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心肌梗死是一種常見(jiàn)的心臟疾病，這種疾病的發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，與較多因素有關(guān)，心肌梗死后易出現(xiàn)心室重構(gòu)，心室重構(gòu)誘發(fā)心功能衰竭。在醫(yī)療技術(shù)迅速發(fā)展形勢(shì)下，心肌梗死病人得到有效治療，相應(yīng)的死亡率逐漸降低，但相應(yīng)的心功能不全發(fā)生率未有效降低[1]。心肌梗死對(duì)病人的健康造成較大危害，易導(dǎo)致死亡。心臟病發(fā)展至一定階段后易出現(xiàn)心肌梗死，約一半病人可能由于突發(fā)致死性室性心律失常導(dǎo)致死亡[2-4]。心肌梗死的發(fā)病機(jī)制與心肌電重構(gòu)密切相關(guān)，心肌梗死過(guò)程出現(xiàn)明顯的心肌電生理重構(gòu)，重構(gòu)期間產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞膜離子通道變化，嚴(yán)重者可能出現(xiàn)相應(yīng)的細(xì)胞間縫隙連接變化。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，縫隙連接蛋白43(Cx43)明顯影響心肌電生理重構(gòu)過(guò)程，與此相關(guān)的研究引起學(xué)者關(guān)注。很多學(xué)者建立心肌梗死動(dòng)物模型進(jìn)行研究，模型中發(fā)現(xiàn)明顯的縫隙連接重構(gòu)，且表現(xiàn)為一定程度的心肌電生理失穩(wěn)[5-6]。

心肌梗死后病人心肌多種基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)活性出現(xiàn)明顯變化，其中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)活性顯著升高。這些蛋白酶活性升高后進(jìn)一步導(dǎo)致心肌梗死后左室重構(gòu)，造成病人的心功能損害。心肌梗死治療常用多西環(huán)素，該藥物屬于一種廣譜的MMPs抑制劑，其與MMPs活性中心結(jié)合，降低MMPs表達(dá)水平并降低MMP活性。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)多西環(huán)素可顯著抑制MMP-9表達(dá)，并對(duì)惡性心律失常有一定改善作用，具體機(jī)制尚不確定[7]。本研究建立相應(yīng)的主動(dòng)脈縮窄性心肌梗死大鼠模型，觀(guān)察心室肌Cx43表達(dá)的變化及多西環(huán)素對(duì)C43表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1模型制作與分組選擇SPF級(jí)健康Wistar大鼠，雌雄不限，體重200 g～300 g，均購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。將大鼠分為模型組和假手術(shù)組，依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)資料制備相應(yīng)的心肌梗死大鼠模型，將大鼠固定后備皮，連接心電圖之后進(jìn)行觀(guān)察。模型組在大鼠左胸第三、四肋間切開(kāi)1 cm3小口，同時(shí)輕提左心耳，之后選擇5/0手術(shù)線(xiàn)結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，關(guān)閉胸口縫合處理，觀(guān)察心電圖，若看到相應(yīng)ST段顯著抬高可判斷結(jié)扎成功。假手術(shù)組只穿線(xiàn)，不結(jié)扎，手術(shù)1個(gè)月后檢測(cè)其血流動(dòng)力學(xué)。對(duì)部分模型組大鼠進(jìn)行多西環(huán)素組注射治療，而對(duì)其余心肌梗死組大鼠注入生理鹽水，持續(xù)時(shí)間為4周。

1.2取材配制10%水合氯醛溶液后對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，之后將其呈仰臥位姿勢(shì)固定之后進(jìn)行解剖處理。每組選取一定比例大鼠并直接取出心臟，進(jìn)行預(yù)冷處理并清洗后冷凍保存，測(cè)定其心肌和蛋白表達(dá)情況。對(duì)另一部分大鼠心臟進(jìn)行灌注固定處理，配制0.85%生理鹽水，通過(guò)針頭灌注，同時(shí)注入一定濃度肝素2 mL，短時(shí)間內(nèi)剪斷下腔靜脈使血液流出，等待一段時(shí)間后，灌注4%多聚甲醛300 mL。取出心臟放置一段時(shí)間后通過(guò)磷酸緩沖鹽溶液沖洗，之后進(jìn)行梯度酒精脫水并包埋處理，觀(guān)察Cx43蛋白表達(dá)情況。

1.3心肌Cx43 mRNA表達(dá)測(cè)定檢測(cè)3組Cx43 mRNA表達(dá)情況，采用熒光定量PCR方法測(cè)定，之后提取出總RNA，之后進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)體系包括組分較多，主要有10×PCR緩沖液、Taq聚合酶和cDNA組成。具體反應(yīng)步驟：在95 ℃環(huán)境下進(jìn)行1個(gè)PCR循環(huán)，持續(xù)時(shí)間為3 min；在類(lèi)似條件下進(jìn)行40個(gè)PCR循環(huán)。接著通過(guò)儀器定量PCR檢測(cè)。

1.4心肌Cx43蛋白表達(dá)檢測(cè)取出相應(yīng)心肌組織勻漿，進(jìn)行離心處理后取出上清，之后煮沸并電泳處理，并加入一定量的Cx43。洗膜之后進(jìn)行室溫振蕩孵育，顯色處理。通過(guò)灰度值比值確定相應(yīng)Cx43的蛋白水平。

