, Supelco公司)。

24種CSs標準樣品(見表1)均購自美國Sigma-Aldrich公司,純度均大于98%; 5種同位素替代物標準品:氫化可的松-d4、地塞米松-d4、曲安奈德-13C3、布地奈德-d8、丙酸氟替卡松-d5均購自加拿大Toronto Research Chemicals公司,純度均大于95%;甲醇、乙酸乙酯、乙腈、丙酮(HPLC級,德國CNW公司);實驗用水均為超純水(電阻率18.25 MΩ·cm)。

實際樣品為珠江三角洲河流表層沉積物。

1.2 標準溶液的配制

首先稱取適量標準品,用甲醇配制成質量濃度為100 mg/L的單標儲備液。取適量儲備液用甲醇稀釋配制成10 mg/L的24種目標物的混合標準溶液和10 mg/L的5種同位素替代物混合標準溶液。然后用甲醇逐級稀釋至質量濃度為1.0～100 μg/L的系列混合標準工作溶液;另取適量的5種同位素替代物混合標準溶液稀釋成1 mg/L的內標工作液備用。所有標準溶液置于冰箱-20 ℃避光儲存。

表 1 24種目標化合物的質譜參數Table 1 Mass spectrometric parameters for the 24 target compounds

1.3 樣品的采集與處理

用不銹鋼抓斗式采樣器從珠江三角洲河流采集表層(0～20 cm)沉積物樣品,轉移至實驗室并置于-20 ℃冷凍保存至分析。

稱取2.0 g經冷凍干燥、研磨過篩的沉積物樣品置于50 mL具塞聚丙烯離心管中,加入0.5 g銅片、10 mL甲醇-丙酮(1∶1, v/v)、20 μL的內標工作液,混勻后超聲提取10 min,再以6 000 r/min速度離心10 min并收集上層清液。上述步驟重復3次并合并提取液。利用旋轉蒸發(fā)儀將提取液濃縮至1 mL后,溶于200 mL超純水中,溶液用于固相萃取。Oasis HLB小柱依次用6 mL乙酸乙酯、6 mL乙腈、12 mL超純水活化后,使用全自動固相萃取儀以10 mL/min的流速將試樣溶液過柱。上樣完畢后,先用10 mL 10%(v/v)乙腈水溶液淋洗,接著氮吹干燥柱床,然后依次用6 mL乙酸乙酯-乙腈(1∶1, v/v)、6 mL乙酸乙酯洗脫。收集的洗脫液經旋轉蒸發(fā)、氮氣吹干后復溶于1 mL甲醇。用5 mL乙酸乙酯、5 mL甲醇活化LC-NH2小柱,再將甲醇濃縮液過柱凈化,用5 mL甲醇洗脫。用氮氣將洗脫液吹至近干并以甲醇定容至0.5 mL,待UPLC-MS/MS測定。

圖 1 提取試劑對24種皮質類固醇激素回收率的影響(n=5)Fig. 1 Effect of extracting solvents on recoveries of the 24 CSs (n=5)

1.4 色譜條件

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C8色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm);流動相A: 0.1%(v/v)乙酸水溶液,流動相B:乙腈;柱溫30 ℃;流速0.3 mL/min;進樣量5 μL;梯度洗脫程序[19]: 0～8.0 min, 28%B; 8.0～8.1 min, 28%B ～ 40%B; 8.1～12.0 min, 40%B; 12.0～12.1 min, 40%B～60%B; 12.1～16.0 min, 60%B～70%B; 16.0～16.5 min, 70%B～100%B; 16.5～20.5 min, 100%B。

1.5 質譜條件

離子源:電噴霧電離源,正離子掃描模式(ESI+);霧化器壓力:276 kPa;脫溶劑氣流速:11 L/min;離子源溫度:300 ℃;毛細管電壓4 000 V;采集時間窗口(delta retention time)為1.2 min,采用動態(tài)多反應選擇性監(jiān)測掃描模式(DMRM)。優(yōu)化后的24種目標化合物的質譜參數見表1。

定量分析:為了有效監(jiān)控實驗過程的系統誤差,消減基質效應的影響,提高定量結果的準確性,本研究采用內標法定量。使用5種同位素替代物作為內標對24種目標物進行定量分析:皮質醇-d4(No.1～6)、地塞米松-d4(No.7～12)、曲安奈德-13C3(No.13～18)、布地奈德-d8(No.19～20)、丙酸氟替卡松-d5(No.21～24)(括號中為其對應的表1中目標物的編號)。

2 結果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

選擇合適的萃取溶劑能夠提高目標物的提取效率同時減少雜質干擾?？紤]到目標化合物種類較多、極性范圍較大且沉積物樣品基質復雜等特點,本研究選取弱、中、強極性的3種常用溶劑乙酸乙酯、乙酸乙酯-乙腈(1∶1, v/v)以及甲醇-丙酮(1∶1, v/v),用于樣品超聲萃取并比較其提取效率。

3種溶劑萃取加標樣品的回收率結果見圖1?？梢钥闯?樣品經乙酸乙酯溶劑提取后,所有目標物均被檢出,回收率為8.58%～154.4%,相對標準偏差(RSD)為1.28%～40.8%;乙酸乙酯-乙腈(1∶1, v/v)的提取液中未能檢測出曲安西龍,其余目標物回收率為6.19%～172.2%,RSD為0.64%～21.3%;樣品經甲醇-丙酮(1∶1, v/v)提取后所有目標物均被檢出,回收率為71.7%～130.2%,RSD為1.1%～9.7%。與前兩者相比,甲醇-丙酮(1∶1, v/v)作為提取溶劑具有較高的回收率和重復性。因此本研究選擇甲醇-丙酮(1∶1, v/v)作為超聲萃取溶劑。

2.2 SPE凈化條件的選擇及優(yōu)化

沉積物樣品基質復雜,其提取液中難免含有大量的干擾物,不但影響儀器分析的準確性,還會縮短分離柱的使用壽命[20]。因此為盡量降低基質效應的影響,本研究考察了Silica柱和LC-NH2柱對SPE濃縮液作進一步凈化的效果。其中Silica柱是以硅膠為基質的極性吸附劑,主要用于分離非水溶液中的低極性組分[21],通過增加極性高的洗脫溶劑將結構相似的化合物分開;LC-NH2柱是以氨丙基為基質的中等極性吸附劑,能夠從極性溶液中萃取非極性化合物,與Silica柱一樣適用于分離異構體[22]。

圖 2 SPE凈化條件對24種皮質類固醇激素回收率的影響(n=5)Fig. 2 Effect of SPE purification conditions on recoveries of the 24 CSs (n=5)

基于先前的研究[9],采用Oasis HLB SPE柱對樣品提取液進行富集并用10 mL的10%乙腈水溶液洗柱,作為第一次凈化。接著再分別用上述兩種凈化柱對HLB柱洗脫液進行第二次凈化:(1)洗脫液濃縮后溶于1 mL乙酸乙酯-正己烷(1∶9, v/v),并轉移至活化的Silica柱,并用3 mL乙酸乙酯-正己烷(1∶9, v/v)淋洗,最后用4 mL乙酸乙酯-甲醇(95∶5, v/v)洗脫,洗脫液經旋轉蒸發(fā)、溫和氮氣吹干后用甲醇定容,待測;(2)洗脫液濃縮后溶于1 mL甲醇,并轉移至活化的LC-NH2柱,用5 mL甲醇洗脫LC-NH2柱,洗脫液經旋轉蒸發(fā)、溫和氮氣吹干,甲醇定容后待測。通過比較只經過HLB柱一次凈化以及分別再經Silica柱、LC-NH2柱二次凈化的3種情況,對凈化效果進行綜合評估。

3種凈化條件下目標物回收率結果如圖2所示。樣品僅經過HLB柱一次凈化時,目標化合物的回收率普遍偏低(25.5%～95.9%)且RSD范圍較大(11.1%～42.0%),重現性較差。濃縮液經Silica柱二次凈化后,目標物之一曲安西龍并未檢出,可能與其在硅膠柱中保留較強,不易被洗脫下來有關。其余目標化合物的回收率為52.7%～94.7%, RSD為0.9%～8.6%。濃縮液經LC-NH2柱二次凈化后,所有目標化合物均被檢出,回收率為61.4%～118.4%, RSD為0.8%～6.5%。可見其凈化效果優(yōu)于前兩種情況且回收率高、重現性較好。對比濃縮液經過LC-NH2柱凈化前后代表性化合物的信號響應(見圖3)發(fā)現,凈化后的樣品中基質干擾明顯降低,目標物信號增強。因此本研究選用LC-NH2柱對樣品進行二次凈化。

2.3 質譜條件的優(yōu)化

CSs是典型的甾體類化合物,其基本結構如圖4所示。化合物在C-17、C-20和C-21處存在酮基或羥基,能夠在ESI-模式下離子化,產生的母離子為[M+HCOO]-;在C-3處存在共軛羰基等多電子基團,所以在ESI+模式下能形成[M+H]+母離子。因此CSs可以在正、負兩種電離模式下檢測到。通過單標溶液進樣,分別對24種目標物的質譜參數進行優(yōu)化。首先,通過母離子的全掃描(full scan)確定化合物的準分子離子,然后在選擇離子監(jiān)測(SIM)模式下優(yōu)化碎裂電壓和毛細管電壓,使[M+H]+或[M+HCOO]-響應達到最大;然后對母離子作子離子全掃描(product ion scan),選擇2個具有更高豐度的特征碎片離子,優(yōu)化碰撞能量以使響應最大化,最后獲得響應最佳的兩對MRM離子對和相應的質譜參數。