1.5心肌Cx43免疫組織化學(xué)染色分析通過(guò)免疫組織化學(xué)SABC法確定心肌蛋白的定位表達(dá)，制定切片后進(jìn)行脫蠟、漂洗處理，孵育一段時(shí)間后滴加一抗孵育，將培養(yǎng)液放置在室溫環(huán)境下進(jìn)行PBS漂洗，加入生物素化二抗之后放在溫室環(huán)境下孵育，加入SABC，進(jìn)行相應(yīng)顯色、脫水處理。

2　結(jié)　果

2.13組大鼠心肌Cx43 mRNA表達(dá)比較3組大鼠心肌組織取材提取mRNA，進(jìn)行熒光定量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，心肌梗死組Cx43 mRNA表達(dá)與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；多西環(huán)素組治療后Cx43 mRNA表達(dá)提高，與心肌梗死組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表1、圖1。

表1　3組大鼠心肌Cx43 mRNA表達(dá)比較(±s)

注：與假手術(shù)組比較，**P<0.05。

圖1心肌Cx43 mRNA表達(dá)

2.23組大鼠心肌Cx43表達(dá)量比較多西環(huán)素組表達(dá)量高于心肌梗死組(P<0.05)；但多西環(huán)素組Cx43表達(dá)量低于假手術(shù)組(P<0.05)。詳見(jiàn)表2、圖2。

表2　3組大鼠心肌Cx43表達(dá)量比較(±s)

圖2心肌Cx43表達(dá)量圖譜

2.3心肌Cx43免疫組織化學(xué)染色分析免疫陽(yáng)性反應(yīng)呈棕褐色，多西環(huán)素組心肌Cx43蛋白表達(dá)量高于心肌梗死組(P<0.05)，但低于假手術(shù)組(P<0.05)。詳見(jiàn)圖3、表3。

圖3　心肌Cx43免疫組織化學(xué)染色分析圖

3　討　論

急性心肌梗死是一種常見(jiàn)的心臟疾病，導(dǎo)致心肌重構(gòu)，這種重構(gòu)和降解代謝失衡密切相關(guān)，且出現(xiàn)相應(yīng)的心肌細(xì)胞電生理變化；心肌梗死的持續(xù)改變主要表現(xiàn)為心室重塑，包括左心室體積增大、形態(tài)改變及梗死節(jié)段心肌變薄和非梗死節(jié)段心肌增厚，這種改變對(duì)心室的收縮效應(yīng)及電活動(dòng)均有影響。不斷肥大的心室和減慢的電傳導(dǎo)速率與電沖動(dòng)的異位起搏密切相關(guān)。

心臟縫隙連接蛋白是連接兩個(gè)相鄰細(xì)胞質(zhì)的聚體通道，縫隙連接蛋白是小于1 kDa特殊小分子物質(zhì)、代謝產(chǎn)物、離子的交換通道，是兩個(gè)相鄰心肌細(xì)胞的電偶聯(lián)通道。目前發(fā)現(xiàn)心肌表達(dá)量較高的3種縫隙連接蛋白亞型分別是Cx40、Cx45和Cx43。哺乳動(dòng)物Cx43是心室肌重要的縫隙連接蛋白；Cx43和心肌細(xì)胞之間的信息傳遞密切相關(guān)，且在保持心肌組織整體性和收縮性能方面有重要作用。破壞心肌細(xì)胞的聯(lián)系常引起相應(yīng)Cx43數(shù)量減少，在一定條件下易導(dǎo)致猝死；Cx43基因轉(zhuǎn)基因小鼠研究發(fā)現(xiàn)減少心室縫隙連接的偶聯(lián)易誘發(fā)室性心律失常；縫隙連接蛋白基因轉(zhuǎn)基因小鼠研究證據(jù)發(fā)現(xiàn)減少心室縫隙連接的偶聯(lián)易誘發(fā)室性心律失常。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，MMPs不僅在細(xì)胞基質(zhì)降解過(guò)程起重要作用，且影響膠原合成的調(diào)節(jié)過(guò)程，導(dǎo)致相應(yīng)的MMPs表達(dá)明顯變化。細(xì)胞外基質(zhì)的積累增多會(huì)使相應(yīng)的心肌細(xì)胞間距增加，引起相應(yīng)的心肌細(xì)胞失偶聯(lián)。MMPs在心肌細(xì)胞基質(zhì)合成過(guò)程起到一定作用，與之相關(guān)的Cx43蛋白明顯影響心肌細(xì)胞的電傳導(dǎo)過(guò)程。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，若氧含量不足導(dǎo)致乳鼠心肌細(xì)胞Cx43表達(dá)量下降，在此情況下出現(xiàn)相應(yīng)惡性心律失常，并導(dǎo)致Cx43表達(dá)下降[8-10]。

多西環(huán)素是一種常用的四環(huán)素類(lèi)抗生素，在絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路中對(duì)MMP抑制方面有重要作用，其與MMP活性中心結(jié)合并抑制后者的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，降低MMP表達(dá)水平，且抑制MMPs活性[11-13]。Cx43含量減少延長(zhǎng)心肌愈合時(shí)間并導(dǎo)致一定程度的心律失常；MMPs降解心肌細(xì)胞基質(zhì)并在一定條件下誘發(fā)心律失常；多西環(huán)素保護(hù)大鼠心肌梗死區(qū)域的縫隙連接蛋白影響左室重塑、提高心室功能，且降低梗死后對(duì)室性心律失常的易感性[14-16]。

本研究過(guò)程發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后心肌Cx43蛋白表達(dá)量顯著降低，多西環(huán)素治療后可提高Cx43表達(dá)，提示多西環(huán)素治療心肌梗死具有一定的療效。

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