圖 3 氟尼縮松、醋酸氟氫可的松、皮質酮、丙酸氯倍他索和丁酸倍他松經LC-NH2 SPE柱凈化前、后的MRM色譜圖Fig. 3 MRM chromatograms of flunisolide, fludrocortisone acetate, corticosterone, clobetasol propionate and clobetasone butyrate before and after purified by LC-NH2 cartridges

圖 4 皮質類固醇激素的結構骨架Fig. 4 Structural features of corticosteroids

圖 5 24種目標物混合標準溶液(20 μg/L)在(a)正離子模式、(b)負離子模式、和(c)正負離子模式下的總離子色譜圖Fig. 5 Total ion chromatograms (TIC) of the 24 target compounds at mass concentration of 20 μg/L in (a) positive ion mode, (b) negative ion mode, and (c) positive and negative ion mode For peak Nos., see Table 1.

分別在ESI-、ESI+和ESI±模式下,對24種目標物的特征離子進行掃描。結果發(fā)現,在ESI-模式下,皮質醇、潑尼松、皮質酮等十幾種目標物的信號強度過低[23];在ESI+模式下的大部分化合物基峰的相對豐度比ESI±模式高出2～6倍(見圖5)。另外,考慮到ESI±模式下須使用導電毛細管,與ESI+模式下使用的石英毛細管相比,其耐臟程度低、使用壽命也較短。因此,本研究選擇石英毛細管并在ESI+下對目標化合物進行分析。

2.4 基質效應評價

沉積物樣品基質復雜,進行質譜分析時易受到基質干擾,影響方法的靈敏度和重現性。本研究采用向沉積物提取液和純溶劑中加標的方式評價基質效應(ME)的影響,計算公式如下[24]:ME=(1-扣除本底后基質溶液中目標物的響應值/純溶劑中相應目標物的響應值)×100%。

結果(見表2)發(fā)現,沉積物樣品在未經LC-NH2柱凈化的條件下,目標物受基質干擾的影響大,ME值范圍在-7.7%～74.5%之間,大部分化合物表現為較強的基質抑制作用;利用LC-NH2柱對沉積物樣品進行凈化后,ME值范圍為-7.9%～27.9%,大多數目標物基質效應在±20%以內,表明該凈化步驟可有效降低基質干擾。為進一步消減基質效應的影響,本研究采用同位素內標法定量。這不但能有效監(jiān)控分析過程,消除系統誤差,也保證了定量結果的準確度。

2.5 標準曲線的線性方程、檢出限和定量限

配制1.0～100 μg/L的系列混合標準溶液,同時加入5種同位素內標,質量濃度均為10 μg/L。按照濃度由低到高依次進樣,以待測物與內標物定量離子的峰面積比值為縱坐標，待測物的質量濃度(μg/L)為橫坐標，分別繪制標準曲線。24種CSs具有良好的線性關系,相關系數(r2)均大于0.995。按信噪比(S/N)=3和S/N=10計算方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),所有化合物的LOD和LOQ分別在0.14～1.25 μg/kg和0.26～2.26 μg/kg范圍內(見表2)。

2.6 加標回收率和精密度

依據目前有限的報道[11],沉積物中CSs的含量約為類固醇雌激素的幾倍至數十倍,而珠江流域沉積物中的類固醇雌激素殘留普遍在幾個μg/kg水平[25]。因此,本文分別設定了5、20、50 μg/kg 3個加標水平,取2 g沉積物并添加不同量的混合標準溶液,每個加標水平重復測定5次。結果如表3所示,樣品平均加標回收率(n=5)為64.9%～125.1%, RSD(n=5)為0.4%～12.6%,均滿足環(huán)境樣品有機物痕量檢測要求。

表 2 24種目標化合物的線性方程、相關系數、檢出限、定量限和基質效應Table 2 Linear equations, correlation coefficients (R2), limits of detection (LODs), limits of quantification (LOQs) and matrix effects (MEs) for the 24 target compounds

2.7 實際樣品分析

應用所建立的方法分析了3份取自珠江三角洲河流的沉積物樣品,24種CSs測定結果見表4。樣品中共有11種目標物(曲安西龍、倍他米松、地塞米松、曲安奈德、醋酸氟輕松、氟米龍、氟尼縮松、醋酸脫氧皮質酮、丙酸氯倍他索、丙酸氟替卡松和丁酸氯倍他松)被檢出,含量范圍為1.25～29.38 μg/kg。

表 4 珠江三角洲河流沉積物樣品中的皮質類固醇激素含量Table 4 Contents of corticosteroids in the sediment sample from the rivers of Pearl River Delta μg/kg

3 結論

本研究建立了一種基于超聲波提取-固相萃取技術對沉積物樣進行前處理,應用UPLC-MS/MS同時檢測沉積物中24種CSs的分析方法。該方法具有靈敏、準確和重現性好等特點,滿足對沉積物中多種天然和合成CSs的痕量監(jiān)測要求,可廣泛應用到該類污染物環(huán)境行為和生態(tài)風險的研究中。